专利名称:一种过量表达pbd-2基因的转基因猪的培育方法
一种过量表达PBD-2基因的转基因猪的培育方法技术领域：
[0001]本发明涉及生物医药技术和抗病育种领域。具体涉及一种具有抵抗动物细菌性疾病的转基因猪的培育方法，通过手工体细胞核移植技术制备过量表达猪源β防御素 2(porcie beta-defensin 2, PBD-2)基因的转基因猪。
背景技术：
[0002]抗菌药物在人类和动物疾病的临床治疗中起重要作用，但是由于抗菌药物的广泛和不合理应用，导致病原菌对人类和动物使用的各种抗菌药物日益耐受，出现了非常严峻的细菌耐药局面，以致于有些细菌性疾病几乎无有效药物可以控制。细菌耐药性的产生，引起了全世界各界的广泛关注，被世界卫生组织认为是21世纪最大的公共卫生安全问题之ο[0003]据估计，近年来动物使用抗生素的量是全球抗生素使用总量的一半以上，许多人认为动物食品中的耐药菌是人体内耐药菌的来源之一(Jensen LB, Hammerum AM, Bager F， Aarestrup FM Streptogramin resistance among Enterococcus faecium isolated from production animals in Denmark in 1997.)，在动物食品中细菌耐药性问题已成为公共卫生高度关注的问题。因此，新型的抗病方法，加快抗病育种研究具有重要而现实意义。[0004]抗病育种是一项复杂的系统工程，从遗传素质上来提高动物对病原的抗性，并结合免疫接种来控制动物的疾病。但是常规抗病育种技术对抗病等复杂性状的分析较困难、 选择效率较低、育种周期较长，已不能满足当前养殖业对抗病品种的需求。随着胚胎学、 分子生物学和基因工程技术的不断进步，从上个世纪80年代开始，人们就开始尝试进行基因工程抗病育种，并成为了生命科学研究和讨论的热点。随着1974年Jaenish等首先利用显微注射法将猿猴病毒(SV40)的DNA注入小鼠胚泡获得40%整合外源基因的子鼠后，1980年Gordon报道用DNA显微注射法获得了转基因小鼠(Gordon Jff, Scangos GA, Plotkin DJ, Barbosa JA, Ruddle FH :Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 1980,77(12) :7380-7384)； 1982年，美国科学家I^lmiter首次将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵的雄性原核中，获得了转基因小鼠，其个体比对照鼠增大一倍，被称为“超级鼠”(Palmiter RD,Brinster RL, Hammer RE, Trumbauer ME, Rosenfeld MG, Birnberg NC, Evans RM Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion genes. Nature 1982,300(5893) :611-615) ； 1994 年 Clements 等将 Visna 病毒的衣壳当百基因转入绵羊，获得了抗病能力明显提高的转基因羊(Clements JE，Wall RJ, Narayan 0, Hauer D, Schoborg R, Sheffer D, Powell A, Carruth LM, Zink MC, Rexroad CE :Development of transgenic sheep that express the visna virus envelope gene. Virology 1994,200(2) :370-380) ；2005年Donovan等将编码溶葡球菌酶的基因转入奶牛基因组中，获得的转基因牛对牛葡萄球菌感染率仅为14%，仅为非转基因牛高达71% (Donovan DM，Kerr DE, Wall RJ-Engineering disease resistant cattle. TransgenicRes 2005，14(5) :563-567)。