芯片式高通量生物检测冷冻均匀进样方法
【专利摘要】一种芯片式高通量生物检测冷冻均匀进样方法，包括如下步骤：步骤1：将待测溶液充分搅拌均匀；步骤2：将搅拌混匀的待测液体置于与芯片匹配的容器中；步骤3：冷冻待测液体，获得固态冰片；步骤4：将固态冰片置于芯片上方，融化后实现液体均匀进入到芯片上的微型孔中。本发明人工参与少，不依赖复杂设备与平台，进样准确，效率高，均匀性好，尤其适用于数字化PCR检测等要求单模板的高通量微反应体系。
【专利说明】
芯片式高通量生物检测冷冻均匀进样方法
技术领域
[0001]本发明涉及芯片式高通量生物检测方法中样品导入领域，尤其涉及一种芯片式高通量生物检测冷冻均匀进样方法。
【背景技术】
[0002]在高通量生物检测中，将待检测物质均匀导入反应位点是整个检测的第一步。待检测物进入芯片微孔是否均一，占孔率的高低，单模板占孔数的多少，对于芯片的利用率、检测试验的成功率、检测结果的有效性都十分重要。
[0003]目前的进样方法主要包括手动刮液，微流控以及液滴喷打几种方式。各自的思路分别为:
[0004]手动刮液式:将液体滴注到芯片表面，用玻片刮匀，使溶液在玻片的压力之下逐步进入微孔。
[0005]微流控:通过设计带有微流控功能的芯片，通过外部压力及沟道导引使溶液进入芯片微孔。
[0006]液滴喷打:通过精细的微动平台及高精度喷头，精准生成微升级的液滴并喷打至芯片微孔。
[0007]现有几种方法分别存在以下问题:首先，手动刮液式进样方法对操作人员要求高，需要十分严谨的训练以及高度专注，同时难以保证进液效果，芯片污染乃至实验失败的风险高;其次，微流控芯片导流进样的方式会明显增加测试芯片的成本，且同样面临液体流动不畅导致实验效果被削弱的风险;最后，对于高精度液滴喷打的方式，需要依赖昂贵复杂的液体打印平台，难以在实际检测中广泛实施。
【发明内容】
[0008]本发明鉴于上述情况而做出，其目的是提供一种芯片式高通量生物检测冷冻均匀进样方法，该方法只需要简单的操作、利用自然的物理相变过程，准确有效地实现芯片微孔均匀进样。人工参与少，不依赖复杂设备与平台，进样准确，效率高，均匀性好，尤其适用于数字化PCR检测等要求单模板的高通量微反应体系。
[0009]本发明提供一种一种芯片式高通量生物检测冷冻均匀进样方法，包括如下步骤:
[0010]步骤1:将待测溶液充分搅拌均匀；
[0011]步骤2:将搅拌混匀的待测液体置于与芯片匹配的容器中；
[0012]步骤3:冷冻待测液体，获得固态冰片；
[0013]步骤4:将固态冰片置于芯片上方，融化后实现液体均匀进入到芯片上的微型孔中。
[0014]本发明的有益效果是，该方法只需要简单的操作、利用自然的物理相变过程，准确有效地实现芯片微孔均匀进样。人工参与少，不依赖复杂设备与平台，进样准确，效率高，均匀性好，尤其适用于数字化PCR检测等要求单模板的高通量微反应体系。
【附图说明】
[0015]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合实施例，对本发明进一步详细说明，其中:
[0016]图1是本发明的芯片式高通量生物检测冷冻式均匀进样方法操作流程图。
【具体实施方式】
[0017]应该理解的是，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
[0018]请参阅图1所示，本发明提供一种芯片式高通量生物检测冷冻均匀进样方法，包括如下步骤:
[0019]步骤1:将待测溶液充分搅拌均匀；
[0020]步骤2:将搅拌混匀的待测液体置于与芯片匹配的容器中；
[0021 ]步骤3:冷冻待测液体，获得固态冰片；
[0022]步骤4:将固态冰片置于芯片上方，融化后实现液体均匀进入到芯片上的微型孔中，所述冰片融化进入到芯片上的微型孔中，是常温融化自然进液。
[0023]本发明提供一种芯片式高通量生物检测过程中冷冻式均匀进样方法，只需要简单的操作，不依赖复杂设备与平台，进样准确，效率高，均匀性好，尤其适用于数字化PCR检测等要求单模板的高通量微反应体系。
[0024]图1是本发明的芯片式高通量生物检测冷冻均匀进样方法操作流程图。
[0025]如图1所示，一种芯片式高通量生物检测冷冻均匀进样方法，所述方法包括步骤:
[0026]步骤I，将待测溶液充分搅拌均匀。
[0027]通过溶剂对待检物质的充分溶解，使之均匀分布于溶液中，获得自然状态下理想的均一性。溶液体积根据芯片微孔的总容积进行配置，应控制在芯片总容积的90%以内。
[0028]步骤2，将溶液置于与芯片配套的容器中定型。
[0029]盛放溶液的容器需要具备与芯片形状相同的底面以及适当高度的垂直管壁，目的是将液体定型为与芯片形状相同的薄片。容器应当具备可拆卸的功能，或者有塑料膜等与容器隔离，方便拆取。
[0030]步骤3，将待测溶液冷冻，获得固态冰片。
[0031]通过冷冻的方式将溶液由液态转为固态。从而实现对待测物质的直接机械操作。
[0032]步骤4，将冰片置于芯片上方，融化后实现溶液均匀进孔。
[0033]通过自然融化使均匀固定在冰片中的待测物质随着液化而进入芯片微孔。
[0034]步骤4中，冰片的转移可以通过镊子直接夹取置于芯片上方。
[0035]步骤4中，通常采用室温将冰片温和融化，通过降低温度减慢融化速度可以使进样过程更加稳定。
[0036]步骤4中，如采用可拆卸或倒扣式容器，可将容器直接置于芯片上方。
[0037]实施例
[0038]均匀进样是数字化PCR检测的关键步骤。数字化PCR是一种核酸检测和绝对定量的新方法。同传统PCR以及qPCR相比，数字PCR增加了一步分液的操作，将已经配好的包含有引物、模板、buffer、酶等组分的PCR反应体系分隔成了众多微小的、独立的反应体系。在分配的过程中，引物、酶等组分过量，而模板则是不过量的。模板DNA分子随机地进入到各个小的反应体系中，经过PCR扩增后，包含模板的体系完成扩增，不包含模板的体系无扩增。模板DNA分子进入各个小的反应体系的过程满足泊松分布规律，因此，检测扩增PCR产物的信号强度，带入泊松分布公式计算，即可计算出起始模板DNA分子的拷贝数。在芯片式数字化PCR中，通过数以万计的芯片微孔实现分液，由于微孔数量巨大，可以将制备好的低浓度测试溶液分隔为单模板，确保真正的单分子扩增:即实现每个孔径中最多含有I个模板，每个位点中包含DNA模板数为O或I，实现真正意义的单分子扩增。扩增完成后对包含有PCR扩增产物的液滴计数，就可以直接得到DNA模板分子数，实现绝对定量。进样过程的均匀性是实现单模板的根本保证，同时也是决定数字化PCR实验成败的第一步。
[0039]本发明将能够在进行数字化PCR实验时，实现反应体系的分液过程自然而均匀，完成检测试剂的均匀进样，确保单模板数字化效果顺利实现。通过实际操作发现，进行数字化PCR实验采用本发明方法实现进样后，可以将试剂溶液以高度的均匀性填充至微孔中，形成一致性非常好的分液效果。
[0040]本发明的一种芯片式高通量生物检测冷冻均匀进样方法，适用于大量微孔位点的芯片式反应检测应用场合。尤其在超高通量生化检测问题中，一次检测采用的微孔数量达到数十上百万，如何保证均匀有效进样对传统手段而言挑战巨大。例如喷打的方式如果重复上百万次，出错几率极高。本发明的方法不受微孔数量影响，操作简便，可靠性高，无论芯片的孔距、尺寸、深度如何，一律可以用相同方式处理。对于更大通量的检测手段，如ISFET芯片，位点可达上千万，该方法优势更加明显。
[0041]应当理解的是，本发明的上述【具体实施方式】仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。
【主权项】
1.一种芯片式高通量生物检测冷冻均匀进样方法，包括如下步骤: 步骤I:将待测溶液充分搅拌均匀； 步骤2:将搅拌混匀的待测液体置于与芯片匹配的容器中； 步骤3:冷冻待测液体，获得固态冰片； 步骤4:将固态冰片置于芯片上方，融化后实现液体均匀进入到芯片上的微型孔中。2.根据权利要求1所述的芯片式高通量生物检测冷冻均匀进样方法，其中所述冰片融化进入到芯片上的微型孔中，是常温融化自然进液。
【文档编号】G01N1/42GK106018862SQ201610532200
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月7日
【发明人】刘元杰, 俞育德, 刘文文, 魏清泉
【申请人】中国科学院半导体研究所