专利名称：分析生物样品用的方法
技术领域：
本发明涉及一种分析生物样品用的方法，具体涉及一种用于分析组织样品，以便在早期检查期间识别良性或恶性组织改变，避免癌症发生的方法。
每年，全世界大约有660万人死于癌症。在工业化国家中，这种疾病是第二种最常见死因。尽管付出了巨大的财政和科研努力，不过当前还不可能在成功治疗肿瘤疾病上实现关键性的突破。从目前来看，只能通过癌症早期检查，病状预断和预防领域的创新解决方案来显著减小癌症发病率和死亡率。
早期检查和避免癌症用的一种有效方法是定期筛查。通过癌症筛查，可以发现已经存在肿瘤细胞但依然为良性组织变化的所谓“发育异常”。有些情况下，这些良性组织进一步发展为肿瘤，不过大多数情况下，它们萎缩或保持不变。使用当前应用的诊断方法不能对组织改变进行可靠的进展评估。
癌症筛查主要基于显微镜下对组织样品的细胞学和组织学分析。判读显微图像需要很大的技术能力和许多例行程序。数字图像处理和模式识别方法有时对应用而言极为复杂并且有时非常罕见的图像结果进行分类非常有利，因为它们是中性的，而且不依赖于观察者的主观敏感度。不过，迄今为止，通过基于灰度级图像的自动细胞分析方法还不能实现所需的分类可靠性。尤其是对于利用妇产科涂片(宫颈拭子)进行宫颈癌筛查，以及支气管分泌物样品的评价而言，自动方法已经开展，然而只能以非常有限的敏感度或准确性识别存在的肿瘤细胞。
在papanicolaou试验〔PAP(巴氏)试验；用于识别涂片标本中癌变前和恶性细胞的细胞染色方法〕之后利用该方法，在西方国家和日本可将宫颈瘤发病率减少大约70％。不过这种试验的明显缺陷在于不确定结果的发生率为5％到10％，而且假阴性结果为5％到50％。
因此，近几年已经研究出一系列新方法取代上面所述的PAP试验。
一种方法是使用自动薄层细胞制备技术，其中在只存在非常少量的特殊细胞材料时能更好地识别发育异常的细胞。美国FDA(食品及药物管理局)在1996年已经批准用这种方法来取代传统的PAP试验，据称根据临床研究结果，可以将发育异常发现率提高65％。
此外，计算机辅助图像分析方法已知主要用于当前较大规模的细胞学实验室中。与人工对拭子进行微观评价的PAP试验相比，该方法能客观评价细胞拭子。在美国的临床研究表明，这些自动方法导致假阴性结果降低。自从1998年以来，美国已经将所述试验批准为宫颈癌筛查的例行诊断法。
上述PAP试验的发展至少能部分消除传统方法的质量缺陷。不过它们与PAP实验本身一样，不能对发育异常进行可靠的进展评估。即使采用改进了的样品制备和自动分析，也必须进行重复和附加检查来确诊(diagnostic clarification)和检查发育异常。现在采用的传统图像分析方法在区分高度复杂和罕见图像结果时，与人工细胞分析相比具有两个显著优点，不过使用这些技术不能获得所需的分类可靠性。这些方法仅能以非常有限的灵敏度和准确性(小于70％)识别现有肿瘤细胞和发育异常。
在1996年提出了DAN检测，用于发现人乳头状瘤病毒来预防宫颈癌。一系列检查表明，感染人乳头状瘤病毒(HPV)与宫颈疾患和宫颈癌的发生存在密切的线性关系。HPV可作为大约99％的全部发病宫颈癌和超过90％重度初级阶段的证据。在西方工业化国家中，将HPV特征(typification)视作对轻度和中度发育异常妇女的附加的诊断检查。不过，用于防治宫颈癌的HPV试验的问题在于其假阳性率相当高。高达80％的妇女在其一生中会被感染HPV，不过全部妇女中仅约2到4％实际上具有发育异常，并且这些妇女中仅大约1到2％患有宫颈癌。
此外，现有技术中已知有一种膀胱癌识别方法，该方法基于NMP技术(核基质蛋白质技术)。NMP存在于上皮组织的细胞核中，并且膀胱癌患者体内NMP的量显著增多，可通过特殊抗体证明在尿中NMP的存在。临床研究的结果表明，NMP技术可以以比传统PAP试验高得多的灵敏度证明宫颈发育异常和宫颈肿瘤。