[0005]防御素是广泛分布于动物和植物界的一类富含半光氨酸的阳离子短肽，是机体自身防御系统的组成部分。哺乳动物的防御素主要由骨髓细胞或上皮细胞产生，有分子质量小、热稳定、水溶性好等特点，其抗菌谱十分广泛。并且由于抗菌机制特殊，细菌极难产生耐药性，是近年来一直是代替抗菌药物的首选。[0006]猪源β防御素2 (porcie beta-defensin 2，PBD-2)是一种主要分布于猪上皮细胞中的一种阳离子多肽，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有很好的杀伤作用(Veldhuizen EJA, Rijnders M, Claassen EA, van Dijk A, Haagsman HP :Porcine β -defensin 2 displays broad antimicrobial activity against pathogenic intestinal bacteria. Molecular Immunology 2008,45(2) :386-394 ; Sang Y, Blecha F: Porcine host defense peptides :Expanding repertoire and functions. Developmental & Comparative Immunology 2009,33(3) :334-343)[0007]本发明以猪PBD-2为研究对象，基于传统克隆技术，利用真核质粒pcDNA3. 1(+)/ PCA-PBD2的构建转染大白猪成纤维细胞，通过G418筛选，PCR与RT-PCR鉴定建立转基因 PBD-2细胞系。将所建立的转基因细胞系用于手工核移植，借助囊胚移植4头受体母猪，有 3头母猪受孕，通过mRNA等检测PBD-2基因表达证实获得过表达PBD-2的转基因克隆猪。 该转基因猪可用于研究PBD-2抗病的动物模型以及培育具有抗病性能的优良品种猪。
发明内容
[0008]本发明的目的是在于提供了一种用于表达猪PBD-2基因的转基因猪的培育方法， 方法易行，操作简便。克隆猪PBD-2基因后，将其插入到表达载体中通过细胞转染及细胞筛选技术筛选出过表达猪PBD-2的猪成纤维细胞；过表达PBD-2的猪成纤维细胞进行手工核移植于猪卵母细胞而获得重构囊胚，进而将阳性囊胚移植入受体母猪输卵管中，受孕母猪产仔后再进行阳性转基因猪鉴定，从而获得过表达PBD-2基因的转基因猪。该猪具有潜在广泛抗菌能力，为抗病育种研究提供良好素材。[0009]为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施[0010]一种用于表达猪PBD-2基因的转基因猪的培育方法，其步骤是[0011]1.稳定表达PBD-2基因的猪成纤维细胞系的构建[0012]1. lpcDNA3. 1 (+)/pCA_PBD2 载体构建与线性化参照 GenBank NM_214442. 1 基因序列，设计引物，提取猪肝脏组织RNA，反转录成eDNA后用设计的弓|物扩增获得PBD-2基因， 大小为216bp。通过EcoRI和BioI将获得的片段连接到真核表达载体pCAdnvitrogen， Amp+, 4713bp)中，从而获得载体 pCA_PBD2，大小 4898bp。再用 kpl 和 XhoI 将 pCA_PBD2 的表达盒切下克隆于真核表达载体pcDNA3. 1(+) (Invitrogen, neo+/Amp+, 5. 4kb)中，得到重组质粒 pcDNA3. 1 (+) /pCA-PBD2,大小 6379bp。最后，用 AccI 处理 pcDNA3. 1 (+) /pCA_PBD2， 纯化得到线性表达盒片段，大小4189bp。[0013]1. 2 细胞转染利用脂质体 Lipofectamine 2000 reagent (invitrogen)，将得到的片段转染从猪胚胎分离得到的大白猪成纤维细胞。[0014]1. 3细胞筛选及增殖转染后细胞培养液中，加入600 μ g/ml G418进行筛选，获得抗性单克隆细胞并扩大培养。