农药和抗寄生虫组合物的制作方法

专利名称：农药和抗寄生虫组合物的制作方法
技术领域：
本发明包括若干农药和抗寄生虫类协同组合物，用于防治寄生的植物线虫和动物线虫、一些病害(真菌的和细菌的)和防治寄生的吸虫(肝片吸虫)。
现有技术
线虫是引起世界范围内热带、亚热带和温带农业地最严重损失的罪魁祸首(Nickle W.R.(编辑).1991.Manual of AgriculturalNematology，Marcel Dekker，Inc.，纽约，N.Y.出版，第1035页)。仅大蕉世界产量就有大约20％线虫相关的损失，相当于每年178百万美元(Sasser J.N.和Freckman D.W.1987.A Worldperspective on nematologythe role of the Society.Vistason nematologya commemoration of the twenty-fifthanniversary of the Society of Nematologists/由Joseph A.Veech和Donald W.Dickson编辑，第7-14页)。大蕉和香蕉种植受相似穿孔线虫的显著影响。
根结属是最重要的植物医生线虫，因为其活性引起决大多数热带地区的作物11-25％的损失(Sasser J.N.1979.Root-knotnematodes.F.Lamberti & C.E.Taylor编辑，Academic Press，伦敦，第359页)。因此特别需要防治过去能对抗化学杀线虫剂的那些寄生虫。这种化合物是非常有效的；然而其中许多对环境造成严重威胁。有时控制管理机构限制这种化合物的用量和/或使用次数，从而损害了其杀线虫效力。
线虫防治仍不足。每天使用化学杀线虫剂越来越受到限制，因为其有高毒性且作用广泛的化合物。因此努力尝试确定能消除线虫引起的损伤的有效方式，并且该方式有利于减少化学农药的使用。其中一种方法是使用具有特定的作用模式和较安全的毒理学特性的生物农药代替化学杀线虫剂。可供选择的杀线虫剂中包括ABG-9008，疣孢漆斑菌真菌代谢物和阿维菌素(或相关化合物，如milbecines)与脂肪酸的组合物(Abercrombie K.D.1994，Synergistic pesticidalcompositions。专利US5346698.Mycogen Corporation.9月13日)。同样，一种包括向需要处理的地点、土壤或种子同时使用a)疣孢漆斑菌真菌代谢物和b)化学农药以及在这种情况下有效的协同杀线虫组合物以消除线虫引起的植物损害的的方法要求专利保护(Warrior P.，Heiman D.F.和Rehberger Linda A.1996.Synergistic nematocidal compositions.Abbott laboratories.WO9634529，1996-11-07)。
另一种方法是将线虫寄生细菌侵入巴斯德氏芽菌的孢子与有机磷化的杀线虫剂(Nordmeyer D.1987.Synergistic nematocidalcompositions of Pasteuria penetrans spores and anorganophosphorus nematocide.1987.CIBA-GEIGY AG专利AU06057386A1.01/29/1987)结合。
然而，工业规模制备侵入巴斯德氏芽菌孢子面临着该生物是一种专性寄生菌的问题；因此其必须在原位线虫内生长，从线虫感染的根水解液中分离。
与线虫共享生境的分解几丁质(chitinolytic)的真菌和细菌可能具有某种生物平衡，以某种方式限制线虫繁殖。两株分解几丁质细菌(Toda T.和Matsuda H.1993.Antibacterial，anti-nematodeand/or plant-cell activating composition，and chitinolyticmicroorganism for producing the same.Toda BiosystemLaboratory，日本。专利US5208159，05/04/1993)已要求作为抗细菌、抗线虫和/或植物细胞活化组合物得到保护。
