一种生物样本中peg含量的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种生物样本中PEG含量的测定方法。 一种基于高效液相色谱-飞行时间质谱（LC-Q-Q-T0F)联用技术测定样本中不同聚合度PEG 含量的方法。
【背景技术】
[0002] 聚乙二醇（PEG)是一种pH中性，无毒，且具有独特理化性质和良好生物相容性的 亲水高分子聚合物，也是经FDA批准的极少数可以体内注射的合成聚合物之一。当PEG偶 联到蛋白质、多肽、小分子有机药物或纳米颗粒外壳上时，可以降低药物制剂的免疫清除以 及肾脏的快速消除，延长药物的体内循环时间，减小药物的毒性。作为新型的药用辅料，PEG 的质量控制以及在体内的吸收、分布与排泄过程对于PEG化药物的设计与评价具有十分重 要的意义。
[0003] 目前对于PEG的分析常采用放射性标记法、比色法、Western Blot和高效液相色 谱法（HPLC)，但这些方法均存在明显的不足。例如，放射性标记法用于标记PEG时成本太 高，且目前尚未建立成熟的方法学检验标记效率，也没有对比试验说明标记后的PEG在体 内的动力学行为是否发生了变化；比色法和Western Blot法都不能得到精确的定量结果， 且后者是通过测定与PEG结合的抗体量来间接对PEG进行定量。鉴于抗体的选择性差，可 能和样本中存在的内源性干扰物质结合，故不适合血浆或组织等复杂生物样本中PEG的定 量分析；HPLC法采用折射率检测器，分析时间长，且定量下限仅为50 mg/mL，不足以分析生 物体内痕量的PEG水平。
[0004] 近年来，迅速发展的液相色谱-串联质谱联用技术（LC-MS/MS)凭借其在定量分析 方面的出色表现，为药物的药代动力学研宄提供了良好的解决方案。LC-MS/MS定量的流程 是：色谱分离、离子化、质荷比（m/z)扫描、选择特定m/z进行定量。在众多扫描方式中，三 重四级杆质量分析器的多重反应监测模式(MRM)选择性好，灵敏度高，已经成为LC-MS/MS 分析中最常用的定量方式。这种模式的定量思路是：离子化、第一个四级杆（Q1):选择一个 特定的离子作为母离子，并只允许这一种离子通过、第二个四级杆（Q2):母离子被碰撞能量 打成碎片、第三个四级杆（Q3):从产生的碎片中选择一个响应高且稳定的碎片作为子离子、 测定选择的母子离子对的含量。所以这种模式必须在知道待测化合物母离子和子离子的准 确m/z的前提下才能进行。
[0005] 而PEG是由一系列以乙二醇为基本单元组成的高分子混合物，其分子量不是唯一 的值，而是以某个聚合度的分子量平均值为中心呈正态分布，如：PEG 4000其实是以分子 量4000的PEG分子为中心呈正态分布的多种分子量PEG分子的混合物；PEG600、PEG 6000、 PEG 10000也是如此，均为多种分子量PEG分子的混合物；因此这给以待测化合物目标分子 量为基础的LC-MS/MS定量分析带来了极大的挑战。
[0006] 对于PEG的质谱定量分析，通常采用电喷雾离子源（ESI )，在ESI条件下，PEG的离 子化效率高，其长链易于带电，但是其所带电荷量不同，这使得本身聚合度就不相同的PEG 具有更多不同的m/z，所以PEG碎片的m/z更加不确定，难以用传统的MRM扫描模式对PEG 进行LC-MS/MS定量分析。为此，人们也在尝试着一些方法来解决这一难题。如有学者尝试 利用离子源内能量将不同聚合度PEG初步打碎成较大片段，并通过Q1选择其中一个响应较 高的片段作为母离子，再继续按照MRM模式用产生的碎片进行定量分析。该方法虽然能部 分实现PEG的LC-MS/MS定量分析，但是离子源内产生的能量较低，比串联质谱碰撞室（Q2) 内的碰撞能量至少低2个数量级，所以只能部分裂解PEG，且裂解位置不固定，裂解效率不 稳定，可以产生若干种不同m/z的碎片，无论选择哪个碎片作为母离子进行定量，都不得不 忽略大部分其他m/z的碎片，其定量结果灵敏度、准确性较低，线性差。另有学者对聚合度 较低的PEG 400进行定量分析，针对其中丰度较高的9种不同分子量的PEG，对每个PEG都 利用MRM模式测定含量之后，再将它们的含量相加得到PEG 400的总体含量。