检测盐酸克仑特罗残留的荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品安全中兽药检测领域，具体涉及一种检测样品中盐酸克仑特罗残 留的荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和应用。 技术背景
[0002] 克仑特罗（Clebuterol)是一种属于苯胺类的受体激动剂，主要以盐酸盐形式 存在，具有重新分配机体营养、抑制脂肪沉积、提高蛋白质含量、增加酮体瘦肉率、改善肉质 以及促进动物生长的作用。因此，近年来在经济利益的驱使下，大量克仑特罗被滥用于畜牧 业和养殖业。人体摄入CL的量过大时，会导致一系列不良反应，主要有肌肉震颤、心跳和呼 吸加快等，严重的会危害生命。鉴于此，许多国家已经禁止将克仑特罗作为饲料及饲料添加 剂使用，我国农业部也于2002年明确将其列入《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品 种目录》。
[0003] 目前，检测盐酸克仑特罗比较经典的方法有高效液相色谱-质谱联用法 (HPLC-MS)、气相色谱-质谱联用法（GC-MS)、高效液相色谱法（HPLC)，这些都是比较传统的 方法，也是目前的确证方法。另外，目前常用的还有酶联免疫法（ELISA)。但由于以上方法 均需先进检测仪器、检测费用昂贵、步骤繁琐、耗时，且对操作人员专业性要求较高，不适用 于基层企事业单位的大通量快速筛查检测。胶体金免疫层析法具有检测速度快、价格便宜、 操作简单等优点，是目前国内外检测盐酸克仑特罗的主要监控方法，但仍存在一些缺陷，如 稳定性较差、灵敏度较低、无法实现定量检测、基质效应明显背景干扰大，且颜色单一，难以 实现多检和联检。
[0004] 荧光微球免疫层析技术是继胶体金免疫层析技术后，在荧光染料标记技术上发展 起来的，作为一种免疫学检测方法，它是免疫亲和技术、免疫标记技术、免疫层析技术的结 合，与胶体金免疫层析技术一样具有快速、操作简便等优点。但是相比胶体金等传统标记 物，荧光微球的发光强度可以随激发光的强度增强而增强，所以荧光微球标记有望提高免 疫层析技术的检测限；而在微球壳结构的作用下，荧光微球具有相对稳定的形态结构，粒度 均一、单分散性好、稳定性好、发光效率高、重复性好，有较好的生物相容性；且形成微球后 染料荧光猝灭大大减少，发射强而稳定，且基本不受外界环境介质变化的影响。因此相比上 述检测方法，荧光微球免疫层析技术同时具有检测灵敏度高、操作简便、稳定性好的优点。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种灵敏度高、操作简便、检 测快速、价格低廉的检测盐酸克仑特罗残留的荧光微球免疫层析试纸条；本发明的另一个 目的是提供上述试纸条的制备方法；本发明的再一个目的是提供上述试纸条在检测盐酸克 仑特罗中的应用。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采取的一个技术方案是：
[0007] 提供一种检测盐酸克仑特罗残留的荧光微球免疫层析试纸条，它包括底板及在底 板上依次搭接粘贴的样品结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品结合垫上包埋有荧光 微球标记的抗盐酸克仑特罗单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，检 测区喷涂有盐酸克仑特罗半抗原-载体蛋白偶联物，质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体。
[0008] 所述盐酸克仑特罗半抗原-载体蛋白偶联物由盐酸克仑特罗半抗原与载体蛋白 偶联得到，所述盐酸克仑特罗半抗原是由盐酸克仑特罗经氯铬酸吡啶氧化后，再与丙二胺 反应得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋 白。
