[003引本发明中使用的仪器为化址erAvance 400MHz核磁共振波谱仪及宽带固体CP/ MS探头；内标物为六甲苯（阿达玛斯试剂有限公司）；S类新药GPC(上海恩力检测技术有 限公司提供）。
[0034] 连施例1
[0035] 2. 1实验条件
[0036] 设定"C观察频率为100. 62MHz，谱宽为38265. 30甜Z，"C 90。脉冲宽度为 3. 30 y S，质子去禪脉冲宽度为100 y S，采样时间为0. 0134s，弛豫延迟时间为25s，转速为 5000Hz，采样次数为1428次，"C化学位移W甘氨酸幾基碳信号（相对于TMS 5为176. 03) 为标准设定。
[0037] 2. 2供试品样品制备
[003引精确称取研磨后的GPC药物及六甲苯粉末各适量，将样品过800 ym筛。样品不能 通过筛子部分，再用螺旋式磨粉机研磨，直至全部通过800 y m筛。充分混匀样品。
[0039] 2. 3内标及定量峰的选择
[0040] 采用NMR进行定量时应首先对待测物及内标物的各个碳峰进行归属，与有机化合 物核磁共振碳谱数据库中相应的核磁共振碳谱进行比对确认，并明确每个碳峰所对应的原 子个数。内标纯度不低于99. 7%，至少含有一个甲基，并在"CNMR谱图中表现为尖锐单峰； 吸收峰与所测的样品峰之间应避免干扰。本发明选取六甲基苯为内标，样品的甲基峰与内 标的甲基峰完全分离，表明两者未发生化学反应及产生缔合，因此，本发明选用样品的甲基 峰（5 54. 39)与内标的甲基峰（5 16. 96)来进行定量计算。影响NMR定量测定准确性的关 键在于对选定"C峰的准确积分。为保证积分的准确性，待测物中甘油磯酸胆碱的甲基与 内标物的甲基的摩尔比控制在1 ;1，使样品峰和内标峰面积相差不大，W减少测定误差。本 发明中，待测药品与内标物六甲基苯的质量比为7.31:1。测试结果如图1所示，5 54.39、 5 16. 96分别为GPC及六甲基苯的甲基的峰，峰面积分别为0. 72及1. 00。
[0041] 2. 4记录光谱
[0042] 调整好核磁共振波谱仪至最佳状态，W得到合适的光谱。建议弛豫时间至少为 15s。对于傅立叶变换核磁共振波谱仪，将FID(自由感应衰减）变换成光谱，并在相位调整、 基线校正及化学位移定标后开始子程序的积分。记录GPC和内标物六甲基苯的甲基团的峰 面积。
[0043] 2. 5结果计算
[0044] 待测药物中GPC含量WeW干药物粉末计，数值用％表示，按式（1)计算：
[0045]
【主权项】
1. 一种检测甘油磷酸胆碱药物中甘油磷酸胆碱含量的方法，其特征在于， 步骤一、选择内标物； 步骤二、对待测物及内标物的各个13C峰进行归属，与有机化合物核磁共振碳谱数据库 中相应的核磁共振碳谱进行比对确认，并明确每个13C峰所对应的原子个数； 步骤三、准确称取待测物及内标物，为保证积分的准确性，待测物中甘油磷酸胆碱的甲 基与内标物的甲基的摩尔比控制在1 :1，以保证待测物的甲基峰和内标的甲基峰面积相差 不大，减少测定误差；研磨混匀后，进行固体13C NMR检测； 步骤四、记录试样的固体13C NMR谱，并在傅立叶变换、相位调整、基线校正及化学位移 定标后积分，记录甘油磷酸胆碱甲基基团的峰面积Ae和内标物六甲基苯的甲基基团的峰面 积Ah。对每一信号进行不少于5次积分，取平均值或去掉极值后取平均值进行后面的计算， 以提尚积分的准确性和重现性； 步骤五、利用所记录的13C NMR谱，计算甘油磷酸胆碱的含量，公式为： 式（1)中：
werc-待测药品中GPC的质量分数； we-试样中GPC药品的质量分数； Wh-试样中内标物六甲基苯的质量分数； Ae - GPC的甲基基团峰面积； Ah-六甲基苯的甲基基团峰面积； 6-六甲基苯中甲基基团数； 3-GPC中甲基基团数； Mc - GPC 的摩尔质量，Me= 257. 5g/mol ; Mh一六甲基苯的摩尔质量，Mh= 162. 2g/mol ; 实验结果精确至〇· 1% (按质量分数计）； 所述内标物的选择标准为：纯度不低于99. 7%，至少含有1个甲基；内标物的甲基基团 在13C NMR谱图中表现为尖锐的单峰，与所测样品的谱峰之间不产生干扰。
2. 如权利要求书1所述的检测甘油磷酸胆碱药物中甘油磷酸胆碱含量的方法， 其特征在于，所述固体13C NMR检测实验条件如下：13C观察频率为100. 62MHz，谱宽为 38265. 305Hz，13C 90°脉冲宽度为3.30 μ s，质子去耦脉冲宽度为100 μ s，采样时间为 0. 0134s，弛豫延迟时间为25s，转速为5000Hz，采样次数为1428次，13C化学位移以甘氨酸 羰基碳信号相对于TMS δ为176. 03为标准设定。
3. 如权利要求书1所述的检测甘油磷酸胆碱中甘油磷酸胆碱含量的方法，其特征在 于，进行固体13C NMR检测前，将样品过800 μ m筛后备用。
4. 如权利要求书1所述的检测甘油磷酸胆碱中甘油磷酸胆碱含量的方法，其特征在 于，所述内标物可以为六甲基苯、3_(三甲基硅基）-1_丙磺酸钠盐或丙氨酸。
5. 如权利要求书3所述的检测甘油磷酸胆碱中甘油磷酸胆碱含量的方法，其特征在 于，对于过筛后样品中不能通过筛子的部分先进行研磨后，再次过筛。
【专利摘要】本发明公开了一种利用固体核磁共振内标法测定三类新药甘油磷酸胆碱(GPC)中GPC含量的方法。主要步骤如下：在试样中添加内标六甲基苯，采用Bruker Avance III 400MHz核磁共振波谱仪及宽带固体CP/MAS探头，采集样品的13C NMR谱图，进行谱峰归属，通过GPC、六甲基苯所含的甲基基团的13C峰面积进行计算GPC的含量。本发明对GPC的结构鉴定和定量分析同步完成，解决了我国三类新药GPC基准物质含量测定的技术问题，对于三类新药GPC开发及维护消费者利益，促进我国GPC药业健康发展，具有十分重要的意义，也可为后续研究核磁定量分析其他药物提供参考。
【IPC分类】G01N1-28, G01N24-08
【公开号】CN104880478
【申请号】CN201510249736
【发明人】代博娜, 吴节莉
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年5月15日