一种基于金属有机骨架材料－核酸适体荧光传感器检测食源性致病菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食源性致病菌分析检测领域，尤其涉及利用金属有机骨架材料荧光淬 灭特性和核酸适体识别技术检测食源性致病菌的方法。
【背景技术】
[0002] 食源性致病菌是以食物为载体导致人类发生疾病的一大类细菌，具有来源多样、 繁殖迅速的特点，是首要的食品安全危害因子。
[0003] 当前，食品中致病菌常用检测技术有常规培养法、免疫法、聚合酶链反应法（PCR)、 基因探针法等。（1)常规培养法建立在微生物增菌、分离培养和生化鉴定基础上（CritRev Microbiol, 2011，37 (1): 40)，无法对难培养或不可培养的致病菌进行检测，而且特异 性不高，灵敏度低，操作烦琐耗时，不能实现有效的监测预防作用。（2)免疫法基于抗原与相 应抗体之间特异性的结合（BiosensBioelectron, 2000，15 (11-12): 549)，由于不同细 菌之间，细菌与宿主之间可能存在共同抗原，故不能仅根据抗原检测判断致病细菌，另外， 免疫法假阳性几率较高、检测影响因素较多，限制了该法的广泛应用。（3)PCR是一种特异性 的DNA扩增技术（JMicrobiolMethods, 2007，69(1): 1)，具有检测速度快、效率高、使用 方便等优点，但实际检测中也存在不少问题，如检测致病微生物的种类较少，分辨率低，弓丨 物之间可能存在干扰，检测结果存在一定的假阳性和假阴性现象。（4)基因探针法又称核酸 分子杂交法（EmergInfectDis, 2011，17 (1): 7;JDairySci, 2009，92(7): 3027)， 具有高特异性和敏感性，可直接用于微生物的鉴定。其原理是将己知核苷酸序列DNA片段 用同位素或其他方法标记，加入己变性的被检DNA样品中，在一定条件下即可与该样品中 有同源序列的DNA区段形成杂交双链，从而达到鉴定样品中DNA的目的。该方法在食品安 全检测领域应用较为广泛，可灵敏、快速、直接、稳定地检测出致病微生物，并且不受非致病 微生物的影响，但也存在一定的局限性，包括很难从复杂的食品环境中分离、富集和纯化高 质量的DNA，检测多种致病菌时需要不同的杂交条件等等，这些都容易导致非特异的杂交， 从而造成假阳性或假阴性结果。另外，进行DNA杂交一般需要104~105个致病菌目标基因的 拷贝，因此依然需要进行增菌培养，这限制了基因探针作为一种快速检测技术的发展。另有 专利技术（中国专利，【申请号】201410070122. 8)基于染料AccuBlue免标记适配体传感器检 测食源性致病菌，设计了"signalon"和"signaloff"两种检测模式，关键步骤依然是核 酸分子杂交，在检测实际复杂样品时十分受限。
[0004] 金属有机骨架材料是一类具有巨大应用前景的新型多孔材料，是由过渡金属离 子或金属簇与有机配体通过分子组装和晶体工程方法构建的具有无限网络结构的结晶 化合物。在外界物理、化学激励物作用下（如光子、电子、离子、分子等），金属有机骨 架材料会产生不同的响应，如能量转移、电子转移、框架构象及晶型的改变等，多应用 在气体储存、选择性分离、异相催化、磁学和光学、药物输送等方面，在分子传感方面的研 究方兴未艾，已经应用在阳离子、阴离子、小分子和气体检测等方面，例如，在水溶液里， Eu2(FMA)2 (OX) (H20)4 ? 4H20材料对Cu2+具有非常高的发光灵敏度和选择性（ChemCommun， 2010，46: 5503)，Zn-Ir(2-phenylpyridine)材料可选择性检测02(JAmChemSoc, 2010， 132: 922)，有良好稳定性和重现性。
[0005] 金属有机骨架材料中的配体通常含有共辄Jr电子系统和大量的孔隙，允许核酸 分子与之结合和重构；此外，作为连接点的金属离子如Zn2+和Cu2+等，具有内在的荧光猝 灭特性；配体和金属离子的性质使得金属有机骨架材料兼具了吸附核酸分子和淬灭荧光能 力。新型结构金属有机骨架多孔材料的研究及其在生物分子以及食品安全分析中的应用有 待进一步深入研究。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题在于：克服现有致病菌检测技术特异性不高，灵敏度低， 操作烦琐耗时、假阳性率高等不足，将金属有机骨架材料应用于食品安全分析领域，利用金 属有机骨架材料的荧光淬灭特性以及对核酸适体的吸附性，结合核酸适体的高亲和力和高 特异性识别能力，提供一种快速、准确可靠、灵敏、特异性高的食源性致病菌检测方法。 为了解决上述技术问题，本发明提出以下技术方案：荧光探针标记的核酸适体在游离 状态下可检测到较强的荧光信号，当核酸适体被吸附到金属有机骨架材料上，荧光被淬灭， 在体系中加入目标菌，目标菌会特异性地与核酸适体结合，使得核酸适体从金属有机骨架 材料上脱离下来，进而引起荧光信号增强。理论上，目标菌的浓度越高，脱离下来的核酸适 体就越多，相应的荧光探针的量越多，荧光信号越强，据此可进行定量分析，检测原理如图1 和图2所示。
[0007] 上述基于金属有机骨架材料-核酸适体荧光传感器检测食源性致病菌的方法中， 所述的核酸适体碱基序列由文献或专利得到。其中与沙门氏菌具有高亲和力和高特异性 的核酸适体序列为 5'一ITTGGTCCITGTCTTATGTCCAGAATGCTATGGCGGCGTCACCC GACGGGGACTTGACATTA- 3'（MolCellProbe, 2009，23: 20)，在 3' 端标记上荧光探 针羧基荧光素（FAM)，由生工生物工程(上海）有限公司完成。
[0008] 上述基于金属有机骨架材料-核酸适体荧光传感器检测食源性致病菌的方法中， 所述的金属有机骨架材料具有荧光淬灭特性以及对核酸适体的吸附性，可通过微波法、超 声法、固相合成及电化学合成等方法制备得到。其中含Cd有机骨架材料的制备流程如下： 步骤 1 :将含水氯化镉（CdCl2 2. 5H20,0. 023g~ 0? 115g，0.lmmol~ 0? 5mmol)和均苯三 甲酸（H2BTC，0. 042g~ 0? 126g，0. 2mmol~ 0? 6mmol)溶于 5. 0mL~15.OmL的N,N-二甲基甲 酰胺（DMF)、1. 0mL~5.OmL的环己醇和1. 0mL~5.OmL水中，混合后在室温下搅拌3~6小时，备 用。
[0009] 步骤2 :将步骤1所得溶液转移至烧杯中，一边搅拌一边缓慢滴加0.lmL~0. 6mL 的三乙胺，10分钟~20分钟滴加完毕，用塑料薄膜密封大烧杯，将烧杯放入超声反应器中， 40°C~70°C下超声10分钟~30分钟。将产物取出离心过滤，用50mL~100mLDMF溶剂多次 洗涤产物，置于50°C~70 °C下真空干燥24小时~36小时，即得到[Cd4 (BTC) 3 (DMF)