生物电镜样品碳化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生物样品制备领域，具体涉及一种生物电镜样品碳化方法
【背景技术】
[0002] 电子显微镜诞生以来，研究人员对用于电子显微镜观察的生物样品的前期制备、 切片、染色的技术进行不断的探索与改进，以求获得更高品质的真实图象和实验结果。
[0003] 常规的透射生物电镜样品制备有包埋切片法，负染色法等。而常规的扫描电镜样 品制备常采用单一的临界点干燥法（临界点仪器冷冻干燥法，又称冷冻干燥法），一般的 操作步骤为，取材大小在〇. 8_平方以内，用2. 5%戊二醛2ml，固定2小时或者更长时间， 〇. 1M磷酸缓冲液漂洗3次，每次15分钟，然后用1 %四氧化锇2ml固定2小时，0. 1M磷酸 缓冲液漂洗3次，每次15分钟，50 %乙醇、70 %乙醇、90 %乙醇、各一次，每次15分钟，100 % 乙醇三次、每次15分钟，100%乙醇与醋酸已戊脂1:1混合，一次20分钟，纯醋酸已戊脂一 次20- 30分钟，临界点干燥。又莱卡现在有新的临界点干燥无需醋酸已戊脂浸透过程，直 接从100%乙醇进入临界点干燥。
[0004] 现有技术中生物样品常规透射电子显微镜样品制备如：心、肝、脾、肺、肾、皮肤、肌 肉、等以及各种类型的培养细胞的电镜样品都已经有一系列的完整的方法，其中不乏试剂 的选择变化，如：不同环氧树脂国产的618 (E51)、进口的Epon812与低粘度的Spurr的选择 变换。透射电镜样品处理的一般方法：取材、前固定、漂洗、后固定、漂洗、乙醇梯度（50%、 70%、90%、）乙醇90%与丙酮90% 1:1混合液、100% *3次脱水。实践显示，在生物组织临 界点干燥时，把控时间存在难度，在临界点干燥仪器工作过程中，组织样品体积内部的压力 从开始的二氧化碳液体的50kg大气压上升达110大气压工作点，然后在进行排压放气，该 过程中由于组织内、外部压力易形成一个倒压差，易使组织发生爆裂，严重影响实验效果。 以细菌为例，经过常规的扫描电镜样品制备、脱水与临界点干燥后，少有细菌是饱满的原来 的生态结构，细菌常出现大量凹凸的形态结构，不能达到基本完整的细菌原样。
[0005] 现有技术中对于细菌、病毒、分子蛋白的透射电镜的观察可以用磷钨酸负染色法 进行。但是，有些样品受到临界点条件制约，无法进行样品的临界点制备条件，不能进行扫 描电镜观察。如：氢化蓖麻油与脂肪醇聚氧乙烯醚（21)混合物、牛油树脂与tween80混合 物，多聚赖氨酸等，目前尚无法对这些样品进行临界点干燥。一些有机高分子材料如多聚赖 氨酸等，在没有进行样品电子修复的情况下，观察效果始终不能达到理想的结果或根本无 法观察；另外，对于油脂类脂滴粒径电镜测定，尚无有令人满意的样品制备方法。
[0006] 本申请的发明人针对现有技术的现状，拟提供一种生物电镜样品碳化方法，使一 些原来无法制备的透射电镜样品、扫描电镜样品能够顺利完成样品制备达到电镜观察要 求。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种用于电子显微镜的生物电 镜样品碳化方法
[0008] 本发明方法改变了一些常规的电镜样品制备方法，在整个实验过程中对于实验结 果有更好的表达结果，且环保低碳、操作简便、整个样品的化学物理收缩率小、形貌结构几 乎无改变，细微结构清晰。
[0009] 本发明中：采用0. 1M四氧化锇液体的挥发性气体对生物有机样品进行熏蒸、灼 烧，使生物有机样品达到完全碳化以符合扫描电镜观察的要求，本发明突破了一些电镜样 品制备的瓶颈，使一些原来无法制备的透射电镜样品、扫描电镜样品能够顺利完成样品制 备达到电镜观察要求。
[0010] 具体而言，本发明的生物电镜样品碳化方法，其特征在于，采用〇. 1M四氧化锇液 体的挥发性气体对生物有机样品进行熏蒸、灼烧，使生物有机样品完全碳化；其包括下述步 骤：
[0011] 1)生物类或有机高分子类扫描电镜样品处理：
[0012] 取离体动物或人体的器官组织块，景常规处理快速用2. 5%戊二醛2ml固定2小时 或者更长时间，4〇C冷藏固定2小时以上，缓冲液漂洗2次，每次10分钟；
