的关键是半抗原的分子设计、合成和酶标抗原的制备。其中半抗原的设计、合成是影响蛋白同化激素免疫分析成败的关键。
[0026]诺龙结构中不具有合适的基团，因此要对诺龙的结构进行改造，在诺龙的羟基上引入羧基，形成可以与载体蛋白连接的臂。因此，本发明在设计合成诺龙人工半抗原时，采用诺龙与丁二酸酐反应，来引入活性侧链，合成诺龙半抗原，这样既保持了诺龙半抗原与诺龙、群勃龙、丙酸诺龙、雄诺龙和美雄诺龙等五种蛋白同化激素在结构上的相似性，又使半抗原分子具有了与载体蛋白连接的合适结构。
[0027]利用上述的诺龙人工半抗原与载体蛋白结合，制得人工抗原，免疫动物制备的抗体。使用protein A_sepharose4B亲和层析柱对含有抗蛋白同化激素类药物抗血清进行纯化。
[0028]所纯化的诺龙抗体与诺龙、群勃龙、丙酸诺龙、雄诺龙和美雄诺龙的特异性结合率以抑制抗体最大结合率的50%所需诺龙的浓度即IC5tl值来表示，几种蛋白同化激素类药物对本发明的抗体的IC5tl值分别为，诺龙0.050ng/mL、群勃龙0.094ng/mL、丙酸诺龙0.66ng/mL、雄诺龙1.40ng/mL和美雄诺龙2.40ng/mL。将上述的IC5tl值与国内外规定的蛋白同化激素类药物最大残留限量值比较，不难看出，上述五种磺胺药物的IC5tl值均远低于规定的最大残留限量值，说明本发明抗体用于化学发光免疫分析时，能够特异性地同时检测到五种蛋白同化激素药物的残留含量。
[0029]本发明还提供了一种使用如上所述的用于蛋白同化激素免疫分析的酶标抗原的分析方法，包括如下步骤，
[0030]I)包被，先用磷酸盐缓冲溶液稀释待包被的诺龙抗体，把稀释好的诺龙抗体稀释液加入酶标板的微孔中，每微孔添加80?120 μ L洗涤液PBST缓冲液，加完后把酶标板置于20?35°C条件下反应10?15h，弃去孔中液体，向酶标板中加入200?300 μ L洗涤液PBST缓冲液，在震荡器上震荡I?4min，弃去洗涤液，即为洗板I次，重复洗板2?5次；优选的，把稀释好的诺龙抗体稀释液加入酶标板的微孔中，每微孔添加100 μ L洗涤液PBST缓冲液；加完后把酶标板置于25°C条件下反应10?15h，弃去孔中液体，向酶标板中加入250 μ L的洗涤液PBST缓冲液，在震荡器上震荡I?4min ;弃去洗涤液，即为洗板I次，重复洗板2?5次，优选的，重复洗板3次；
[0031]2)封闭:向酶标板的每个微孔中加入150?250 μ L封闭液，加完后把酶标板置于20?35°C条件下，0.5?1.5h后取出酶标板弃去封闭液，重复洗板2?5次；优选的，向酶标板的每个微孔中加入200 μ L封闭液，加完后把酶标板置于37°C条件下，Ih后取出酶标板弃去封闭液，重复洗板4次；所述封闭液为含有质量浓度为0.5%脱脂奶粉的磷酸盐缓冲溶液；
[0032]3)竞争反应:向酶标板的每个微孔先加入50?150 μ L梯度稀释好的待测物样溶液或样品提取液，然后再向其中加入50?150 μ L稀释的酶标抗原溶液，酶标抗原是用磷酸盐缓冲溶液进行稀释，酶标板被置于20?35°C条件下孵育0.5?1.5h之后，重复洗板2?5次；优选的，向酶标板的每个微孔先加入50 μ L梯度稀释好的待测物样溶液或样品提取液，然后再向其中加入50 μ L稀释的酶标抗原溶液；酶标板被置于37°C条件下孵育Ih之后，重复洗板5次；
[0033]4)检测发光值:将上一步洗好的酶标板置于荧光化学发光分析仪中，设定好相应程序，仪器自动向酶标板的每个微孔中加入50?150 μ L化学发光底物，10?40s后仪器立即测定每个微孔的发光强度值；优选的，向酶标板的每个微孔中加入100 μ L化学发光底物，30s后仪器立即测定每个微孔的发光强度值。
[0034]优选的，步骤I)中，所述诺龙抗体是经过纯化处理的，纯化处理步骤如下所述，