但是在定量 前必须先测定每种聚合度的PEG占总量的比例才可完成定量，而且对每种成分都要单独制 作标准曲线，操作步骤相应增加，造成定量准确性降低。以上两种方法均采用MRM模式，仍 需要利用Q1选择母离子，没有从根本上解决问题，还存在一些不足。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是，针对生物样本中PEG分子量的不唯一性，建立一种 操作简便易行，结果准确可靠，灵敏度高，重现性好的PEG定量测定方法。本发明的目的是 通过以下技术方案实现的。
[0008] -种生物样本中PEG含量的测定方法，采用液相色谱-飞行时间质谱 (LC-Q-Q-T0F)进行测定，测定步骤包括： A. 建立PEG测定的标准曲线； B. 使用液相色谱_飞行时间质谱测定待测样品，通过步骤A所得标准曲线计算出待测 样本中PEG浓度； 步骤A和步骤B的色谱条件和质谱条件相同，其中质谱条件基于三重串联质谱技术，步 骤A和步骤B质谱部分的设定为：第一个质量分析器Q1中不选择母离子，带电粒子全部通 过后进入第二个质量分析器Q2 ;在第二个质量分析器Q2中设置碰撞能量，将带电粒子打碎 成碎片离子；在第三个质量分析器飞行时间质量分析器选取稳定的特征碎片离子，来定量 PEG。
[0009] 进一步的，所述特征碎片离子m/z为133. 083~133. 086。
[0010] 进一步的，测定PEG 400~1000,所述质谱操作部分解簇电压为80 V，第二个质量 分析器Q2中PEG的碰撞电压为25 eV。
[0011] 进一步的，测定PEG 1000~2000,所述质谱操作部分解簇电压为100 V，第二个质 量分析器Q2中PEG的碰撞电压为25 eV。
[0012] 进一步的，测定PEG 2000~20000,所述质谱操作部分解簇电压为100 V，第二个质 量分析器Q2中PEG的碰撞电压为30 eV。
[0013] 进一步的，测定方法中使用的内标物质为辛伐他汀。
[0014] 进一步的，步骤A和步骤B中所述质谱条件为：正离子方式检测；离子喷射电压： 5500 V ;温度：500° C ;气帘气体（CUR)氮气压力15 psi ;气体1氮气压力（GS1)60 psi、气 体2氮气压力（GS2)50 psi ;PEG扫描方式为T0F-MS模式，扫描的m/z范围为88. 0~178. 0。
[0015] 进一步的，步骤A和步骤B中所述色谱条件为：流动相为甲酸体积百分数占0. 1% 的水和甲酸体积百分数占0. 1%的乙腈，梯度洗脱，柱温40° C ;流速：400 mL/min。
[0016] 进一步的，所述步骤A具体操作程序为： 1)制备内标溶液和不同浓度的PEG标准溶液。
[0017] 2)于抗吸附管中加入内标溶液、PEG标准溶液及预冷的乙腈涡流混匀，离心后取上 清液进样到高效液相色谱-飞行时间质谱中分析； 3)取不同浓度的PEG标准溶液重复程序2)操作，记录色谱图，PEG浓度为横坐标，PEG 色谱峰面积与内标峰面积比值为纵坐标，用加权W=l/x2最小二乘法进行回归运算，求得的 直线回归方程，即为标准曲线。
[0018] 进一步的，所述步骤B具体操作程序： 1)于抗吸附管中加入内标溶液、待测样本溶液及预冷的乙腈涡流混匀，离心后取上清 液进样到高效液相色谱-飞行时间质谱中分析； 2 )将程序1)中获取的待测样本PEG峰面积与内标峰面积比值代入标准曲线，求得PEG 浓度。
[0019] 本发明测定方法的原理是：通过改变液相色谱流动相比例，将不同分子量范围的 PEG从色谱柱上洗脱后进入质谱检测。采用T0F-MS模式，无需在Q1中选择母离子，所有PEG 都直接进入碰撞室（Q2)内，通过碰撞诱导解离（CID)的方式，利用Q2内的较大能量高效地 将PEG全部打碎，然后利用飞行时间质量分析器（T0F)选择不同聚合度PEG共同产生的的 响应最高且稳定的特征质谱裂解碎片（理论上精确m/z为133. 08592, 3个乙二醇重复单元） 进行定量，进而建立一种操作简