进而通过PCR和RT-PCR法对获得的细胞进行鉴定，得到表达PBD-2的阳性细胞，用于后续实验。[0015]2.手工克隆[0016]2. 1受体细胞的准备按律波等方法制备受体细胞(律波等，一种猪卵母细胞体外培养成熟方法，专利公开号CN1014^492A)。从屠宰场收集猪的卵巢放置入生理盐水的容器内运输至实验室，将卵巢表面的卵泡戳破，使卵泡内的卵母细胞和卵泡液一起流出，用预热至38. 50C的洗卵液(碳酸氢钠0. 17mg/mL,丙酮酸钠0. 22mg/mL,赫佩斯钠盐3. 60mg/mL,赫佩斯酸 2. 63mg/mL, TCM-199 (IOX) 10% ν/ν,谷氨酰胺 0. 20mg/mL,两性霉素 B 3. 0 μ g/mL,肝素30IU/mL，2% ν/ν血清)轻轻洗涤卵泡，在显微镜下挑选颗粒细胞层多且致密，胞质均勻的卵母细胞，收集卵泡液中所有优质的卵母细胞。所得卵母细胞以40-50个为一个孔，移至在5% C02培养箱平衡6小时，内置400 μ L卵母细胞体外培养液(TCM-199 (IX)80% ν/ν, hCG 15IU/mL，PMSG 10IU/mL，谷氨酰胺 0. 10mg/mL，庆大霉素 0. 05mg/mL，猪卵泡液 10%，血清10% ν/ν)的四孔板中，38. 5°C,5% C02成熟36小时，用于克隆操作。[0017]2. 2去核以及核供体细胞的注射用5 μ g/mL柔红菌素作为去核试剂，处理体外培养成熟的猪卵母细胞10小时，灭活卵母细胞，使之无法进行RNA转录和合成蛋白。将成熟后的卵母细胞-卵丘复合体，用透明质酸酶消化卵丘细胞形成裸卵，便于进行显微操作。按照杜玉涛等人(杜玉涛等，一种细胞核移植方法，专利公开号CN101580828A)的描述将裸卵放入显微操作盘操作滴中，用固定吸液管从极体对侧固定卵母细胞，用外径20 25μπι的尖的去核管吸取少量1 μ L细胞质，进而吸取供核细胞，再将细胞质和供体细胞一起注入卵母细胞的卵周隙中，由此产生核移植胚胎。[0018]注射完成后通过BTX Electro-Cell Manipulator 200 (BTX, San Diego, CA)电细胞操纵装置产生30微妙，1. 8kV/cm的单向直流电脉冲使供体细胞和去核卵母细胞融合。用修饰的北卡大学培养基(North Carolina university 37 medium，参照 Kikuchi et al.， 2002)洗涤电融合的重组胚胎，转入％ig/mL牛血清白蛋白的NS⑶-37培养液滴中培养50分钟。在38. 5°C，5% ν/ν 02,5% v/v C02，90% ν/νΝ2培养箱中培养6天后，观察重组囊胚的发育情况。[0019]2. 3胚胎移植按照律波等(一种猪胚胎移植方法，专利公开号CN101427946A)方法进行胚胎移植。将培育好的囊胚移入代孕母猪的输卵管中，平均每头移植约98枚囊胚， 共移植4头母猪。胚胎移植4周后进行超声波检测以监控受孕母猪的妊娠情况。之后每隔一周进行一次检测，共检测6次。[0020]3.转基因猪鉴定[0021]小猪出生饲养至断奶后取其耳部组织，利用PCR等技术鉴定转基因阳性猪。[0022]基于上述方法，本发明人通过细胞转染和细胞筛选技术获得过量表达PBD-2基因的大白猪成纤维细胞作为核供体细胞，利用手工移植将核供体细胞移植到去核的受体胚胎中，产生过量表达PBD-2的重组胚胎；进而在体外培养到胚泡期并移植到受孕母猪的卵巢中，获得阳性克隆猪。[0023]本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果[0024]方法易行，操作简便，该猪是过量表达猪源PBD-2的转基因猪，不需要昂贵的仪器和尖端的技术人员，效率高而成本低，适合批量生产，为加快抗病育种提供了良好的素材。 并且，本发明首次构建出了过量表达PBD-2基因的转基因猪，该转基因猪能大量表达PBD-2基因，产生的蛋白具有广泛的抑菌活性，并且还对机体的自身免疫系统具有良好的调节功能，从而使该转基因猪具有潜在抵抗沙门氏菌、致病性大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌及产气荚膜杆菌等大部分细菌性疾病的能力，为抗病育种研究及培育提供了良好的素材，具有潜在的广谱抗菌的能力。