[0035]I)平衡柱子:用pH6?9的磷酸盐缓冲液冲洗管路，流速5?8mL/min，I?3min，装柱后再用PH6?9的磷酸盐缓冲液平衡柱子，流速0.5?2mL/min，直至基线水平；优选的，用PH7.4的磷酸盐缓冲液冲洗管路，流速6.5mL/min，2min，装柱后再用pH7.4的磷酸盐缓冲液平衡柱子，流速lmL/min，直至基线水平；
[0036]2)上样:待基线水平后，将三聚氰胺抗血清用等体积pH6?9的磷酸盐缓冲液稀释后上样，优选的，PH 7.4;
[0037]3)上柱，流速为0.2?0.8mL/min,上样结束后，用pH6?9的磷酸盐缓冲液冲柱子，流速0.5?2.0mL/min，诺龙抗体被特异性吸附在填料位点上，其他杂蛋白随缓冲液流出，直至基线水平；优选的，流速为0.5mL/min，上样结束后，用pH7.4的磷酸盐缓冲液冲柱子，流速lmL/min，直至基线水平；
[0038]4)洗脱:用pH 1.5?3.5的洗脱缓冲液洗脱柱子上结合的抗体，洗出目的蛋白，流速为0.2?1.5mL/min ;优选的，用pH2.7的洗脱缓冲液洗脱柱子上结合的抗体，洗出目的蛋白，流速为0.5mL/min ；
[0039]5)测定:在200?350nm紫外下检测洗脱液蛋白浓度；当吸光度大于0.1?0.3时，收集洗脱液，收集完毕后迅速用0.5?2.0moI/L Tris调pH至6.0?9.0 ;优选的，在280nm紫外下检测洗脱液蛋白浓度，当吸光度大于0.2时，收集洗脱液，收集完毕后迅速用lmol/L Tris调pH至7.0 ;所述Tris为三轻甲基氨基甲烧；
[0040]6)抗体的透析与保存:用pH 6?9抗体透析液透析所得抗体，2?6°C透析2?4天，每天换2?4次透析，透析后取出，加入0.05?0.2% (W/V)的NaN3, 3?5°C储存备用；优选的，用PH7.4抗体透析液透析所得抗体，4°C透析3天，每天换3次透析；透析后取出，加入0.1% (W/V)的NaN3;4°C储存备用；所述抗体透析液为磷酸盐缓冲液。
[0041]优选的，步骤4)中，所述化学放光底物是将鲁米诺钠、增强剂吩噻嗪-10-基-丙基磺酸钠盐和4-吗啉吡啶溶入Tris-HCl，在进行检测发光强度值之前，取出一部分和H2O2对应比例混合，即可用于实验；发光底物的储存温度为4°C。
[0042]如上所述的分析方法，其灵敏度(IC5tl)和检测限(IC15)分别为:诺龙IC5tl =0.050 μ g/L，IC15= 0.00378 μ g/L、群勃龙 IC 50= 0.094 μ g/L，IC 15= 0.00330 μ g/L、丙酸诺龙 IC50= 0.66 μ g/L, IC 15= 0.259 μ g/L、雄诺龙 IC 50= 1.40 μ g/L, IC 15= 0.0398 μ g/L、美雄诺龙 IC50= 2.40 μ g/L, IC 15= 0.078 μ g/L。
[0043]本发明对化学发光免疫方法测定进行了技术改进，其测定包括:诺龙抗体纯化；标准抗体包被量；进行化学发光免疫反应；用荧光化学发光分析仪对一定波长的波的吸收参数；作出蛋白同化激素标准品与荧光化学发光分析仪检查参数图；将样品的荧光化学发光分析仪检测参数与标准品的荧光化学发光分析仪检测参数图比较而获得样品中诺龙、群勃龙、丙酸诺龙、雄诺龙、美雄诺龙的总量。
[0044]相对于现有技术，本发明所述的一种用于蛋白同化激素免疫分析的酶标抗原及分析方法，具有以下优势:
[0045](I)本发明所述的分析方法针对多种蛋白同化激素药物具有良好的特异性和广谱性，与传统酶联免疫吸附分析方法相比，灵敏度提高了 5?8倍。
[0046](2)本发明所述的人工半抗原合成方法不仅简便，且所用主要原料丁二酸酐价格较为低廉、容易获得，在一般化学试剂公司都可