另一种预防宫颈癌的方法是识别发育异常细胞和肿瘤细胞中过量存在的特殊蛋白质标记。还不了解与该方法有关的临床研究结果。
在PAP试验发展的同时，HPV特征和蛋白质标记也有助于提高宫颈筛查细胞学的质量。不过，这些活体外部诊断方法均不能对肿瘤内细胞的发展作出客观的进展评价。从而为了安全的原因，不可避免地在持久或渐变疾患中进行附加和反复检查以及外科手术。
在EP0 647 844A中，描述了一种交互式自动细胞学方法，其中一自动系统和一手术员同时进行诊断，并在最后一步将系统诊断结果与手术员诊断结果进行比较。该方法的缺点在于，所作的诊断依然必须由手术员进行。在美国专利5,7557,954和5,978,497中，详细描述了一种自动分割代表生物样品的图像，根据预先确定的特征对各个物体进行分类的方法。
在DE 19747415A1中，描述了一种生物样品的简化分析方法，细胞学者通过从样品中确定在诊断上重要的材料，并确定该材料通过样品的“路径”，使观察者仅需要观察相关的样品。
除了上面所述的与细胞检查有关的公开以外，现有技术中对于数字图像处理系统也已经熟知，在DE 19834718A1，DE 19612465A1和DE 19538004A1中描述了数字图像处理系统。这些专利涉及一般的图像检测和分类系统，不过对于用于检查可能发生良性或恶性变化的生物样品的检查而言，不能保证足够的分类可靠性。
根据上述现有技术，本发明的目的在于提供一种改进的自动方法，用于可靠地分析生物样品，以便可靠和快速地识别相对健康样品发生的良性或恶性改变。
根据权利要求1所述的方法实现这一目的。
本发明提供一种用于分析生物样品以确定相对健康生物样品的改变的方法，该方法包括以下步骤以第一采集方式产生该生物样品的第一图像；以第二采集方式产生该生物样品的第二图像；利用第一预定参数将第一图像分类，且第一图象独立于第二图像进行分类，以及根据所述分类结果，判断该生物样品是否包括相对健康生物样品的改变。
在本发明的最佳实施例中，提供一种免疫细胞学方法，它能确定无误地识别肿瘤细胞，并预测肿瘤细胞中发育异常细胞的发展。
此处，本发明基于这样一种创新概念，其中将作为首次形态测量(通过测量检测出)的细胞图像信息与有关氧化DNA损伤程度的信息相结合，在肿瘤细胞中和将要转变成肿瘤细胞的癌前细胞中该氧化DNA损伤的程度显著增大。对透射光借助显微镜获得形态测量图像信息。通过测量从特别被束缚到有限DNA损伤(8-氧代鸟嘌呤)上的抗体发出的荧光信号，用荧光显微镜测定各个细胞中的DNA损伤量。
本发明的优点在于，与现有方法相比显著增加图像信息，与基于新知识的可训练的图像评价方法结合，从而研究出一种迄今对于分类可靠性和应用灵敏度而言无与伦比的程序上的技术(a proceduraltechnique)。
根据最佳实施例，本发明的方法用于分析涂片(宫颈拭子)。随着对此样品分析的进展，进行对这些样品的最佳重现过程，在此期间去除粘液，细胞在载体或载玻片上切成小片，利用抗体进行可高精度重现的制备和处理。从而，在本实施例中，获取高质量的显微透射光、颜色对比度和荧光图片，利用计算机辅助图像评价系统在显微成像图片中自动识别发育异常或肿瘤疑似细胞及其病状预断。
本方法的优点在于，不仅能系统、数字化地检测和编档保存载玻片上的图像信息，而且与资深医务人员的主观熟练程度有关的结果被客观计算机辅助元件所取代。
本发明不限于检查涂片，也可以转用于早期检测其它类型癌症，如膀胱癌、乳房癌、肺癌和甲状腺癌， 以及恶性排出物(discharge)等。
从下面结合附图的说明，显然可以看出本发明的这些和其他目的以及特征，其中
图1为本发明方法的第一实施例的示意图；以及图2A和B更详细表示图1中所示实施例的各步骤。
在随后更详细陈述本发明的最佳实施例之前，下面再次说明本发明的一般特性。