[0009] 所述突光微球是直径为100~300nm的用聚苯乙烯包裹突光物质的微球，其表面 连接有一C00H基团，所述荧光物质为异硫氰酸荧光素。
[0010] 本发明采取的另一个技术方案是提供一种制备上述检测盐酸克仑特罗残留的荧 光微球免疫层析试纸条的方法，它包括如下步骤：
[0011] 1)样品结合垫的制备：用市售的荧光微球标记抗盐酸克仑特罗单克隆抗体，并将 其以特定缓冲体系稀释后，将样品结合垫浸泡于稀释缓冲液中，经真空冷冻干燥后制备；
[0012] 2)硝酸纤维素膜的制备：将盐酸克仑特罗半抗原-载体蛋白偶联物喷涂到硝酸纤 维素膜上的检测区范围，制成检测区；将羊抗鼠抗抗体喷涂到硝酸纤维素膜上的质控区范 围，制成质控区；
[0013] 3)组装和剪切：在底板上依次搭接地粘贴包埋有荧光微球标记抗盐酸克仑特罗单 克隆抗体的样品结合垫、固定有检测区和质控区的硝酸纤维素膜及吸水垫，并剪切成所需 的宽度即为荧光微球免疫层析试纸条。
[0014] 具体地说，步骤包括：
[0015] 1)将盐酸克仑特罗经氯铬酸吡啶氧化后，再与丙二胺反应，制备盐酸克仑特罗半 抗原；
[0016] 2)将盐酸克仑特罗半抗原与载体蛋白偶联，制备盐酸克仑特罗半抗原-载体蛋白 偶联物；
[0017] 3)用盐酸克仑特罗半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓 瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌盐酸克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
[0018] 4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；
[0019] 5)分别将盐酸克仑特罗半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体喷涂到硝酸纤 维素膜的检测区范围（T)和质控区范围（C);
[0020] 6)将样品结合垫用含牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在缓冲体系中的终浓度为0. 5% 体积百分含量)、pH7. 2、0.lmol/L的磷酸盐缓冲液均匀浸泡2h，37°C下烘干2h;
[0021] 7)用市售的荧光微球标记抗盐酸克仑特罗单克隆抗体，并将其以特定缓冲体系稀 释后，将6)处理过的样品结合垫浸泡于稀释缓冲液中，经真空冷冻干燥后备用；
[0022] 8)在底板上依次搭接地粘贴包埋有荧光微球标记抗盐酸克仑特罗单克隆抗体的 样品结合垫、固定有检测区和质控区的硝酸纤维素膜及吸水垫，并剪切成所需的宽度即为 荧光微球免疫层析试纸条。
[0023] 本发明采取的另一个技术方案是提供一种上述检测盐酸克仑特罗残留的荧光微 球免疫层析试纸条在检测盐酸克仑特罗中的应用，它包括如下步骤：
[0024] 1)样品前处理；
[0025] 2)用所述的检测盐酸克仑特罗残留的荧光微球免疫层析试纸条进行检测；
[0026] 3)用荧光检测仪分析检测结果。
[0027] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0028] (1)特异性强、灵敏度高：本试纸条采用将荧光微球标记的抗盐酸克仑特罗单克隆 抗体包埋在样品结合垫上，具有亲水性佳、可大容量吸附抗体偶联物、迅速重湿润、抗体结 合物释放充分、性能好、释放快、形态好等优势，从而减少误差，降低成本，增加整个体系的 反应灵敏度；
[0029] (2)荧光微球表面包裹了聚苯乙烯，实现了对荧光物质异硫氰酸荧光素的保护，减 少了外界环境的干扰，增加了突光微球的稳定性及突光寿命；
[0030] (3)荧光微球表面修饰活性基团一C00H，采用化学偶联的方法来标记抗体，形成抗 体与微球的稳定结合。
【附图说明】
[0031] 图1为荧光微球免疫层析试纸条剖面结构示意图；
[0032] 图2为荧光微球免疫层析试纸条俯视图；
[0033] 图3为盐酸克仑特罗半抗原合成路线图；