[0025]图 1 为一种 AccI 线性化 pcDNA3. 1 (+) /pCA_PBD2 示意图；[0026]AccI 线性化 pcDNA3. 1 (+) /pCA_PBD2 可得到大小为 2183bp 和 4189bp 两条带， 通过切胶回收的方法可以分离得到包含chicken β -actin promoter、PBD-2和BGH polyadenylation的表达盒的DNA片段，大小为4189bp。[0027]图2为一种显示了过量表达PBD-2的大白猪成纤维细胞阳性克隆筛选及鉴定示意图；[0028]其中A图是正常制备大白系猪胎猪成纤维细胞示意图；图B是转染PBD-2基因的大白系猪胎猪成纤维细胞，通过G418筛选获得阳性细胞克隆图；图C是阳性克隆细胞的 RT-PCR的鉴定图。[0029]图3为一种显示表达PBD-2的大白猪成纤维细胞核移植受体细胞后第6天囊胚示意图；[0030]将表达PBD-2的大白猪成纤维细胞作为供核细胞，通过手工移植于卵母细胞获得重组胚胎，体外培养6天后囊胚的形态图，直接用于移植受孕母猪。由A图和B图可见，大部分重组胚胎发育为囊胚且状态良好。[0031]图4为一种是PBD-2转基因受体母猪B超检测示意图；[0032]胚胎移植后用超声波对受孕母猪的妊娠情况进行检测评价，图中为部分B超检测图，由图可见受体猪受孕状况良好。[0033]图5为一种是PBD-2转基因猪PCR鉴定示意图；[0034]转基因小猪出生后提取组织提取DNA，取50ng为模板，NP03/NP04引物，PCR反应条件为:94°C，5min, 1 个循环；94°C，Imin, 58°C，Imin, 72°C，30s, 30 个循环；72°C，IOmin, 30 个循环。1.5%琼脂糖凝胶，140V，35min，EB染色15min结果。阴性为水和非转基因细胞系总DNA，取50ng为模板，阳性为pCA-PBD210ng质粒为模板。
具体实施方式
[0035]以下叙述是本发明实施方案的实施例。有关DNA和蛋白质的标准操作方法和所使用的药品均参考《分子克隆实验指南》所描述的内容(参见萨姆布鲁克和拉塞尔，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京，2001)。[0036]实施例1 [0037]一种转基因猪用猪β防御素2(porCie beta-defensin 2，PBD-2)基因的制备方法，其步骤如下[0038]1.猪β防御素2基因的获得[0039]根据GenBank ΝΜ_214442. 1基因序列，设计一对引物[0040]PBD2 01 CCGGAATTCATGTGGGCCCTCTGCTTG，其中下划线部分为 EcoRI 酶切位点；[0041]PBD2 02 :CCGCTCGAGTCAGGGTCAGCGGATGCA,其中下划线部分为 XhoI 酶切位点。[0042]从猪肝脏组织中提取RNA，首先反转录为cDNA，然后以此为模版进行PCR扩增以获得长度为234bp的目的DNA片段。PCR反应的体系和程序如下[0043]50 μ L反应体系包含5 μ L 10 XPCR反应缓冲液(购自宝生物工程大连有限公司)，5yL dNTP (各2. 5mM)，5yL特异性上游引物PBD2 01 (20 μ M)，5 μ L特异性下游引物PBD2 02 (20 μ Μ)，4 μ L模板，0. 5 μ LPrimeSTAR HS DNA聚合酶(购自宝生物工程大连有限公司)，加灭菌去离子水至50 μ L0 PCR反应参数和程序为94°C，5min, 1个循环；94°C， lmin, 56°C, lmin, 72°C, 30s, 30 个循环；72°C，lOmin，30 个循环。[0044]2.用于制备转基因猪真核表达载体pcDNA3. 1⑴/pCA_PBD2的构建[0045]扩增到的目标片段通过DNA回收试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)纯化后酶切，再经纯化后连接到真核表达载体pCAdnvitrogen，Amp+，4713bp)中得到含有 PBD-2基因的重组质粒pCA-PBD2，大小4898bp。