有一些对线虫有分解几丁质作用的实例。其中最重要的是已公开的新细菌菌株(Suslow T.and Jones D.G.1994.NovelChitinase-producing bacteria and plants.DNA PlantTechnology Corporation，US04940840，07/10/1990)，所述菌株是通过引入编码生产几丁酶的DNA而形成的，几丁酶是能降解真菌和线虫内的几丁质的酶。这些菌株可用于产生几丁酶以抑制植物病原体。因引入编码生产几丁酶的DNA而对病原体有抗性的新植物也已有描述。
能减少在自然条件下侵袭植物的线虫群体的微生物的其他实例已有描述。
Rodriguez-Kabana等(Rodriguez-Kabana R.，Jordan J.W.，Hollis J.P.1965.NematodesBiological control in ricefields-role of hydrogen sulfide.Science.148524-26)；Hollis和Rodriguez-Kabana(Hollis，J.P.，y R.Rodríguez-Kábana.1966.Rapid kill of nematodes in flooded soil.Phytopathology 56，第1015-19页)观察到在细菌脱硫脱硫弧菌、硫化氢的产生和植物寄生性线虫间的对应关系，后者种群在路易斯安那的稻栽培中减少。正如某些土壤细菌产生的其他代谢物，硫化物是需氧生物的电子传递呼吸过程的抑制剂(Rodríguez-Kábana，R.1991.Control biológico de nematodos parásitos de plantas.NEMATROPICA，21(1)，第111-22页)。
PAECILTM，也称为BIOACT或Nemachek，是一种生物杀线虫剂，其含有Paecilomyces lilacinus专利菌株的干且稳定的孢子悬浮液，用于土壤和种子处理。此真菌品种通常在世界范围的土壤中都能发现。用作PAECILTM活性成分的专利菌株对植物寄生性线虫特别有效。最初在菲律宾大学分离出来，并且已被澳大利亚的Macquarie大学开发。此外，已被广泛地测试用于防治侵袭澳大利亚、菲律宾、南非和其他国家的主要作物的几种线虫。PAECILTM制剂是市场上可买到的农药，在菲律宾注册名为BIOACTR；在南非名为PL PLUS；和在印度尼西亚名为PAECILTM。目前，Australian NationalRegistration Authority正在为该产品作为农药进行评估(Holland，R.PAECILTM.1998.http//WWW.ticorp.com.au/articlel.htm)。
上述实例不能解决所有的寄生蠕虫问题。因此，实施改良方法代替化学农药和抗寄生产品进行寄生物防治的需要仍然存在。
吸虫给畜牧业和人体健康的造成重大的经济损失。隔离区域内物种的多样性、较温和的致病性和特有分布似乎是导致缺乏吸虫知识的要素。概括地说，肠内吸虫是人畜共患的(zoonotic)并且在各物种中有大量储存寄主。
从经济上来说，最重要的吸虫之一是肝片吸虫，这是第一种已知的寄生吸虫；栖居于胆汁导管影响人健康。其卵是肠虫中最大的卵圆形有囊盖的卵之一，导致胃disepsia的消化不良、结肠自动不良、肝脏和胆囊疼痛、发烧和肝绞痛。其他症状包括在肺、眼、脑、肝静脉和其他组织形成囊状(Saleha A.1991.Liver flukedisease(fasciolosis)epidemiology，economic impact andpublic health significance.Southeast Asian J.Trop.Med.Public health 22 supp 1dic.P361-4)。
动物蠕虫已称为对绵羊和牛来说对重要的害虫。驱蠕虫剂抗性是广泛存在的，尤其是在小型反刍动物寄生线虫种群中。
现已开发出新的辅助技术，其他的仍在研究。真菌Duddingtoniaflagrans是生物链中的捕食者，产生厚壁静止孢子clamidospores能在牛、马、羊和猪的肠道内存活(Larsen M.1999.Biologicalcontrol of helminths.Int J Parasitol.Jan；29(1)139-46，和Larsen，M.2000.Prospects for controlling animalparasitic nematodes by predacious micro fungi.Parasitology，120，S120-S121)。
在丹麦、法国、澳大利亚、美国和墨西哥对D.flagrans的研究已证实此真菌具有用于生物防治的极大潜力。