识别肿瘤细胞的一种可能性在于检测其氧化DNA损伤。肿瘤细胞与相应正常组织相比一般具有更高的氧化DNA损伤。可以从一系列有关诱变基质(mutagenic base)损伤8-氧代鸟嘌呤含量，和肿瘤以及胃肠道和肺、前列腺、大脑、卵巢、乳房等正常组织中其他氧化DNA变化的公开文献中看出这一点，如Olinski等人(1992)FEBSLett.309，193-198；Jaruga等人(1994)FEBS Lett.341，59-64；Musarrat等人(1996)Eur.J.Cancer 32A，1209-1214；Malins等人(1996)Proc.Natl.Acad Sci.USA 93，2557-2563；Matsui等人(2000) Cancer Lett.151，87-95。甚至在白血病细胞中也已经发现8-氧代鸟嘌呤量增大〔Senturker等人(1997)，FEBS Lett.，416，286-290〕。持续发生这种伤害则导致在目标组织(例如肿瘤组织)的细胞DNA中形成确定的突变图案，一般为氧化DNA损伤，例如如Moriva(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，1122-1126；Reid等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，3904-3907；Du等人(1994)Mol.Carcinog.，11，170-175；Turker等人(1999)CancerRes.，59，1837-1839中所述。
进一步的研究表明，不仅在肿瘤中，而且在癌症前组织中8-氧代鸟嘌呤值增高〔Musarrat等人(1996)Eur.J.Cancer 32A，1209-1214；Olinski等人(1995)Free Radic.Boil.Med.，18，807-813〕。因此，在癌症早期阶段已经发生氧化DNA损伤，并且有可能是癌症细胞发展的结果。动物试验检查已经证实了这种假设。实际上，如Driscoll等(1995) Exp.Lung Res.，21，941-956；Nehls等(1998)Environ.Health Perspect.，105 Suppl.5，1291-1296中所述，8-氧代鸟嘌呤含量增大的形成和持续发展与肿瘤的产生之间存在因果关系。除了该观察结果以外，该试验提供了三个随后提出的重要信息(a)长时间氧化DNA损伤的发生引起肿瘤的产生。
(b)氧化DNA损伤持续很长时间直至癌症产生为止。测定出对于妇女而言，从早期恶性初期阶段(TIN III)发展成宫颈肿瘤，平均为16年〔Forsmo等人(1997)Int J.Cancer，71，4-8〕。
(c)氧化损伤必然发生于可分细胞的DNA中。仅在这些细胞中，在DNA复制过程中损伤转变成突变，并传递给子细胞。
因而，氧化DNA损伤程度可以用于-识别现有肿瘤细胞，或-如果发育异常将发展成肿瘤，则给出预测。
此外，本发明的方法需要使用根据一实施例的免疫细胞化学方法对样品进行复制。迄今免疫细胞化学方法仅以有限的方式用于诊断中，这是由于下述两个原因。与石蜡埋入组织的免疫细胞化学检查不同，以标准方式实施免疫细胞化学更加困难，并且免疫染色细胞制备的质量具有很大的波动性。另外，在免疫细胞化学染色的各个培养阶段之后，很大程度地妨碍了细胞的形态学。根据本发明，采用一种可保证免疫细胞化学染色质量并且其复制符合标准的方法，以使被处理细胞的形态学保持更加良好的状态，并以可靠方式对图像进行评价。在取出细胞之后通过立即尽可能早地提供样品或使细胞制备的定位(fixing)最佳，以及调整的Papanicolaou或Pappenheim染色与免疫细胞化学结合，可获得更好和更标准的结果。从而实现对样品的最佳复制和细胞染色，因此能更加可靠地执行传统透射光显微观察和自动评价方法。