再用kpl和XhoI将pCA_PBD2中的表达盒切下克隆于真核表达载体pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen, neo+/Amp+, 5. 4kb)中，得到重组质粒 pcDNA3. 1 (+) /pCA-PBD2,大小 6379bp。[0046]重组质粒pcDNA3. 1 (+) /pCA_PBD2大提后用AccI进行线性化处理，分离得到表达盒的 DNA 片段，大小为 4189bp。此 DNA 片段包含 chicken β -actm promoter,PBD-2 和 BGH polyadenylation的完整表达盒，用于细胞转染。[0047]实施例2 [0048]一种用于表达猪PBD-2基因的转基因猪的培育，其步骤是[0049]1.稳定过量表达PBD-2基因的大白猪成纤维细胞系的构建[0050]1. 1脂质体转染[0051]按照常规方法(《动物细胞培养技术与应用》，王捷主编，北京市化学工业出版社， 2004)，分离制备用作核供体细胞一大白胎猪的成纤维细胞。通过除去胎膜分离胎猪，用含抗生素的磷酸盐缓冲液将胎猪洗涤3次，然后除去胎猪的四肢、头部和内脏。用小剪刀机械方法磨碎组织，进而通过胰酶_EDTA(乙二胺四乙酸)37°C消化20分钟，制备成纤维细胞，用含 15% (ν/ν)胎牛血清(FCS,Gibco,Life Technologies Inc.)，1000 单位青霉素和 1000 μ g/mL链霉素的Dulbecco，s改良的Eagle's培养基(DMEM,Gibco,Life Technologies he.)扩大培养和冻存。[0052]按照脂质体Lipofectamine 2000说明书进行转染，将AccI线性化处理的 pcDNA3. 1 (+) /pCA-PBD2 转染猪成纤维细胞，5% C02，37°C培养。[0053]1. 2细胞筛选及增殖[0054]由于骨架载体 pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen, neo+/Amp+，5. 4kb)含有选择性标记的新霉素抗性基因，因而可以在特定的抗生素新霉素存在下通过体外培养选择转染了 PBD-2 基因的核供体细胞。在含有新霉素的培养基中，只有转染了该载体的细胞能够存活，没有转染的细胞由于新霉素的作用而死亡。转染PBD-2基因后，将核供体细胞培养3天，利用 600 μ g/ml G418连续筛选8天后，获得抗性单克隆细胞并扩大培养。进而通过PCR和RT-PCR 方法对获得细胞进行鉴定，得到过量表达PBD-2的转基因猪成纤维细胞，用于后续手工核移植制备重组囊胚。[0055]2.手工核移植方法获取重组囊胚[0056]受体细胞的准备[0057]按律波等方法制备受体细胞(律波等，一种猪卵母细胞体外培养成熟方法，专利公开号CN1014^492A)。从屠宰场收集猪的卵巢，在恒温(32 34°C )条件下运输至实验室，将卵巢表面的卵泡戳破，使卵泡内的卵母细胞和卵泡液一起流出，用预热至38. 5°C 的洗卵液(碳酸氢钠0. 17mg/mL,丙酮酸钠0. 22mg/mL,赫佩斯钠盐3. 60mg/mL,赫佩斯酸 2. 63mg/mL, TCM-199 (IOX) 10 % ν/ν,谷氨酰胺 0. 20mg/mL,两性霉素 B 3. 0 μ g/mL,肝素 30IU/mL，血清2% ν/ν)轻轻洗涤卵泡，在显微镜下挑选颗粒细胞层多且致密，胞质均勻的卵母细胞，收集卵泡液中所有优质的卵母细胞。所得卵母细胞以40-50个为一个孔，移至在 5% C02培养箱平衡6小时，内置400 μ L卵母细胞体外成熟培养液(TCM-199 (IX) 80% ν/ν, hCG15IU/mL, PMSF 10IU/mL，谷氨酰胺 0. 10mg/mL，庆大霉素 0. 05mg/mL，猪卵泡液 10%，血清10% ν/ν)的四孔板中，38. 5°C，5% C02成熟36小时，用于克隆操作。