[0013] 2)取电镜镍网做支架，将组织块除去表面水渍，置于电镜镍网上面；或，将有机高 分子物质的悬浮液滴在含有碳膜的载网上面，经3-5分钟的吸附，除去上清多余悬液，微干 备用；
[0014] 3)取底部加1 %浓度的四氧化锇溶液的离心管，使其横置、形成底部的液态涨力 留置；
[0015] 4)将置有组织的镍网支架转移至离心管的中部或者口端部，离心管封盖以及加封 口膜封口、标注样品性质、样品标记号，集合多个离心管样品放入统一的器皿，再封口，标注 碳化起始时间；
[0016] 5)转移到冰箱4度冷藏空间开始碳化，不同的组织一般碳化时间在24-72小时 之间；
[0017] 6)取出已碳化的样品，转移样品到新的离心管中、开盖放置37〇C温箱3-4小时，加 盖封口保存；
[0018] 7)喷金、扫描电镜观察。
[0019] 本发明中，生物电镜样品包括生物样品组织、细菌、有机高分子蛋白体等；
[0020] 本发明中，在EP离心管底部加100ul的1%浓度的四氧化锇溶液，由于溶液的涨力 使溶液沉积于离心管底部，将离心管横置、液体不会流失，形成底部的液态涨力留置；
[0021] 本发明中，所述的四氧化锇具有如下所示的结构，通常由金属锇与氧气在加热的 条件下反应制得；
[0022]
[0023]外文名：osmiumtetroxide
[0024] 别名：锇酸酐
[0025]化学式：0s04
[0026] 相对分子质量：254. 20
[0027] 化学品类别：无机物一金属氧化物
[0028] 物理性质：
[0029]EINECS号：244-058_7
[0030]外观与性状：白色或淡黄色结晶，有类似氯的气味。
[0031] 熔点（°C):41.0
[0032] 相对密度（水=1) :4. 91
[0033]沸点（°C):130
[0034]分子式：0s04
[0035]分子量：254. 20
[0036]饱和蒸气压（kPa) :0? 93/20°C
[0037] 溶解性：微溶于水，溶于乙醇、乙醚、四氯化碳、氨水。
[0038] 化学性质：
[0039] 在沸点以下，开始升华。微溶于水，水溶液呈中性，溶于浓碱呈黄色。是一种氧化 剂，可以氧化氢碘酸；
[0040] 所述的四氧化锇通常用作微生物学试剂、照保材料、白炽灯罩、催化剂、氧化剂和 生物学中的气体固定剂。
[0041] 本发明还提供了扫描电镜样品中类似油脂类的脂滴粒径测定的制备方法，如：氢 化蓖麻油与脂肪醇聚氧乙烯醚（21)组成，牛油树脂与tween80组成（失水山梨醇单油酸酯 聚氧乙烯醚（Tween80)简称乳化剂T-80)等。
[0042]本发明基于锇酸的物理化学性质与锇酸对于暴露在体表外面的粘膜有极强的烧 灼损伤作用，如：人体的鼻粘膜、口腔粘膜、眼睛角膜等，与锇酸蒸汽接触时间长了会受到烧 灼损伤等，利用锇酸蒸汽对于生物组织、有机组织的烧灼损伤的原理，经试验筛选确定了锇 酸蒸汽对生物组织、有机组织熏蒸的时间，使生物组织、有机组织进入到碳化状态，达到碳 化结构的抗力与涨力，最终完成扫描电镜样品与部分有机组织的透射电镜观察要求。
[0043] 本发明方法过程简单易于操作，与常规生物有机样品的电镜样品制备方法完全不 同，尤其是改变了常规方法的繁琐的步骤，大量节约了试剂等使用，且环保低碳；其较现有 技术的明显区别于，除需要二次固定的〇. 1M四氧化锇液体的二十分之一液体量外，二次固 定以后所需要的PB漂洗、乙醇的梯度50%、70%、90%、100%、100 %、100%、醋酸已戊脂、 临界点二氧化碳低温干燥等可以全部省略，获得的实验结果明显优于常规制备方法，该方 法中，还解决了一些常规样品制备不能解决的问题，如：油脂类的脂滴粒、多聚赖氨酸样品 制备等。本方法中就〇. 1M四氧化锇液体使用值就可以达到百分之一,也就是常规样品制备 一例需要的〇. 1M四氧化锇液体量，按本方法可以制备一百例左右。
[0044] 表1是本方法与常规临界点干燥方法制备扫描电镜样品的对比。
[0045]表1
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