在图1中，表示根据本发明方法的第一实施例的示意图。左列方块中表示各处理步骤，与左列平行在右列中表示出各步动作的相应项或要素。
根据所示实施例，本发明的方法大体分成第一子步骤I和第二子步骤II。
在子步骤I中，在步骤100首先扫描样品阵列102。该样品阵列102包括多个单个样品104，步骤100从阵列102中选择出生物样品104’，如箭头106所示。在选择出单独样品104’之后，在步骤108中对与样品104’有关的一幅图像进行分析，下面将对其进行进一步说明。
从分析所述一幅图像的结果开始，判断该生物样品104’是否为疑似肿瘤。如果肯定答复为肿瘤疑似，则根据图1中所示的实施例，该方法转到第二子步骤II，其中在步骤110首先分割所述单幅图像，以便产生具有单株细胞的子图像，如图1中112示意地表示具有两个单株细胞114和116的子图像。如箭头118所示，在所示例子中，选择出细胞114，并在步骤120中对所述疑似细胞114进行分析。根据分析结果，可以断定该肿瘤疑似细胞是否真的是已经存在的肿瘤细胞，还是良性或恶性发育异常。
根据本发明的方法，根据预分类参考数据组通过迭代方式确定数学特征算符(mathematical feature operator)，以对所检测到的生物样品图像进行分类。通过将具有各显著特征类型的样品区分开，能确定所伴生各组算符。如果彼此正交的算符确实与感兴趣的特征类型有关，则可以在图像数据组中对其实现区分。
在迄今已知的自动细胞学和血细胞计数方法中，根据反复试验原则确定用于提取结构和形状特征的算符。这种方法的最大局限性在于，其非常复杂并且必须在变化的情况下识别特定图案。由此，问题在于对随机参考样品尝试多个算符，用来确定与识别目标的关系，由于搜索空间的尺寸较大导致计算时间需要数年。由于在细胞分析中模式识别工作极为复杂，并且其形式多变，故此处需要一种新型方法，如本发明所教导的。在所能得到的有限计算能力和实际计算时间的限制条件下，从现有的算符库(operator library)中选择有助于获得最佳分类结果的算符。
根据上面基于图1描述的实施例，在子步骤I和子步骤II中进行该选择。
在子步骤I中，将所选择的算符全部施加给图像104’的层次(Level)，其中通过该图像104’，可以理解细胞学者通过其显微镜的目镜可以将一个单元视作一个整体，不过可能处于不同的放大倍数。由正常细胞学样品，根据放大系数，可以存储12到500幅这类图像。可以对彼此不同方式的图像，如透射光、相衬和荧光，以及不同细胞类型(宫颈，膀胱，肺等)独立地进行自动参数选择。在足够可靠的预分类图像随机样品中，产生良好的选择结果。
在子步骤II中，在存在疑似细胞时，随后分割该对象并对具有最大分辨率的单细胞层次进行辅助分析。此处，检测细胞的尺寸、形状和结构特征，其中此处依然采用质地参数选择的方法。此外，确定形态参数。
根据本发明，将细胞学者和细胞学助理在检查和评价显微组织学结果时的长期经验，与在选择用于分类细胞的细胞图像和细胞参数时的自动参数选择的更客观方法结合。由于用于选择理想参数的完全、最佳搜索需要数年的计算时间，故将现有专业知识在语法和语义上统一为自动选择—结合加权函数。
从而，获得下述优点-在几个学习阶段，在大预分类随机样品的基础上进行参数选择。可以将用于优化的变量重新训练并保存成配置文件。
-通过建立多个结构数据集合，可以利用分类系统检查不同的细胞学试液(宫颈，膀胱，肺，...)，并且可以修改所需算法。从而，分类系统不再局限于一种用途，而能处理大多数细胞学和组织学检查任务。
在图2中，更加详细地表示出根据图1描述的本发明的实施例。从具有众多单个样品104的样品阵列102中选择单一样品104’进行分析。
关于此单一样品104’，产生其三个子图象，如方块DL，PK和FL所示。通过第一采集方式即显微透射光采集方式(DL)产生第一子图像。通过相衬(PK)采集方式获得第二子图像，通过荧光(FL)采集方式获得第三子图像。利用所选定的参数集合，如方块K1，K2和K3所示，将所获得的各个子图像DL，PK，FL彼此分开分类。根据各个子图像的分类，对每个子图像产生相应的分类结果，如方块E1，E2和E3所示。在步骤122中，根据结果E1，E2和E3判断样品104’中是否存在相对健康样品的改变。如果回答为否，则根据所示实施例，在步骤124结束该方法。如果作肯定答复为样品中存在例如肿瘤疑似改变，则该方法转到图2B中的步骤126。在步骤126中，进行上面早已描述的样品104’的分割，使样品被分成大体上包括一个细胞或仅包括个别细胞的单个区域，如图2B中128、130和132示意性所示。
对于每个部分128到132，或者对于具有个别细胞的每个子图像，依次产生上面已经描述的透射光、相衬、荧光(DL，PK，FL)三种采集方式中的子图像，如图2B中的相应方块所示。然后对各子图像进行分类，如图2B中的方块K所示。如上所述，此处在彼此无关的不同采集方式中也对各子图像进行分类，获得相应的分类结果(参见方块E)。
根据各部分或子图像的分类结果，对细胞或一些细胞进行相应诊断134、136、138，用于在步骤140中诊断整个生物样品。
在图2基础上描述的更加详细的实施例，首先包括对图像层次进行预分类，如图2A中所示。对于每个被检查样品104，产生三幅单个图像，利用透射光(DL)、相衬(PK)和荧光(FL)采集方式获得这三幅图像。首先根据图像层次将这三幅图像彼此分开进行分类，即每一个图像一个分类。此处，使用一种经过扩展和改良的自动质地分析方法，其扩展在于补充结合以对于细胞学制备极其需要的质地方法。此外，给出了本领域专业知识的结合。根据本发明，由所存储的大约600到1,000个质地参数(颜色，统计，质地，形状参数)中实现对于这些分类任务而言必须和足够的自动参数选择。通过明智的选择，由代表性的图像随机样品决定所需参数，其中所选择参数的质量、意义和分割锐度对于分类尤其重要。对于每种采集方式(DL，PK和FL)，彼此独立地确定针对分类其自身的参数集合。
随后，在步骤122中，将从几种采集方式产生的预分类结果相关。将三种采集方式的独立分类结果K1，K2，K3彼此相关，以判断该生物样品104’被认为是健康还是肿瘤疑似的。相应地通过适当选择判断边界，通过这种预分类方法可以高度可靠地将大约75％的样品剔除为非肿瘤疑似的。在图2B所示的后续步骤中，所有被认为是肿瘤疑似的样品在细胞水平(cell level)上经历另一个分类阶段。
在图2B中，在步骤126，首先进行细胞分割。为了更详细地检查所有肿瘤疑似图像样品并对其进行精细分类，首先从这些图像样品中分割单株的细胞。对所有三幅图像再一次进行细胞分割，分别提取出DL，PK和FL。这种分割的结果形成作为最小单元的图像扇区—理想情况下，每个扇区一株细胞。通过在运转过程中相适应地制备样品，可保证能观察到仅仅几个细胞聚集，即细胞重叠。
随后，将所分割的细胞分类。首先通过上述方法分别对每株细胞分类，此处也使用基于认识的参数选择。在细胞水平上，不仅使用颜色、质地和统计参数，而且还考虑所分割细胞的形状参数。此处，从所存储的600到1,000个描述性的细胞参数中通过智能选择，也可以高度可靠地区分不同采集方式中呈现出的细胞类型而进行选择。
随后，结合分类结果进行判断。首先分别对每种图像方式进行细胞水平分类，然后必须记录所分割的三幅视图的细胞并对分类结果进行处理，以实现鉴别诊断。
在上述实施例中，由第一主步骤中通过简单分割产生的子图像，或者在第二部分中对样品的相应分割和重新产生图像，可获得对于所分割细胞的不同采集方式的子图像。
此外，应该理解根据本发明的方法不限于所述最佳实施例。根据本发明的方法更确切地说能分析生物样品以判断这些生物样品是否相对健康组织发生改变。自样品的这种分类开始，只要需要还可以进行多种可能的进一步分析。对于某些应用而言，这足以判断样品中相对健康组织或健康样品发生的变化。
在其他应用中，例如半自动分析方法，可将全部样品提供给细胞学者，其中仅材料中具有相应疑似改变的单一样品需要进一步检查，然后细胞学者将进行最终的评估。
第三种可能性在于全自动，上面已经根据附图对其进行了描述。
权利要求
1.一种用于分析生物样品(104’)，以确定其相对健康生物样品发生的改变的方法，包括以第一采集方式(DL)产生该生物样品的第一图像；以第二采集方式(PK)产生该生物样品的第二图像，所述第一采集方式与第二采集方式彼此不同，并且所述第一采集方式和第二采集方式是从包括透射光采集方式、荧光采集方式和相衬采集方式的一组采集方式中选择出来的；根据第一预定参数将所述第一图像分类(K1)；根据第二预定参数将所述第二图像分类(K2)，且第一图像独立于第二图像地进行分类；以及根据分类结果(E1，E2)，判断该生物样品(104’)是否包括相对健康生物样品的改变(122)。
2.如权利要求1所述的方法，包括以第三采集方式(FL)产生该生物样品(104)的第三图像；和根据第三预定参数将所述第三图像分类(K3)，且所述第三图像独立于第一图像和第二图像地进行分类。
3.如权利要求1或2所述的方法，在判断生物样品(104’)的改变时包括如下步骤，以便判断该生物样品的变化是良性还是恶性的设定(126)该生物样品(104’)的至少一部分(128，130，132)，该部分基本上包括一个元素或基本上为单个的各元素；以第四采集方式产生该部分生物样品的第一子图像(DL)；以第五采集方式产生该部分生物样品的第二子图像(PK)；根据第四预定参数将所述第一子图像分类(K)；根据第五预定参数将所述第二子图像分类(K)，且第一子图像独立于所述第二子图象地进行分类；以及根据分类结果(E)，判断该生物样品的改变是良性还是恶性的。
4.如权利要求3所述的方法，包括以第六采集方式产生该部分生物样品的第三子图像(FL)；和根据第六预定参数对所述第三子图像进行分类，且第三子图象独立于第一子图像和第二子图像地进行分类。
5.如权利要求3或4所述的方法，其中该生物样品包括多个细胞，且所述第一子图像、第二子图像和第三子图象大体上包括一个细胞或基本上包括单株的各细胞。
6.如权利要求1到5其中之一所述的方法，其中所述第一采集方式、第二采集方式、第三采集方式、第四采集方式、第五采集方式和第六采集方式，是从包括透射光、相衬和荧光的组中选出的，且其中所述第一预定参数、第二预定参数、第三预定参数、第四预定参数、第五预定参数和第六预定参数，是从包括细胞尺寸、形状、结构、颜色、质地和统计特征，形态数据和细胞氧化损伤数据的组中选出的。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述第一采集方式和第四采集方式为透射光采集方式，所述第二采集方式和第五采集方式为相衬采集方式，所述第三采集方式和第六采集方式为荧光采集方式，其中对于每种采集方式，均由用于分类的预定参数组彼此独立地确定一个参数集合。
全文摘要
本发明公开了一种用于分析生物样品(104’)的方法，用于确定其相对健康生物样品发生的变化，该方法包括以第一采集方式(DL)产生该生物样品的第一图像，并以第二采集方式(PK)产生该生物样品的第二图像。根据第一预定参数对所述第一图像进行分类(K
文档编号G06T1/00GK1522362SQ02813262
公开日2004年8月18日 申请日期2002年5月14日 优先权日2001年5月18日
发明者罗伯特·史密特, 托马斯·维顿博格, 海恩兹·格豪泽, 克劳斯·斯宾勒, 斯宾勒, 格豪泽, 维顿博格, 罗伯特 史密特 申请人:弗兰霍菲尔运输应用研究公司