[0058]去核以及核供体细胞的注射[0059]用5. 0 μ g/mL柔红菌素作为去核试剂，处理体外培养成熟的猪卵母细胞10小时， 灭活卵母细胞，使之无法进行RNA转录和合成蛋白。将成熟后的卵母细胞-卵丘复合体，用透明质酸酶消化卵丘细胞形成裸卵，便于进行显微操作。按照杜玉涛等人(杜玉涛等，一种细胞核移植方法，专利公开号CN101580828A)的描述将裸卵放入显微操作盘操作滴中，用固定吸液管从极体对侧固定卵母细胞，用外径20 25 μ m的尖的去核管吸取1 μ L细胞质， 进而吸取供核细胞，再将细胞质和供体细胞一起注入卵母细胞的卵周隙中，由此产生核移植胚胎。[0060]注射完成后通过BTX Electro-Cell Manipulator 200 (BTX, San Diego, CA)电细胞操纵装置产生30微妙，1. 8kV/cm的单向直流电脉冲使供体细胞和去核卵母细胞融合。用修饰的北卡大学培养基(North Carolina university 37 medium，参照 Kikuchi et al.， 2002)洗涤电融合的重组胚胎，转入％ig/mL牛血清白蛋白的NS⑶-37培养液滴中培养50分钟。在38. 5°C，5% 02,5% C02,90% N2培养箱中培养6天后，观察重组囊胚的发育情况。[0061]3.胚胎移植以及转基因猪的培育[0062]3. 1胚胎移植[0063]按照律波等(一种猪胚胎移植方法，专利公开号CN 101427946A)方法进行胚胎移植，将代孕母猪人工保定，从阴门处向阴道内插入深宫输精管外管至其海绵头堵住子宫颈口，再向深宫输精管内插入长约1.5米地内置柔性细管至子宫角内。将发育至囊胚阶段的猪胚胎从内置的柔性细管外部开口处注入，由内置柔性细管引导进入子宫角，利用空气压力使其流入子宫内。[0064]于2011年4月沈日和27日分别移植2头受孕母猪，所用细胞系分别为转染细胞筛选得到的细胞系BD-111、BD-131、BD-129和BD-39，受体母猪分别编号为256、88、261和 146，平均每头移植约98枚囊胚。胚胎移植25天后用超声波对母猪的妊娠情况进行评价。 除了编号261的猪只外，另外3头母猪均成功受孕。以后每隔两周进行一次超声波检测仪监控受孕母猪的妊娠情况和胎猪的生长情况。3头受孕母猪顺利产下9头大白小猪。[0065]4.转基因猪的鉴定[0066]提取产下的9头大白小猪的基因组DNA，然后用NP03/NP04引物进行PCR扩增检测 PBD-2 基因是否插入基因组中(NP03 5 ‘ -GCTGGTTGTTGTGCTGTCTC-3 ‘，NP04 5 ‘ -AGGTCCCTTCAATCCTGTTG-3‘)。[0067]提取产下的9头大白小猪的RNA，反转录为cDNA后，用NP03/NP04引物进行PCR扩增检测PBD-2基因是否表达。[0068]结果表明，从9头小猪中有7头均扩出目的片段。[0069]以上结果表明通过核移植技术成功的获得了 7头转基因猪，目前小猪生长健康， 通过基因组和转录水平均已证实了转基因猪的PBD-2已成功整合到基因组中并且表达。[0070]尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由
发明内容
和具体实施方式
所示，另外，本领域的技术人员在
发明内容
和具体实施方式
的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明范围内。
权利要求
1.一种用于过量表达猪PBD-2基因的转基因猪的培育方法，其步骤是①pcDNA3.1 (+)/pCA-PBD2载体构建与线性化设计一对引物，提取猪肝脏组织RNA， RT-PCR扩增获得PBD-2基因，通过EcoRI和B10I将获得的片段连接到真核表达载体pCA 中，获得载体PCA-PBD2，通过kpl和XhoI双酶切pCA_PBD2和pCDNA3. 1⑴，通过连接酶连接得到pcDNA3. 