片离子；在第三个质量分析器飞行时间质量分析器选取稳定的特征碎片离子，来 定量PEG。
[0043] 色谱条件：Agilent 1100高效液相色谱系统，包括二元输液泵，脱气机，自动进样 器，美国Agilent公司；岛津UFLC SIL-20A XR柱温箱，日本岛津公司；色谱柱：XBridge? BH1300 C18柱，2. 1X50 mm I.D.，3. 5 ym粒径，300A孔径（Waters);流动相：甲酸体积百分 数占0. 1%的水和甲酸体积百分数占0. 1%的乙腈，梯度洗脱，具体程序见表2 ;柱温40° C ; 流速 400 ml,/min ；
其中A是甲酸体积百分数占0. 1%的水，B是甲酸体积百分数占0. 1%的乙腈。
[0044] 质谱条件：Triple T0F 5600型质谱仪，配有电喷雾离子化源以及Analyst TF 1.6. 1数据处理软件(美国AB SCIEX公司）;正离子方式检测；离子喷射电压：5500 V;温度： 500° C;气帘气体（CUR)氮气压力15 psi;气体1氮气压力（GS1)60 psi、气体2氮气压 力（GS2)50 psi ;PEG扫描方式为TOF-MS模式，扫描的m/z范围为88. 0~178. 0,解簇电压 (DP)100 V，碰撞电压（CE)30 eV;辛伐他汀扫描方式为Product ion模式，母离子的m/z为 419. 2,子尚子扫描范围为198. 5~199. 5 ; 数据处理： 利用Analyst TF 1.6.1软件记录色谱图，并使用Multiquant 2. 0.2软件提取m/z范 围为133. 083~133. 086 (理论上精确m/z为133. 08592, 3个乙二醇重复单元）离子的色谱 图进行定量，同时提取质量范围为89. 058~89. 062 (理论上精确m/z为89. 05971，2个乙二 醇重复单元）以及177. 110~177. 114 (理论上精确m/z为177. 11214,4个乙二醇重复单元） 两个范围的离子色谱图作为监测离子。以A步骤中获取的PEG浓度为横坐标，PEG色谱峰面 积与内标峰面积比值为纵坐标，用加权W=l/x 2最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归 方程，即为标准工作曲线。将B步骤中获取的待测样本PEG峰面积与内标峰面积比值代入 标准工作曲线，求得PEG浓度。空白血浆样本色谱图如图1所示，内标色谱图如图2所示， 含PEG 4000的样本色谱图如图4所示，大鼠尾静脉注射PEG 4000后的血药浓度见表3 ;
质量控制样本制备 ① 利用去离子水将PEG 4000标准品溶解至1. 0 mg/mL，得到PEG 4000储备液； ② 利用大鼠血浆将PEG储备液分别稀释至100,1000,8000 ng/mL ; ③ 每浓度取至少三个样本，按照标准曲线制备方法处理样本，并根据标准曲线，得出 PEG浓度，计算质量控制样本准确度，具体见表5,考察方法的准确性。
[0045] 本发明所述的不同聚合度PEG定量方法操作简便易行、分析时间短、线性关系良 好、准确度高、重现性好而且灵敏、可靠，不仅可以对复杂生物样本中不同聚合度的PEG进 行定量，也可应用于PEG键合药物中PEG的含量测定，应用范围广。
[0046] 实施例3 血浆样本中PEG 10000含量的测定，除下述参数与实施例2不同外，其他操作和参数与 实施例2相同。
[0047] 测定之前的准备工作中给大鼠注射的为PEG 10000生理盐水溶液，制作标准溶液 时选取的标准品为PEG 10000。测定参数中：质谱条件中解簇电压为100 V，碰撞电压为30 eV ;色谱洗脱程序见表6。标准曲线和准确度见表7、8。
[0048] 实施例3 血浆样本中PEG 600含量的测定，除下述参数与实施例2不同外，其他操作和参数与实 施例2相同。
[0049] 测定之前的准备工作中给大鼠注射的为PEG 600生理盐水溶液，制作标准溶液时 选取的标准品为PEG 600。测定参数中：质谱条件中解簇电压为80 V，碰撞电压为25 eV; 色谱洗脱程序见表9。标准曲线和准确度见表10、11。
【主权项】
