一种通过微生物转化来制备4-雄烯二酮的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种通过微生物转化来制备4-雄烯二酮的方法，尤其涉及4-雄烯二 酮制备过程中的串罐发酵技术，即在利用分支杆菌选择性降解植物留醇制备4-雄烯二酮 的过程中通过串罐发酵技术用微生物三个生长阶段持续降解植物留醇高产4-雄烯二酮的 发酵工艺，属于发酵技术领域。
【背景技术】
[0002] 4_雄烯二酮(化学名称：雄留_4_烯_3,17-二酮，英文名4-Androstenedione，简 称AD)，该产品外观形状呈近白色晶体粉末，无异味，无毒性，不溶于水，是一种当今世界上 用途极广，科技含量高的生物化工中间体。
[0003] 雄烯二酮是生产激素类原料药的重要中间体，可以说几乎所有留体激素药物都可 以以雄烯二酮为起始原料进行生产，如用于生产皮质激素、性激素、孕激素及蛋白同化激 素，又可用于合成可的松、强的松、黄体酮、雌烯醇、地塞米松等100余种药物，也是用于生 产抗早孕米非司酮和各类计划生育用药必不可少的原料。
[0004] 发酵法生产4-雄烯二酮是1998年在美国一家制药公司开始，它以原料来源广、原 料成本低、反应专一性强、反应条件温和、生产步骤简化和生产周期短等优点逐渐取代了传 统的化学合成法，在国内外受到了普遍的重视。
[0005] 在微生物转化法生产4-雄烯二酮的过程中，4-雄烯二酮的产品收率通过提取、精 制技术的一系列改进进一步提升的空间非常有限，所以目前降低4-雄烯二酮生产成本的 潜力在发酵技术的改进方面。如何最大限度地提高微生物对植物留醇的转化率是每个生产 企业研究的重点。目前，微生物转化法生产4-雄烯二酮都采用单纯的间歇式分批培养发 酵，种子培养需要采用逐级扩大培养的方法，即从斜面到种子罐，经过一级和二级种子罐逐 级扩大培养后，转入发酵罐。种子液进入发酵罐后还要经过对环境的适应期、自身对数生 长期最后再进入次级代谢期产生目的产物。这种逐级培养方式使得种子液在发酵罐内较长 时间只是进行了自身初级代谢，一般在35~45h才开始进行合成目的产物的次级代谢，并且 4_雄烯二酮转化菌种还没有对植物留醇转化完就会进入菌体代谢衰退期，这样就会延长发 酵罐培养周期，增加动力成本，对植物留醇的转化率一般只能维持在459Γ65%，造成生产的 不稳定。
【发明内容】
[0006] 本发明所解决的技术问题是打破微生物生长代谢三阶段的规律，确保了 4-雄烯 二酮的制备时间出现在微生物生长代谢的适应期，缩短了整个发酵周期。
[0007] 微生物转化法是指某种微生物对有机物某一特定部位或基团作用使它转变成结 构上相似的另一种化合物的过程。微生物转化与一般的氨基酸和抗生素发酵不同，转化产 物不是微生物的代谢产物，而是利用微生物所产生的酶对底物的某一部位进行特定的生物 化学反应来获得的特定产物。留体类物质一般不是微生物代谢途径中起生理作用的物质， 因此，留体类物质不像其他营养物质一样，会被微生物最终分解为二氧化碳和水。
[0008] 微生物转化植物留醇的过程可用以下通式表示： 进入 分泌 底物一一一一一一菌体细胞一一一一一一反应产物(胞内或胞外） 4_雄烯二酮的发酵转化过程通常分两个阶段进行，第一阶段是菌体的自身生长阶段， 该时期供给菌体丰富的营养，在最适温度、PH和通气条件下进行培养，以得到足够的菌体和 大量高活性的转化酶；第二阶段是对植物留醇进行定向转化的阶段。研究证明这两个阶段 有一个共同特点：菌体的最适自身生长阶段的pH范围与菌体对植物甾醇转化的最适pH范 围基本相同，这也是本发明取得成功的关键所在。
[0009] 串罐发酵即每个发酵罐的种子液全部来自前一个发酵罐的发酵液。一般取生长旺 盛，刚进入转化期的发酵液。时间：取发酵液培养至20-30小时发酵液作为种子最佳，判断 标准为发酵液的PH降至6. 8左右，发酵单位小于0. 5g/l，镜检无杂菌。这样每一个发酵罐 的种子液来自发酵罐中刚进入转化期的种子液，依次类推，进行串罐发酵培养。
[0010] 本发明中一种通过微生物转化来制备4-雄烯二酮的方法，即4-雄烯二酮制备过 程中的串罐发酵工艺，其包括以下步骤： 1)种子制备阶段 其中，所采用的菌株为耻垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatis) :X --级种子罐培养基的配方为：葡萄糖：〇. 2~0. 5%、硝酸铵：0. 2~0. 5%、硫酸镁： 0. Of 0. 05%、磷酸氢二钾0. Of 0. 05%、酵母浸粉：1. (Γ2. 2%，加水定容后调pH至7. 0。
[0011] 一级种子罐培养控制参数：接种量：8~10%，罐温：28~30 °C，通气比： 1:0. 2?I. Ovvm，罐压：0· 03?0· 05Mpa，转速：20(T300rpm，周期：30?48 小时。
[0012] 2二级种子罐培养基配方为：葡萄糖：0. 2、. 5%、硝酸铵：0. 2、. 5%、硫酸镁： 0. Of 0. 05%、磷酸氢二钾0. Of 0. 05%、酵母浸粉：1. (Γ2. 2%，加水定容后调pH至7. 0。