[0034] 图4为盐酸克仑特罗半抗原核磁共振氢谱图。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0036]实施例1检测盐酸克仑特罗残留的荧光微球免疫层析试纸条的构成
[0037] 一、试纸条（图1、图2)
[0038] 所述试纸条是由底板、样品结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成；
[0039] 所述样品结合垫1、硝酸纤维素膜2和吸水垫3依次按顺序搭接粘贴在底板6上， 样品结合垫的末端与硝酸纤维素膜的始端相连，硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相 连，样品结合垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；
[0040] 所述硝酸纤维素膜上固定有检测区4和质控区5,检测区喷涂有盐酸克仑特罗半 抗原-载体蛋白偶联物(盐酸克仑特罗半抗原-卵清蛋白偶联物)，质控区喷涂有羊抗鼠抗 抗体；
[0041] 所述底板为PVC底板；所述样品结合垫为玻璃棉；所述吸水垫为吸水纸。
[0042] 实施例2检测盐酸克仑特罗残留的荧光微球免疫层析试纸条的制备
[0043] 检测盐酸克仑特罗残留的荧光微球免疫层析试纸条的制备方法主要包括以下步 骤：
[0044] 1)样品结合垫的制备：用市售的荧光微球标记抗盐酸克仑特罗单克隆抗体，并将 其以特定缓冲体系稀释后，将样品结合垫浸泡于稀释缓冲液中，经真空冷冻干燥后制备；
[0045] 2)硝酸纤维素膜的制备：将盐酸克仑特罗半抗原-载体蛋白偶联物喷涂到硝酸纤 维素膜上的检测区范围，制成检测区；将羊抗鼠抗抗体喷涂到硝酸纤维素膜上的质控区范 围，制成质控区；
[0046] 3)组装和剪切：在底板上依次搭接地粘贴包埋有荧光微球标记抗盐酸克仑特罗单 克隆抗体的样品结合垫、固定有检测区和质控区的硝酸纤维素膜及吸水垫，并剪切成所需 的宽度即为荧光微球免疫层析试纸条。
[0047] 下面分步详细叙述：
[0048] (一）各部件的制备
[0049] 1、盐酸克仑特罗半抗原-载体蛋白偶联物的合成与鉴定
[0050] 盐酸克仑特罗是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生 免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。
[0051] (1)盐酸克仑特罗半抗原的制备（图3)
[0052] 步骤一：取1.4g盐酸克仑特罗，溶入25mL二甲基甲酰胺（DMF冲，0°C下分3次加 入1. 8g氯铬酸吡啶（PCC)，逐步升温到室温，继续反应3h后，除去大部分溶剂，乙酸乙酯萃 取，洗涤，干燥，除去溶剂后柱层析纯化，得到白色固体，为盐酸克仑特罗氧化物；
[0053] 步骤二：取l.Og步骤一所得的盐酸克仑特罗氧化物，溶入20mLDMF中，加入lmL 丙二胺，60°C反应10h，除去溶剂，乙醇-水中重结晶，得到白色固体，为盐酸克仑特罗的丙 二胺单缩合物，即为盐酸克仑特罗半抗原。
[0054] 取上述产物经核磁共振氢谱测定，如图4所示，1. 8~3. 7ppm之间增加的3组丙二 胺片段亚甲基信号峰，说明半抗原合成成功。
[0055] (2)免疫原的制备
[0056] 取牛血清白蛋白（BSA)50mg用4mL水溶解；取碳化二亚胺（EDC)和N-羟基琥珀酰 亚胺（NHS)各50mg用2mL水溶解完全后加入蛋白溶液中，室温搅拌反应30min，即可得到 反应液A;取半抗原15mg用2mLDMF溶解后，缓慢加入到反应液A中，室温搅拌反应24h; 用0. 02mol/L的PBS透析3d，每天更换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装， 于-20°C保存备用。
[0057] (3)包被原的制备
[0058] 制备方法同免疫原的制备，将BSA替换为卵清蛋白（0VA)即得包被原。
[0059] (4)盐酸克仑特罗半抗原-载体蛋白偶联物的鉴