1. 一种生物样本中PEG含量的测定方法，其特征在于：采用液相色谱-飞行时间质谱 进行测定，测定步骤包括： A. 建立PEG测定的标准曲线； B. 使用液相色谱_飞行时间质谱测定待测样品，通过步骤A所得标准曲线计算出待测 样本中PEG浓度； 步骤A和步骤B的色谱条件和质谱条件相同，其中质谱条件基于三重串联质谱技术，步 骤A和步骤B质谱部分的设定为：第一个质量分析器Ql中不选择母离子，带电粒子全部通 过后进入第二个质量分析器Q2;在第二个质量分析器Q2中设置碰撞能量，将带电粒子打碎 成碎片离子；在第三个质量分析器飞行时间质量分析器选取稳定的特征碎片离子，来定量 PEG。2. 根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述特征碎片离子m/z为 133. 083~133. 086。3. 根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：测定PEG400~1000,所述质谱操作 部分解簇电压为80V，第二个质量分析器Q2中PEG的碰撞电压为25eV。4. 根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：测定PEG1000~2000,所述质谱操 作部分解簇电压为1〇〇V，第二个质量分析器Q2中PEG的碰撞电压为25eV。5. 根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：测定PEG2000~20000,所述质谱操 作部分解簇电压为1〇〇V，第二个质量分析器Q2中PEG的碰撞电压为30eV。6. 根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：测定方法中使用的内标物质为辛伐 他汀。7. 根据权利要求1~6中任意一项所述的测定方法，其特征在于：步骤A和步骤B中所 述质谱条件为：正离子方式检测；离子喷射电压：5500V;温度：500°C;气帘气体（⑶R)氮 气压力15psi;气体1氮气压力（GSl) 60psi、气体2氮气压力（GS2) 50psi;PEG扫描方 式为TOF-MS模式，扫描的m/z范围为88. 0~178. 0。8. 根据权利要求1~6中任意一项所述的测定方法，其特征在于：步骤A和步骤B中所 述色谱条件为：流动相为甲酸体积百分数占0. 1%的水和甲酸体积百分数占0. 1%的乙腈，梯 度洗脱，柱温40°C;流速：400mL/min。9. 根据权利要求1~6中任意一项所述的测定方法，其特征在于：所述步骤A具体操作 程序为： 1) 制备内标溶液和不同浓度的PEG标准溶液； 2) 于抗吸附管中加入内标溶液、PEG标准溶液及预冷的乙腈后涡流混匀，离心后上清液 进样到高效液相色谱-飞行时间质谱中分析； 3) 取不同浓度的PEG标准溶液重复程序2)操作，记录色谱图，PEG浓度为横坐标，PEG 色谱峰面积与内标峰面积比值为纵坐标，用加权W=l/x2最小二乘法进行回归运算，求得的 直线回归方程，即为标准曲线。10. 根据权利要求9所述的测定方法，其特征在于：所述步骤B具体操作程序为： 1)于抗吸附管中加入内标溶液、待测样本溶液及预冷的乙腈涡流混匀，离心后取上清 液进样到高效液相色谱-飞行时间质谱中分析； 2 )将程序1)中获取的待测样本PEG峰面积与内标峰面积比值代入标准工作曲线，求得
【专利摘要】本发明为一种生物样本中PEG含量的测定方法，采用液相色谱-飞行时间质谱进行测定，首先制备标准曲线，然后将待测样本测定结果通过标准曲线计算出待测样本中PEG浓度；本发明中质谱条件基于三重串联质谱技术，质谱部分的设定为：第一个质量分析器Q1中不选择母离子，带电粒子全部通过后进入第二个质量分析器Q2；在第二个质量分析器Q2中设置碰撞能量，将带电粒子打碎成碎片离子；在第三个质量分析器飞行时间质量分析器选取稳定的特征碎片离子，来定量PEG。本发明针对生物样本中PEG分子量的不唯一性，建立一种操作简便易行，结果准确可靠，灵敏度高，重现性好的PEG定量测定方法。
【IPC分类】G01N30/88
【公开号】CN104931637
【申请号】CN201510356323
【发明人】顾景凯, 周晓彤, 程龙妹, 尹磊, 杨艳
【申请人】吉林大学
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年6月25日