[0013] 二级种子罐的控制参数为：接种量：1(Γ15%，罐温：28~30 °C，通气比： 1:0. 2?I. Ovvm，罐压：0· 03?0· 05Mpa，转速：20(T300rpm，周期：20?30 小时。
[0014] 2)发酵半串罐培养 发酵罐培养基配方为：葡萄糖：1. (Γ5. 〇%、酵母浸粉：〇. 5~2. 5%、硝酸铵：0. 15~0. 55%、 硫酸镁：〇· 02?0· 2%、磷酸氢二钾：0· 1?L 0%、硫酸亚铁：0· 001?0· 01%、碳酸钙：0· 1?0· 5%、植 物甾醇：1 ?4%、乳化剂：0· 001 ?05 (v/v) %、消泡剂：0· 03% (v/v)。
[0015] 发酵罐的控制参数为：接种量：8?10%，罐温：28?30°C，通气比：1:0.2?1.(^_，罐 压：0· 03?0· 05Mpa，转速：15(T260rpm，用10%浓度氨水溶液控制pH在6. 6?7. 0,用20%浓度 的硝酸铵溶液控制发酵液中氨氮含量为50-70mg/100ml。取发酵液培养至20-30小时小部 分发酵液作为种子最佳，判断标准为发酵液的PH降至6. 8左右，发酵单位小于0. 5g/l，镜检 无杂菌。每一个发酵罐的种子液来自上一个发酵罐中刚进入转化期的种子液，依次类推，进 行串罐发酵培养。发酵罐培养周期为88~108h。
[0016] 取种时间的选择：按照传统的间歇式发酵理论，随着种子液在发酵罐培养时间的 延长，种子首先进入对环境适应期，再进入对数生长期，培养周期大约在20-30小时时菌体 量和转化酶活性基本上达到最大，因此取发酵培养20-30小时发酵液作为部分种子最佳。 判断标准：发酵液的PH降至6. 8左右，发酵单位小于0. 5g/l，镜检无杂菌。
[0017] 3 )发酵液有效成分HPLC检测 色谱条件：色谱柱：Kromasil C18 5Mm 200X4. 6mm，流动相：CH30H:H20 = 80 :20 (v/v)，流速：1. 〇ml/min，检测波长：242nm。
[0018] 标准曲线的测定： 配制一系列不同浓度的AD标准溶液（50-500μ8/πι1)，分别取各浓度标准溶液的过滤液 2〇μ1注入高效液相色谱仪中，测定其吸收峰面积，然后对浓度（Y)和吸收峰面积（X)进行一 元线性回归，得到一元线性回归方程。
[0019] 效价计算方法： 将待测样品制成合适浓度（50-50(^g/ml)的甲醇溶液，用0.45Mm的微孔滤膜过滤，准 确吸取滤液2〇μ1注入HPLC中，记录色谱图，将AD峰面积代入上述的回归方程中，计算得到 样品中AD量。
[0020] 4)植物留醇转化率的计算 发酵完成后，发酵液经甲醇处理后，再用液相色谱定量测出雄烯二酮的含量，然后计算 植物留醇的转化率：转化率/%=发酵液中AD含量*100/ (投料油中留醇含量*0. 66*0. 95)。
[0021] 本发明的优点： 1、 通过本方法使得分支杆菌对植物留醇的转化率与完全用逐级扩大培养成熟的种子 液作为发酵罐的种子相比其转化率提高20%以上；与完全用前一个发酵罐的发酵液作为下 一个发酵罐的种子相比其转化率提高15%以上； 2、 该发酵工艺为单相水工艺，通过选用合适的乳化剂很好地解决了留醇在水中溶解度 差的问题，为后续提取解决了一系列难题，使得4-雄烯二酮的质量更加稳定。
[0022] 3、运用该工艺消除了由于种子质量波动引起的发酵产量的波动，稳定了发酵生 产； 4、运用该工艺使得发酵周期由原来的160?170小时缩短为现在的80?108小时，缩 短了罐批运转周期，增加进罐批次，提高了设备利用率，降低了生产成本，可获得更大的经 济效益。
【具体实施方式】
[0023] 下面通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案，同时增加对照试验，但是本 发明不以具体实施例为限。
[0024] 1、制备材料与方法 1. 1材料 1. 1. 1菌种 菌种来源：DY20120806-102 (山东东药药业股份有限公司） I. 1. 2仪器与分析条件 HPLC :安捷伦-1260,色谱条件：色谱柱---Kromasil C18 5Mm 200 X 4. 6mm 流动相 CH3OH = H2O = 80 :20 (v/v)，流速---1. Oml/min，检测波长---242nm。试 齐IJ :雄留-4-烯-3, 17-二酮（AD)标准品和甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。含量用外标 峰面积法计算。
[0025] 1. 2对照试验一(传统的间歇式发酵） I. 2. 1培养基及培养工艺 1.2. 1.1种子制备阶段 2 -级种子罐培养基的配方为：葡萄糖：〇. 2、. 5%、硝酸铵：0. 2、. 5%、硫酸镁： 0. Of 0. 05%、磷酸氢二钾0. Of 0. 05%、酵母浸粉：1. (Γ2. 2%，加水定容后调pH至7. 0。
[0026] 一级种子罐培养控制参数：接种量：8~10%，罐温：28~30 °C，通气比： 1:0. 2?I. Ovvm，罐压：0· 03?0· 05Mpa，转速：20(T300rpm，周期：30?48 小时。
[0027] :S.二级种子罐培养基配方为：葡萄糖：2、. 5%、硝酸铵：0. 2、. 5%、硫酸镁： 0. Of 0. 05