1 (+) /PCA-PBD2，载体质粒大提后用AccI进行线性化处理，分离纯化得到线性表达盒片段，大小4189bp;②脂质体转染及细胞筛选为了构建稳定过量表达PBD-2的猪成纤维细胞，按照脂质体Lipofectamine 2000说明书进行转染上述制备的猪成纤维细胞，5% C02，37°C培养；转染PBD-2基因后，将核供体细胞培养2-4天，利用600 μ g/ml G418连续筛选8天后， 获得抗性单克隆细胞并扩大培养，通过PCR和RT-PCR方法对获得细胞进行鉴定，得到过量表达PBD-2的转基因猪成纤维细胞，用于后续手工核移植制备重组囊胚；③手工核移植方法获取重组囊胚a.受体细胞的准备制备受体细胞，从屠宰场收集猪的卵巢放置入生理盐水的容器内运输至实验室，将卵巢表面的卵泡戳破，使卵泡内的卵母细胞和卵泡液一起流出，用预热至 38. 5°C的洗卵液2% ν/ν血清洗涤卵泡，在显微镜下挑选颗粒细胞层多且致密，胞质均勻的卵母细胞，收集卵泡液中所有的卵母细胞，所得卵母细胞以40-50个为一个孔，移至在5% CO2培养箱平衡6小时，内置400 μ L卵母细胞体外培养液TCM-199 (IX) 80% v/v,hCG 15IU/ mL，PMSG 10IU/mL，谷氨酰胺0. 10mg/mL，庆大霉素0. 05mg/mL，猪卵泡液10%，血清10%的四孔板中，38.5°C,5% CO2成熟36小时，用于克隆操作；b.去核以及核供体细胞的注射用5.0 μ g/mL柔红菌素作为去核试剂，处理体外培养成熟的猪卵母细胞10小时，灭活卵母细胞，将成熟后的卵母细胞-卵丘复合体，用透明质酸酶消化卵丘细胞形成裸卵，进行显微操作，将裸卵放入显微操作盘操作滴中，用固定吸液管从极体对侧固定卵母细胞，用外径20 25 μ m的尖的去核管吸取1 μ L细胞质，吸取供核细胞，再将细胞质和供体细胞一起注入卵母细胞的卵周隙中，产生核移植胚胎；④胚胎移植将培育好的囊胚移入代孕母猪的输卵管中，平均每头移植98个融合细胞，共移植4头母猪，胚胎移植4周后用超声波对母猪的妊娠情况进行第一次检测评价，以后每隔一周进行一次超声波检测仪监控受孕母猪的妊娠情况和胎猪的生长情况，共检测6 次；⑤转基因猪的鉴定小猪生产后饲养至断奶后取其耳部组织，通过提取转基因猪基因组DNA进行PCR鉴定和提取转基因猪RNA进行RT-PCR扩增相结合来对转基因阳性猪进行鉴定。
2.根据权利要求
1所述的一种用于过量表达猪PBD-2基因的转基因猪的培育方法，其特征在于所述的提取转基因猪基因组DNA进行PCR鉴定，是通过ΝΡ03/ΝΡ04引物引物扩增NP03:5' -GCTGGTTGTTGTGCTGTCTC-3‘ , ΝΡ04 5' -AGGTCCCTTCAATCCTGTTG-3‘，扩增产物在1. 5% g/v琼脂糖凝胶上进行电泳检测；所述的提取转基因猪RNA进行RT-PCR扩增， 是提取RNA后先反转录为cDNA后，用NP03/NP04引物进行扩增，扩增产物在15% g/v琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
专利摘要
本发明公开了一种用于过量表达猪PBD-2基因的转基因猪的培育方法，其步骤①pcDNA3.1(+)/pCA-PBD2载体构建与线性化设计引物，提取猪的肝脏组织RNA，进行RT-PCR扩增获得PBD-2基因，乙醇沉淀，用灭菌水溶解；②脂质体转染及细胞筛选构建过量表达PBD-2的猪成纤维细胞；③手工克隆方法获取重组囊胚；④胚胎移植将培育好的囊胚移入代孕母猪的输卵管中；⑤转基因猪的鉴定。方法易行，操作简便。克隆猪PBD-2基因后，将其插入到表达载体中通过细胞转染筛选出过表达猪PBD-2的猪成纤维细胞；过表达PBD-2的猪成纤维细胞进行手工核移植于猪卵母细胞而获得重构囊胚，将阳性囊胚移植入受体母猪输卵管中，获得过表达PBD-2基因的转基因猪。具有潜在广泛抗菌能力，为抗病育种研究提供良好素材。
文档编号A01K67/027GKCN102517329SQ201110453326
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月30日
发明者周锐, 杨希 申请人:华中农业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan