一种快速判定含油微生物细胞内多不饱和脂肪酸含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于检测方法技术领域，具体涉及一种细胞内多不饱和脂肪酸含量的方 法，尤其涉及一种适用于菌种筛选、微生物培养条件优化和工业生产多不饱和脂肪酸微生 物培养过程监测的快速判定细胞内不饱和脂肪酸含量的方法。
【背景技术】
[0002] 多不饱和脂肪酸(主要包括DHA，EPA，ARA等）具有维持细胞稳态和正常生长、预防 也血管疾病、免疫调节和抗癌等许多重要的生理作用。多不饱和脂肪酸已经长期作为婴幼 儿奶粉、保健食品、药品中的重要添加剂使用，近年来也开始在食用油、奶制品等食品中作 为添加剂提高其营养价值。早期多不饱和脂肪酸主要来源于深海鱼油，受过度捕揚、环境污 染、季节变化等因素的影响很大。而微生物来源的多不饱和脂肪酸则具有生产周期短、不受 季节和场地的影响、不受自然环境污染影响等特点，逐渐成为替代深海鱼油的多不饱和脂 肪酸的主要生产来源，并广泛应用于科学研究和工业化生产。生产多不饱和脂肪酸的微生 物包括微藻、细菌、真菌、酵母等，该些微生物通常W生产某一种多不饱和脂肪酸为主；如裂 殖壶藻通常高产DHA，希瓦氏菌高产EPA，高山被抱霉高产ARA等。
[0003] 生产多不饱和脂肪酸的微生物通常从自然环境中分离纯化(菌株筛选）得到，并通 过发酵工程等方法进行培养基优化、培养条件优化和放大培养等，最终用于大规模工业化 生产。在菌株筛选、培养条件优化、工业化生产过程中，需要对微生物中多不饱和脂肪酸的 含量进行测定，W达到提高产量或监测生产过程的目的。目前测定脂肪酸组成的方法通常 需要首先提取油脂，然后使用GC、GC-MS、HPLC或NMR等方法测定油脂中脂肪酸的组成和含 量。该些方法所需要的样品通常需要通过溶剂提取和衍生化等复杂的步骤进行制备，不但 耗时长，而且可能对检测精度产生影响，造成较大的误差。因此，寻找简单快速测定不饱和 脂肪酸的方法，对于菌株筛选、培养条件优化、工业化生产过程中大批量样品检测具有重要 的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种快速检测微生物细胞内多不饱和脂肪酸含量的方法。 该方法利用微生物自身能够高产油脂并形成脂滴该一特性，直接使用细胞进行核磁共振检 巧IJ，通过核磁共振谱图上饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的特征峰的强度比，判定细胞内多不 饱和脂肪酸相对含量。本方法和传统脂肪酸含量测定方法相比，无需样品干燥、细胞破碎、 油脂提取、转醋化等操作，无需使用有机溶剂，节约了人力物力，大大提高了测定效率。
[0005] 本发明技术方案：一种快速判定含油微生物胞内多不饱和脂肪酸含量的方法，包 括如下步骤。
[0006] (1)样品制备；将微生物细胞菌液进行离也，将菌体重新均匀息浮于缓冲液中，得 到细胞息浮液；W除去培养液中细胞之外的干扰成分。该步骤可重复若干次。
[0007] (2)核磁共振检测；对细胞息浮液进行核磁共振检测，得到核磁共振谱图；所述核 磁共振检测为iHNMR检测或"CNMR检测，所述核磁共振谱图为咱谱或"C谱。
[0008] (3)结果计算和判定；所述咱谱上化学位移在1. 0-1. 3之间的峰为峰A，化学位移 在2. 5-2. 9之间峰为峰B;所述"C谱上化学位移在29. 0-30. 0之间的峰为峰A'，化学位移 在25. 0-26.0之间的峰为峰B'，所述峰A和峰A'代表饱和脂肪酸，所述峰B和峰B'代表多 不饱和脂肪酸；所述峰B和峰A峰强度或者峰面积的比值为R，所述峰B'和峰A'峰强度或 者峰面积的比值为R' ；所述R或R'越大，多不饱和脂肪酸的含量越高。
[0009] 优选的是，所述含油微生物为W脂滴形式储存油脂、且油脂含量不低于细胞干重 5%的微生物。
[0010] 优选的是，所述含油微生物包括真菌、细菌、微藻和酵母。
[0011] 优选的是，步骤（1)所述的缓冲液的抑和离子强度与菌体培养基相近。
[0012] 本发明的有益效果： 1)本发明利用细胞内自身油脂含量高该一特点，直接使用细胞进行核磁共振检测，样 品制备和检测过程极为简单，只需对培养基进行简单置换，无需样品干燥、油脂抽提、转醋 化等过程，无需使用有机溶剂，节省了人力物力。
[0013] 2)本发明使用核磁共振谱图上的特征峰进行检测，使用电谱或"C谱。在常规的 600MHz核磁共振谱仪上，咱谱检测时间在十分钟之内可W完成，"C谱在半小时之内可W完 成，检测迅速便捷。
[0014] 3 )本发明由于快速便捷，适用于大量样品的高通量检测，如微生物大规模筛选，培 养条件优化，工业生产过程监测等，具有重要的产业化意义。
【附图说明】
[0015] 图1为裂殖壶藻细胞的咱核磁共振谱图。
[0016] 图2为裂殖壶藻细胞的"C核磁共振谱图。
[0017] 图3为使用咱谱计算的比值R和使用"C谱计算的比值R'之间的关系。
[0018] 图4为不同培养条件下裂殖壶藻使用电谱计算的DHA相对含量和使用GC测定的 DHA含量之间的关系。
[0019] 图5为不同培养条件下裂殖壶藻使用"C谱计算的DHA相对含量和使用GC测定的 DHA含量之间的关系。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合附图对本发明作进一步说明。
[00川 实施例1 本实施例为使用本发明方法比较一种微藻，裂殖壶藻在不同培养条件下的多不饱和脂 肪酸含量，具体步骤如下： 一、样品制备：取不同培养条件的9个裂殖壶藻细胞样品各1毫升在转速为8000g的 条件下离也，去除上清液；将菌体沉淀重息于4倍于菌体体积的磯酸缓冲液中。将该菌体重 息液在转速为8000g的条件下离也，去除上清液；将菌体沉淀重息于和菌体体积相等的磯 酸缓冲液中。样品准备过程中使用的磯酸缓冲液具有和培养基相同的抑和离子强度。
[0022] 二、核磁共振检测；取细胞重息液500微升，添加50微升重水，放置于5毫米外径 的核磁共振样品管中，在600MHz的核磁共振波谱仪上测定咱谱和"C谱。咱谱实验采用标 准的水峰压制的脉冲程序，"C谱使用标准的咱去禪的脉冲程序。咱谱实验时间为3分钟， "C谱实验时间为10分钟。对每个样品分别得到如图1的咱谱和图2的"C谱。
[0023] H、结果计算；通过计算峰B和峰A的强度比值R或者峰B'和峰A'的强度比值 R'，比较各个样品之间多不饱和脂肪酸的含量，结果见表1。根据表1可知，样品3的咱谱 的R值和"C谱的R'值均为最大，为含有多不饱和脂肪酸含量最高的样品条件。
[0024] 四、本方法可靠性的验证：本发明的方法简单易行，其测量误差主要来自样品中可 能在观测谱峰位置产生信号的杂质，W及核磁共振实验自身的误差。对我们测定的样品的 电谱的R值和"C谱R'值进行线性回归（见图3)，其R2=0. 9929,表明电谱和"C谱具有相 近的可靠性。对前面测定的9个样品进行油脂提取，使用GC测定每个样品的多不饱和脂肪 酸含量。将GC测定的结果与咱谱和"C谱得到的结果进行线性回归，结果见图4和图5,其 R2为0. 8810和0. 8601，表明我们的方法和传统GC方法之间具有较好的吻合度。
[00巧]表1. 9个不同培养条件的样品的R和R'
【主权项】
1. 一种快速判定含油微生物细胞内多不饱和脂肪酸含量的方法，其特征在于：包括如 下步骤： 样品制备：将微生物细胞菌液进行离心，将菌体重新均匀悬浮于缓冲液中，得到细胞悬 浮液； 核磁共振检测：对细胞悬浮液进行核磁共振检测，得到核磁共振谱图；所述核磁共振 检测为1HNMR检测或13CNMR检测，所述核磁共振谱图为1H谱或 13C谱； 结果计算：所述1H谱上化学位移在1. 0-1. 3之间的峰为峰A，化学位移在2. 5-2. 9之 间峰为峰B ;所述13C谱上化学位移在29. 0-30. 0之间的峰为峰A'，化学位移在25. 0-26. 0 之间的峰为峰B'，所述峰A和峰A'代表饱和脂肪酸，所述峰B和峰B'代表多不饱和脂肪 酸；所述峰B和峰A峰强度或者峰面积的比值为R，所述峰B'和峰A'峰强度或者峰面积的 比值为R' ；所述R或R'越大，多不饱和脂肪酸的含量越高。2. 根据权利要求1所述的一种快速判定含油微生物细胞内多不饱和脂肪酸含量的方 法，其特征在于：所述含油微生物为以脂滴形式储存油脂、且油脂含量不低于细胞干重5% 的微生物。3. 根据权利要求1所述的一种快速判定含油微生物细胞内多不饱和脂肪酸含量的方 法，其特征在于：所述含油微生物包括真菌、细菌、微藻和酵母。4. 根据权利要求1-3中任意一项所述的一种快速判定含油微生物细胞内多不饱和脂 肪酸含量的方法，其特征在于：步骤（1)所述的缓冲液的PH和离子强度与菌体培养基一致。
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测含油微生物细胞内多不饱和脂肪酸含量的方法，主要是检测微藻、细菌、真菌、酵母等微生物中细胞内多不饱和脂肪酸的相对含量，是将细胞培养液离心后，将菌体重悬于缓冲液中，测定核磁共振1H谱或13C谱，根据核磁共振谱图上特征峰的强度比来比较不同样品的多不饱和脂肪酸的含量。本发明和传统脂肪酸含量测定方法相比，无需样品干燥、细胞破碎、油脂提取、转酯化等操作，无需使用有机溶剂，节约了人力物力，大大提高了测定效率，适用于大量样品的高通量快速检测，如微生物筛选，培养条件优化，工业化生产过程监测等。
【IPC分类】G01N24/08
【公开号】CN104950006
【申请号】CN201410118153
【发明人】冯银刚, 兰君, 谭延振, 宋晓金, 崔球
【申请人】中国科学院青岛生物能源与过程研究所
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2014年3月27日