一种动物组织中辛硫磷残留量的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种动物组织中辛硫磷残留量的检测方法，包括以下步骤：(1)待测样本先由经二氯甲烷洗脱，37℃氮气吹干后得到提取物；(2)将提取物溶于甲醇，再用0.45μm有机滤膜过滤得到提取物溶液；(3)以甲醇?水溶液作为流动相，利用高效液相色谱法进行检测，确定动物组织辛硫磷的残留量；待测样与现有技术中检测蔬菜水果辛硫磷残留量的方法相比，本发明采用高效液相色谱的方法，具有取样量少，检测时间短，操作简便等优点；本发明的检测结果准确，辛硫磷检测限为0.01mg/L，能够满足一般化学农药药物残留定量的要求。
【专利说明】
一种动物组织中辛硫磷残留量的检测方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种农药残留量的检测方法，具体涉及一种动物组织中辛硫磷残留量的检测方法。
【背景技术】
[0002]我国是一个农业大国，药剂防治在防控粮食作物重大病虫害的过程中发挥了重要作用。农药施用后绝大部分在自然环境中代谢、降解和迀移，但农药使用不当既可造成环境污染，也可引起农作物上的农药残留，并通过食物链蓄积和传递作用进入畜禽机体，从而导致畜禽产品农药残留，危害人类自身健康，造成一系列连续的不良后果。因而农药残留不仅影响到我国畜禽产品质量安全水平和出口贸易，更重要的是对人体健康带来了直接或间接的危害。目前，虽然我国已有了一套相对完善的食品卫生标准，但严重缺乏畜禽产品中有机磷、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类等农药残留的限量标准，特别是许多剧毒、高残留的农药没有制定限量指标。而截至目前，我国尚未系统开展畜禽产品中农药残留的基础性研究工作，缺乏畜禽产品中农药残留的风险评估数据的文献报道。而越来越多的作物，畜产品农药残留量超标的报道也提醒着我们:进一步加强动物组织中农药残留水平的监测也已刻不容缓。
[0003]辛硫磷(Phoxim)又称拜辛松、巴赛松、腈肟磷、仓虫净、倍腈松、肟硫磷、百吉、倍氰松、肟磷等，分子式:C12H15N2O3PS,是一种的高效、低毒、低残留广谱有机磷农药，在中性及酸性介质中稳定，在碱性介质中易分解；易光解，在无光照条件下残效期长。畜牧业中主要用来防治牛羊猪兔等动物的疥癣病，驱赶体表寄生虫。因此，该农药的残留对于动物生产以及畜牧产品生产有着较大的影响。
[0004]现有技术中，对于辛硫磷残留量的检测，主要在水、作物、蔬果等中进行，国家标准方法是，将样本用石油醚(或石油醚/丙酮)避光浸提12小时左右，洗涤抽滤或回流处理，滤液中加硫酸钠水溶液，再用石油醚萃取，浓缩获得样品；含有辛硫磷的样品在富氢焰上燃烧，以氢磷氧(HPO)碎片的形式，放射出波长526nm的特征光，这种特征光通过滤光片选择后，由光电倍增管接收，转换成电信号，经微电流放大器放大后，分别记录标准和样品的峰高，以外标法定量样品的含量。该方法取样量较大、操作过程复杂、检测时间长，难以快速获得检测结果。并且，目前也尚未有对于如SD大鼠，猪等动物体内的辛硫磷残留量进行检测的报道。
[0005]由于SD大鼠等试验动物对化学农药比较敏感，其摄入不同含量农药中毒以后的症状比较相似，所以不能根据病症来进行诊断。因此，为了准确判定化学农药中毒后动物体内农药的残留量，迫切需要探索一种可行的、简便的化学农药检测方法。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种动物组织中辛硫磷残留量的检测方法。
[0007]为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是:一种动物组织中辛硫磷残留量的检测方法，包括以下步骤:
[0008](I)待测样本先由经二氯甲烷洗脱，37°C氮气吹干后得到提取物；
[0009](2)将提取物溶于甲醇，再用0.45μπι有机滤膜过滤得到提取物溶液；
[0010](3)以甲醇-水溶液作为流动相，利用高效液相色谱法进行检测，确定组织中辛硫磷残留量。
[0011 ]本发明还具有如下技术特征:
[0012]1、如上所述的待测样本选自SD动物的肠道组织、肝脏组织、肾脏组织或肌肉组织中的一种。
[0013]2、如上所述的步骤(2)中对应每0.1g组织样品提取物所使用的甲醇的用量为lml。
[0014]3、如上所述的步骤(3)利用高效液相色谱分析法得到辛硫磷残留量的方法是，将辛硫磷标准品稀释成不同浓度的溶液，经高效液相色谱分析获得不同浓度相对应的峰面积，制备标准曲线，对待测的提取物溶液进行高效液相色谱检测，获得其辛硫磷对应峰的峰面积，与标准曲线对比获得样品的辛硫磷残留量。4、一种SD大鼠的组织中辛硫磷残留量的检测方法，步骤如下:
[0015]步骤(I):取待测组织样本0.lg，在液氮中充分研磨，转移至含有1.5-2.0g硅藻土 /三硅酸镁的研钵中继续研磨;将两张快速定量滤纸折叠好至于漏斗上，用回形针固定;将研钵内混合物倒入滤纸中，量取8-lOml二氯甲烷，洗脱滤纸内混合物1-2次;再取2-5ml二氯甲烷冲洗研钵，将滤液与洗液一并倒入滤器中，收集滤液，将滤液在37°C氮气条件下吹干，
[0016]步骤(2):每0.1g组织样品提取物加入Iml甲醇，漩涡振荡10s，收集溶液，将溶液过0.45μπι有机滤膜，待测；
[0017]步骤(3):将纯品的辛硫磷标品稀释成不同浓度的溶液，经高效液相色谱分析获得不同浓度相对应的峰面积，制备标准曲线，对待测的提取物溶液进行高效液相色谱检测，获得其辛硫磷对应峰的峰面积，与标准曲线对比获得样品的辛硫磷残留量。
[0018]5、如上所述的待测样本选自SD大鼠的肠道组织、肝脏组织、肾脏组织或肌肉组织中的一种。
[0019]与现有技术中检测蔬菜水果辛硫磷残留量的方法相比，本发明采用高效液相色谱的方法，具有取样量少，检测时间短，操作简便等优点;本发明的检测结果准确，辛硫磷检测限为0.01mg/L，能够满足一般化学农药药物残留定量的要求。
【附图说明】
[0020]图1是本发明实施例提供的辛硫磷标准品液相色谱图。
[0021]图2是本发明实施例提供的空白组织样品液相色谱图。
[0022]图3是实施例中辛硫磷内标样品液相色谱图。
[0023]图4是实施例中辛硫磷添毒样品液相色谱图。
[0024]图5是本发明实施例提供的不同浓度辛硫磷标准品与测试的峰面积之间的关系曲线图。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实施例对本发明作进一步描述:
[0026]实施例1
[0027]动物肝脏组织中的辛硫磷残留量的检测方法
[0028](I)材料及设备:
[0029]动物品种选用SD大鼠。农药采用辛硫磷标准品(色谱纯，Sigma公司产品，编号:14816-18-3 )，甲醇(色谱纯，Sigma公司产品，编号:67-56-1 )，二氯甲烷(分析纯，天津富宇公司产品)。
[0030]高效液相色谱仪为美国WATERS公司产品(WATERS 6000)，包括WATERS2487紫外检测器;色谱柱0DSC18为PG instruments Ltd公司产品。
[0031](2)给药及采样:
[0032]采用常规饲养方法饲养，每日早8:00采用经口灌喂方式进行染毒，以大豆油为溶剂，染毒量为0.5mL，染毒浓度为180mg/kg.BW。每日称重I次，以调整灌喂量。每天I次，每周7天，共持续30d。灌喂后放回笼中，自由饮水，自由采食。在动物试验的第30d采血，进行实验室分析。取组织样品用生理盐水清洗后放于样品袋中，贴好标签并保存于-20°C冰箱。
[0033](3)样品处理
[0034]取SD大鼠肝脏组织样品0.10g，在液氮中充分研磨，转移至含有1.5-2.0g硅藻土 /三硅酸镁的研钵中继续研磨。将两张快速定量滤纸折叠好至于漏斗上，用回形针固定。将研钵内混合物倒入滤纸中。量取S-1OmL二氯甲烷，洗脱滤纸内混合物1-2次;再取2-5mL二氯甲烷冲洗研钵，倒入滤器中，一并收集滤液，37°C氮气吹干，将提取物溶于ImL甲醇，漩涡振荡1s，再用0.45μπι有机滤膜过滤，待测。
[0035](4)色谱条件的选择
[0036]流动相:甲醇-水溶液(体积比为3:1)，流速:1 mL/min，柱温:30°C
[0037]进样量:20yL，测定波长:280nm
[0038](5)辛硫磷标准液的配制
[0039]准确称取辛硫磷标准品0.0105g，用甲醇溶液定容至100mL，配制成105mg//L的辛硫磷标准液。将标准液贮存于棕色容量瓶中，4°(:保存。再用甲醇稀释成5.251^/1，1.051^/1，0.525mg/L，0.105mg/L，和0.0105mg/L 的标准溶液。
[0040](6)标准曲线与最低检测限
[0041 ]取各浓度标准工作液，经0.45μπι滤膜过滤，取20yL进样测定，每个系列进样3次，取平均峰面积值。以辛硫磷质量浓度X(mg/L)为横坐标，以相应的峰面积Y为纵坐标绘制工作曲线，求得线性方程。以响应值与浓度变化的增量确定仪器的灵敏度，根据3倍噪音与灵敏度之比计算药物的检测限。
[0042](7)分析方法评价
[0043]准确度指测定值(平均值)与真实值的接近程度，表示分析结果的正确性。采用标准添加法，在空白SD大鼠的肝脏、肠道组织中添加3个不同水平浓度的辛硫磷进行回收率试验。每个加标水平重复测定3次，同时作空白实验，以回收率大于95%为标准。
[0044](8)方法验证
[0045 ] 辛硫磷标准品色谱图参见附图1所示，从图中可以看出辛硫磷标准品在280nm下检测到的出峰时间是7.995min。
[0046]特异性分析
[0047]通过测定空白样品，辛硫磷内标样品及添毒样品的色谱峰来检测辛硫磷在样品中的出峰情况，辛硫磷在肝脏组织中的出峰情况如图2-4所示，结果显示，肝脏空白样品在Smin左右没有出峰(图2)，加标样品在8.135min有一个明显的峰，即辛硫磷样品峰(图3)。灌喂辛硫磷以后的肝脏组织样品，在8.053min处检测到辛硫磷峰(图4)。
[0048]如图5所示，为紫外检测器所检测到的峰面积与辛硫磷浓度的关系曲线，可见，辛硫磷在0.0105-5.25mg/L浓度范围内，辛硫磷的浓度值与响应峰面积值之间的相关系数为
0.9992，呈良好的线性关系。辛硫磷检测限为0.01mg/L，能够满足药物残留定量的要求。
[0049]样品加标回收率和相对标准偏差
[0050]采用标准添加法，在SD的肝脏、肾脏、肠道和肌肉组织中添加3个不同水平浓度的辛硫磷进行回收率试验，每个加标水平重复测定3次。根据上述处理方法，样品的回收率都大于95 %，相对标准偏差小于5 % ο回收率高，满足检测微量农药的需求，相对标准偏差较小，说明方法重现性好，是可以采用的。
[0051 ]肝脏中辛硫磷含量
[0052]肝脏中辛硫磷含量浓度为1.032mg/L。
[0053]实施例2:
[0054]去除肠道中内容物后的空肠组织辛硫磷残留量的检测方法
[0055]采用常规饲养方法饲养，每日早8:00采用经口灌喂方式进行染毒，以大豆油为溶剂，染毒量为0.5mL，染毒浓度为180mg/kg.BW。每日称重I次，以调整灌喂量。每天I次，每周7天，共持续30d。灌喂后放回笼中，自由饮水，自由采食。在大鼠试验的第30d采血，宰杀进行实验室分析。取空肠组织样品用生理盐水清洗后放于样品袋中，贴好标签并保存于-20°C冰箱。
[0056]取SD大鼠空肠组织样品0.10g，在液氮中充分研磨，转移至含有1.5-2.0g硅藻土 /三硅酸镁的研钵中继续研磨。将两张快速定量滤纸折叠好至于漏斗上，用回形针固定。将研钵内混合物倒入滤纸中。量取S-1OmL二氯甲烷，洗脱滤纸内混合物1-2次;再取2-5mL二氯甲烷冲洗研钵，倒入滤器中，一并收集滤液，37°C氮气吹干，将提取物溶于ImL甲醇，漩涡振荡1s，再用0.45μπι有机滤膜过滤，待测。进行高效液相色谱分析。
[0057]采用实施例一同样的方法进行检测，测得去除肠道中内容物后的空肠组织辛硫磷的浓度为2.086mg/L。
【主权项】
1.一种动物组织中辛硫磷残留量的检测方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)待测样本先由经二氯甲烷洗脱，37°c氮气吹干后得到提取物； (2)将提取物溶于甲醇，再用0.45μπι有机滤膜过滤得到提取物溶液； (3)以甲醇-水溶液作为流动相，利用高效液相色谱法进行检测，确定组织中辛硫磷残留量。2.根据权利要求1所述的一种动物组织中辛硫磷残留量的检测方法，其特征在于:所述的待测样本选自SD动物的肠道组织、肝脏组织、肾脏组织或肌肉组织中的一种。3.根据权利要求1所述的一种动物组织中辛硫磷残留量的检测方法，其特征在于:步骤(2)中对应每0.1g组织样品提取物所使用的甲醇的用量为Iml。4.根据权利要求1所述的一种动物组织中辛硫磷残留量的检测方法，其特征在于:步骤(3)利用高效液相色谱分析法得到辛硫磷残留量的方法是，将辛硫磷标准品稀释成不同浓度的溶液，经高效液相色谱分析获得不同浓度相对应的峰面积，制备标准曲线，对待测的提取物溶液进行高效液相色谱检测，获得其辛硫磷对应峰的峰面积，与标准曲线对比获得样品的辛硫憐残留量。5.—种SD大鼠的组织中辛硫磷残留量的检测方法，其特征在于，步骤如下: 步骤(I):取待测组织样本0.1g，在液氮中充分研磨，转移至含有1.5-2.0g硅藻土/三硅酸镁的研钵中继续研磨;将两张快速定量滤纸折叠好至于漏斗上，用回形针固定;将研钵内混合物倒入滤纸中，量取8-lOml二氯甲烷，洗脱滤纸内混合物1-2次;再取2-5ml二氯甲烷冲洗研钵，将滤液与洗液一并倒入滤器中，收集滤液，将滤液在37 °C氮气条件下吹干， 步骤(2):每0.1g组织样品提取物加入Iml甲醇，漩涡振荡10s，收集溶液，将溶液过0.45μπι有机滤I吴，待测； 步骤(3):将纯品的辛硫磷标品稀释成不同浓度的溶液，经高效液相色谱分析获得不同浓度相对应的峰面积，制备标准曲线，对待测的提取物溶液进行高效液相色谱检测，获得其辛硫磷对应峰的峰面积，与标准曲线对比获得样品的辛硫磷残留量。6.根据权利要求5所述的一种动物组织中辛硫磷残留量的检测方法，其特征在于:所述的待测样本选自SD大鼠的肠道组织、肝脏组织、肾脏组织或肌肉组织中的一种。
【文档编号】G01N30/02GK106018589SQ201610318041
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】单安山, 张婧, 宋文涛, 孙岳丞
【申请人】东北农业大学