胃癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于蛋白质谱应用技术领域，具体地说，涉及一种胃癌唾液蛋白指纹图谱 分子诊断模型建立方法。
【背景技术】
[0002] 众所周知，胃炎和胃癌的初期临床表现难以鉴别，因此胃癌早期与慢性胃炎的鉴 别诊断尤为重要。胃癌诊断的金标准是内镜加活检，但该检查属于侵入性检查，检查时患者 普遍痛苦体验强烈，况且大量胃癌患者早期无明显症状，主动就医性差，难以作为胃癌普遍 筛查手段;血清胃泌素(PG)水平的检查在胃癌诊断中具有重要作用，但其在人体内的水平 受种族和地域的影响较大;B超多用于观察胃的邻近脏器，CT在组织特异性性方面存在不 足，对胃粘膜的充血、水肿、浅表隆起或凹陷性病变不敏感。因此，目前仍缺乏能够用于大众 人群的胃癌早期筛查方法。
[0003] 胃癌早期诊断是提高胃癌患者5年生存率的关键。胃癌的发生发展常通过原癌通 路，包括HP感染型胃炎、慢性萎缩性胃炎、肠化生、原位癌等。慢性萎缩性胃炎和胃癌组织基 因的表达既有相似性，又有异质性，肿瘤基因表达与癌前状态和癌前病变相关，基因表达的 相似性提示慢性萎缩性胃炎与胃癌这两者病理发展的相关性和延续性。HP感染是慢性胃炎 和胃癌的共同致病因素，而EBV病毒与HP联合感染，是肠型胃癌的重要危险因素。在慢性萎 缩性胃炎患者体内检测到jhp0945，是发展为胃癌的重要分子标志物。胃癌PGI和PGI/ Π水 平明显低于萎缩性胃炎组以及慢性胃炎组。Ji W等通过检测ρ53β和Δ 133p53两个亚型mRNA 分别在慢性浅表性胃炎组织细胞、慢性萎缩性胃炎组织细胞、胃癌组织细胞的表达水平，结 果发现慢性浅表性胃炎组织细胞中仅有p53ftnRNA表达，慢性萎缩性胃炎组织细胞中同时有 ρ53β和Δ 133p53mRNA的表达，胃癌细胞系中没有ρ53β和Δ 133p53mRNA的表达。分别采集25 名慢性萎缩性胃炎患者、胃癌患者，以及正常健康人的血清标本，进行蛋白质组学分析，构 建并验证胃癌前病变及胃癌的诊断模型，结果其敏感性和特异性均大于65%，高于现有的 肿瘤标志物筛查水平。
[0004] 寻找胃癌的生物标志物是目前研究胃癌早期诊断、分期、治疗靶点、以及预后评估 的热点。蛋白质组学技术的发展为唾液生物标志物的发现提供了强大武器。也已发现唾液 中含有2300多种蛋白质 [2]，利用唾液进行疾病诊断具有无创、微量、易于收集和储存、操作 简便快捷、易于被患者接受等明显优势。已有研究证明，唾液中含有HP及HP抗体IgG、KYNA (具有抗结胃癌作用)等180余种生物标志物。唾液蛋白的研究目前多采用的方法，质谱技术 是蛋白质组学研究中的前沿技术。
[0005] 因此，提供一种诊断模型简便、快速、标本用量少，灵敏度高，特异性好的胃癌唾液 蛋白指纹图谱分子诊断模型的建立方法，就成为该技术领域急需解决的技术难题。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明要解决现有技术对胃癌的检测复杂，检测周期长，灵敏度低，特 异性差的问题，提供了一种胃癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明公开了一种胃癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型 建立方法，包括以下步骤：
[0008] (1)样品收集；
[0009] (2)纳米磁珠预处理；
[0010] (3)样品预处理:取出冷冻保存的唾液样品，冰上解冻，所有唾液样品均1次冻融， 取5μ1所述唾液样品加入?ομL的U9裂解液，混合孵育30min后，加入185μ1的Wash Buffer稀 释(唾液最终上样量为2.5μ1);
[0011] (4)唾液样品洗脱上样:③向每个装有纳米磁珠的PCR管中分别加入100μΙ预处理 后的唾液样品，混匀，置于室温孵育30min，将所述PCR管置于磁铁上孵育lmin，去除上清液； ④每管加入100μΙ的Wash Buffer洗脱5min，然后将PCR管置于磁铁上孵育lmin，去除上清 液，再重复步骤④操作一次，以获得较纯的目的蛋白；⑤在PCR管中加入10μ1的Elution Buff er洗脱5min，将所述PCR管置于磁铁上孵育lmin，取5μ1上清液移至另一个PCR管中；⑥ 将装有5μ1上清液的PCR管中加入5μ1的CHCA饱和溶液，充分混匀，至样品颜色发灰，而没有 明显的沉淀时，取2μ1混合溶液，加样到Au/Steel芯片上，晾干后放入仪器读取；
[0012] (5)质谱分析:采用质谱仪读取所述Au/Steel芯片信息，设置激光强度为190,灵敏 度为5;
[0013] (6)数据采集；
[0014] (7)数据分析；
[0015] (8)建立诊断模型：用Biomarker Pattern Software 5.0.2采用决策树算法计算 出多个变量变化对两样本的判别价值，确定最佳的诊断模型。
[0016] 进一步的，所述步骤(1)样品收集的方法为：胃癌组和慢性胃炎组在取材前一天晚 上临睡前清水漱口，之后不再进食任何食物和药物，于第二天晨起后漱口前采用非刺激性 唾液采集方式空腹取材，前5min内的唾液自然吞下后开始收集，收集到的唾液置于冰浴中 的15ml唾液离心管内，4°C下静置lh后，3000r/min、4°C下离心10min，冰浴上分装在lml的EP 管中，每管200μ1，于-80 °C冰箱冷冻保存备用。
[0017]进一步的，所述步骤(2)纳米磁珠预处理的方法为:①取WCX纳米磁珠50μ1加入到 200μ1的PCR管中，置于磁铁上孵育lmin，去除上清液;②再加入100μΙ的Wash Buffer洗脱 5min，在磁铁上孵育lmin，去除上清液，再重复步骤②操作一次，以洗脱干净，去除杂质，这 样质谱检测受到干扰的可能性会更少。
[0018] 进一步的，所述步骤(6)数据采集的方法为：用Ciphergen Proteinchip Software 3.2.1软件采集数据，纵坐标为峰强度，横坐标为蛋白质质荷比，收集数据的质荷比范围为 2000~25000m/z，信号收集位置40~60,平均每点收集20次，收集总点为100次，已知多肽标 准芯片标准，激光离子流0.5。
[0019] 进一步的，所述步骤（7)数据分析的方法为：对位于2000~25000m/z峰值，用 Biomarker Wizard软件过滤噪音;设置初始的噪音过滤值为5，二次信噪比为2，以10%为最 小阈值进行聚类，经上述数据预处理后，采用t检验比较所述胃癌组和所述慢性胃炎组唾液 蛋白质质谱数据，找出所述胃癌组和所述慢性胃炎组之间具有统计学意义的差异表达蛋白 质峰。
[0020]进一步的，步骤(7)中，所述胃癌与所述慢性胃炎组对比，设置P<0.05,并选取其 中两组蛋白质质谱数据比值比率>2的差异蛋白，所述胃癌组和慢性胃炎组之间具有统计 学意义的差异表达蛋白质峰有23个，其中有5个差异蛋白质峰表达下调，18个差异蛋白质峰 表达上调，所述23个差异表达蛋白质峰具体如下：
[0023] 进一步的，步骤(6)所述荷质比范围为2000~15000m/z。
[0024] 与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
[0025] 1)本发明将WCX结合MALDI-T0F-MS蛋白质学技术在方法学上具有高通量、高敏感 性、高特异性优势，其检测的标本可以是血液、尿液、唾液等人体各种体液。
[0026] 2)本发明应用WCX结合MALDI-T0F-MS技术分析胃癌与慢性胃炎患者唾液在蛋白质 组水平上的差异，发现了 23个具有显著性意义的差异蛋白质峰，经Biomarker Pattern Software 5.0.2系统软件筛选、采用决策树算法建立了由4267.09、6564.85、2138.14m/z三 个显著差异蛋白峰组成的鉴别诊断模型，经临床回代检验该模型的灵敏度和特异度分别达 96%和86%;对所建立的胃癌与慢性胃炎的鉴别诊断模型采用十字交叉法进行验证，结果 该模型的灵敏度和特异度分别为89%和75%，显示该模型对胃癌和慢性胃炎的鉴别具有较 高的诊断效率。
[0027] 3)本发明的技术方案说明唾液蛋白质组学无创伤分子诊断方法对于早期鉴别诊 断胃癌和慢性胃炎具有重要临床价值，值得进一步深入研究并在临床推广应用。
[0028] 当然，实施本发明的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
【附图说明】
[0029] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发 明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0030] 图1为本发明实施