象许多其他重要的绵羊生产国一样，在驱蠕虫剂抗性，尤其是在绵羊和山羊的肠胃线虫的驱蠕虫剂抗性方面，南非面临着严重的危机。重要的寄生性蠕虫都有这种现象；然而，这引发了关于皱胃吸血寄生虫Haemonchus contortus的特殊问题。研究指出来自南非最重要的绵羊产区的此寄生虫系的超过90％对南非市场上可买到的驱蠕虫剂中的四分之三显示不同程度的抗药性。甚至在Northern Province的普通牧区，于1993年进行研究的五个畜群中也发现这种情况(vanWyk J.A.，Bath G.F.和Malan F.S.2000.The need foralternative methods to control nematode parasites ofruminant livestock in South Africa. World Animal Review.http//www.fao.org/ag/AGA/AGAP/FRG/FEEDback/War/contents.htm)。
由于其他地区也经历同样情况，抗药性增加已日益严重。现已在四个拉丁美洲国家进行了一系列驱蠕虫剂研究阿根廷(Eddi，C.，Caracostantogolo，J.，Peya，M.，Schapiro，J.，Marangunich，L.，Waller，P.J. & Hansen，J.W.1996.The prevalence ofanthelmintic resistance in nematode parasites of sheep insouthern Latin AmericaArgentina.Vet.Parasitol.，62189-197)；比利时(Echevarria F.，Borba M.F.S.，Pinheiro A.C.，Waller P.J.& Hansen J.W.1996.The prevalence ofanthelmintic resistance in nematode parasites of sheep insouthern Latin AmericaBrazil.Vet.Parasitol.，62199-206)；巴拉圭(Maciel S.，Giminez A.M.，Gaona，C.，Waller，P.J.& Hansen，J.W.1996.The prevalence of anthelminticresistance in nematode parasites of sheep in southern LatinAmericaParaguay.Vet.Parasitol.，62207-212)；和乌拉圭(Nari A.，Salles J.，Gil A.，Waller，P.J.& Hansen，J.W.1996.The prevalence of anthelmintic resistance in nematodeparasites of sheep in southern Latin AmericaUruguay.Vet.Parasitol.，62213-222)。
给牛造成最严重损害的线虫之一是Dictyocaulus viviparous，这种寄生虫达到性成熟，并在成熟后寄生在牛的肺中，尤其是幼畜的肺中。所引起的病被称为蠕虫性支气管炎或牛网尾线虫病(Dictyocaulosis)，并且在摄取了存在于牧草中的3或感染幼虫后产生感染。治疗需要驱蠕虫剂(Borgsteede F.H.M.，de Leeuw W.A.& Burg W.P.J.1988.A Comparison of the efficacy of fourdifferent long-acting boluses to prevent infections withDictyocaulus viviparus in calves.The Veterinary Quarterly，Vol 10，No.3)，但成功的代价是对药物产生抗性的新品种，这使其他感染动物的治疗更困难。这些产品的高价格是限制有大量资源的国家使用的因素，并且使用这些制剂会产生有害的生态影响。
虽然化学疗法仍然是寄生虫防治的基础，但似乎在至少下一个10年即将出现任何新的不涉及化学方法的驱蠕虫剂的希望很小，这一事实使驱蠕虫剂抗性的世界难题更复杂(Soll，M.D.1997.Thefuture of anthelmintic therapy from an industry perspective.In J.A.van Wyk & P.C.van Schalkwyk，eds.Managinganthelmintic resistance in endoparasites，p.1-5.Proceedings of the 16th International Conference of theWorld Association for the Advancement of VeterinaryParasitology，Sun City，南非，1997年8月10-15日)。
就细菌和致病性真菌来说，有关于生物制剂的全面报道，其作用主要基于拮抗作用并且在市场上可买到大量产品。其中一些是Conquer(拮抗托拉氏假单胞菌的荧光假单胞菌)，Galltrol-A(放射性土壤杆菌，能防治根癌土壤杆菌)，Bio-Fungus(木霉属，防治下列真菌疫霉属、茄属丝核菌、腐霉属、镰孢属、轮枝孢属)，Aspire(Candida oleophila 1-182，能防治葡萄孢属和青霉属)等。
最广谱活性的生物杀真菌剂之一是木霉属(Chet I，Inbar J.1994 Biological control of fungal pathogens.Appl BiochemBiotechnol；48(1)37-43)，该真菌的作用机制被广泛地讨论过，能降解宿主真菌细胞壁的几丁酶参与其中。而且，有来自用作真菌病害生物调节剂的真菌和细菌的分解几丁质作用的实验证据(Herrera-Estrella A，Chet I.1999.Chitinase in biological control.EXS；87171-84)。然而，这并非细菌作用于植物致病性真菌的唯一模式；还有基于产生次级代谢产物如氰化氢的其他防治方式，氰化氢能抑制根病原菌(Blumer C.And Haas D.2000.Mechanism，regulation，and ecological role of bacterial cyanidebiosynthesis.Arch Microbiol Mar；173(3)170-7)，特别是荧光假单胞菌CHAO菌株。
细菌-细菌相互作用的分析显示有三种主要类型抗生作用、底物竞争和寄生关系。就抗生作用来说，已知有一些细菌菌株能释放抗生素以便抑制周围细菌的活性，这可用于生物防治致病菌。同样，由于生物调节生物能合成含铁细胞微量元素quelant剂，这会导致基质中微量元素主要是铁缺乏，从而抑制相应的病原生长，因此底物竞争是也可用于实现适当的生物控制的机制(Ongena M.1998.Conference on biological controLs.Training program in thearea of biotechnology applied to agriculture andbioindustry.Gembloux，Belgium)。
发明公开
本发明涉及一种组合物，该组合物含来源于微生物或化合物的至少一种分解几丁质剂或分解几丁质活性诱导剂，和硫化物或硫化物产生剂，其中的来源于微生物或化合物的分解几丁质剂或分解几丁质活性诱导剂和硫化物或硫化物产生剂以远低于每种成分单独使用获得对蠕虫和细菌和真菌病害的病原体的有效控制时的用量同时施用。
本发明还涉及不同来源如生物制品和化学制品的所述组合物的使用和/或所述化合物的同时给药以有效控制广谱植物寄生性线虫(根结线虫属、粒线虫属、茎线虫属、短体线虫属、棘皮线虫属、真滑刃线虫属、穿孔线虫属、剑线虫属、盘旋线虫属)、动物寄生线虫和吸虫(Haemonchus属、毛圆线虫属、网尾线虫属和肝片吸虫)、细菌致病菌(菊欧文氏杆菌、荚壳伯克霍尔德氏菌)和真菌致病菌(掌状盘多毛孢、Alternaria tabacina、Sarocladium orizae)。
分解几丁质剂或分解几丁质活性诱导剂和硫化物或硫化物产生剂对蠕虫、细菌和真菌的作用早已被论证或报道过。然而，在本研究中，第一次证明了当两种成分同时施用时有协同作用。
当分解几丁质剂或分解几丁质活性诱导剂和硫化物或硫化物产生剂分别施用时，效果总是低于将两种试剂同时施用时。
当作为本发明的组合物施用时，分解几丁质剂或分解几丁质活性诱导剂和硫化物或硫化物产生剂可以适当地混合成溶液、悬浮液、乳液、粉或颗粒混合物，并作为肥料、预填充土壤、包覆种子装置、粉剂、颗粒剂、喷雾剂(nebulizer)、悬浮液、液体或任何已知的胶囊形式施用到植物或土壤以防治寄生性蠕虫和细菌及真菌病害。
具体对线虫、吸虫、细菌或真菌来说；和对于特殊情况来说，分解几丁质剂或分解几丁质活性诱导剂和硫化物或硫化物产生剂的最佳施用范围是通过体外、温室或田间条件下的实验确定。
根据本发明所述结果，使用下述混合物能实现对蠕虫、细菌和真菌的显著控制，所述混合物为1)每克组合物107菌落形成单位(CFU)-1012CFU的特定的产几丁酶的微生物或占组合物1-50％的几丁质；和2)每克组合物107菌落形成单位(CFU)-1012CFU的特定的产硫化物微生物或任何产生硫化物的化学制剂，其中硫化物量在每克组合物1.0mg/分钟变化。
每克组合物含107CFU-1012CFU的能同时产生分解几丁质剂和硫化物的微生物的任何组合物适于防治蠕虫、细菌和真菌。上述组合物包含上述比例的下列试剂的组合
1.几丁酶和Na2S。
2.几丁酶和FeS。
3.几丁酶和微生物脱硫脱硫弧菌。
4.几丁酶和Na2S。
5.几丁酶和FeS。
6.几丁质和微生物脱硫脱硫弧菌。
7.同时产生分解几丁质活性和H2S的微生物。
上述组合物对多种植物寄生线虫有效，其中包括但不限于根结线虫属如南方根结线虫；粒线虫属如小麦粒线虫；茎线虫属如起绒草茎线虫；短体线虫属如咖啡短体线虫；棘皮线虫属如大豆胞囊线虫；真滑刃线虫属如燕麦真滑刃线虫；穿孔线虫属如香蕉穿孔线虫；剑线虫属如标准剑线虫；盘旋线虫属如R.reniformis；动物线虫如血矛线虫属、毛圆线虫属、Ostertagia属、细颈线虫属、古柏线虫属、蛔虫属、仰口线虫属、结节线虫属、Chabertia属、鞭虫属、Strongylus属、毛线线虫属、网尾线虫属、毛细线虫属、异剌线虫属、弓蛔虫属、鸡蛔虫属、尖尾线虫属、钩口线虫属、钩虫属、弓蛔线虫属和副蛔虫属；吸虫类如肝片吸虫；植物致病性细菌如菊欧文氏杆菌、荚壳伯克霍尔德氏菌和植物致病性真菌如掌状盘多毛孢、Alternaria tabacina和Sarocladium orizae。
实施例
实施例1体外评价化学来源的硫化氢和分解几丁质酶的杀线虫效果
使用动物线虫血矛线虫属和蛇形毛圆线虫和Dictyocaulusviviparus的卵以及寄生植物线虫南方根结线虫幼虫(2期幼体)。
血矛线虫属和蛇形毛圆线虫分别采自绵羊和牛皱胃。在生理溶液中清洗成年雌性线虫并用0.5％“Hibitane”(醋酸洗必太)处理1分钟，整个过程在37℃进行。将大约100个已消毒个体引入含50ml已在无菌蒸馏水中稀释10倍的LB培养基溶液的锥形烧瓶中，令其产卵过夜(8-10小时)。
从预先贡献出的牛的肺中采集D.Viviparous线虫。对血矛线虫属和蛇形毛圆线虫采用相同的方法；但雌虫产卵2-3小时。
从此时开始，在无菌条件下在垂直层流中进行操作，使用24孔组织培养平板。将含雌虫和卵的整个培养基用60μm筛网过滤。线虫的卵被30μm的第二筛网捕获。将其引入0.5％醋酸洗必太溶液中处理3分钟，接着用在无菌蒸馏水中稀释10倍的LB培养基洗三次。
消毒后，将卵从筛网上取下并小心地重新悬浮于无菌蒸馏水稀释10倍的LB培养基溶液。用倒置Olympus显微镜计数和记录每个孔中的卵来检查最终的分布结果，还要观察此阶段的发育状态的一致性。
将血矛线虫属和T.colubriformis卵在28℃孵育24-48小时，而D.viviparus的卵孵育时间少于24小时。当在上述时间内每个品种的所有未处理对照中超过60％出现孵化，就制备出了良好的样本。
从已感染并在温室中培养的南瓜根(Cucurbita pepo)中采集南方根结线虫卵块。为进行此操作，使用立体显微镜和不同针尖的针。将卵块放在28℃培替氏培养皿中的无菌蒸馏水中，每个培养皿放50个卵块。每天观察以检查卵的孵化情况。在大约72小时内，有足够的幼虫可以开始采集和消毒。
全部将含卵块和幼虫的水用60μm的筛网过滤。从此时开始，在无菌条件下在垂直层流中进行操作，使用24孔组织培养平板。从卵块中分离的卵不能孵化并留在30μm筛网上；再用5μm筛网收集幼虫。将其引入0.5％醋酸洗必太溶液中处理3分钟，接着用在无菌蒸馏水中稀释10倍的LB培养基洗三次。消毒后，将南方根结线虫的幼虫从筛网上取下并小心地重新悬浮于无菌蒸馏水稀释10倍的LB培养基溶液。用反相Olympus显微镜计数和记录活的幼虫来检查最终的收集和消毒结果。
将大约100个线虫的卵和幼虫放在大约2ml稀释10倍的LB培养基中。通过安全阀的空气体积应能使空气能穿过液体并因此使气体与卵和幼虫接触。每个处理的阀门是相同的。
两种硫化物盐(Na2S和FeS)与盐酸的反应和细菌脱硫脱硫弧菌脱硫亚种ATCC 27774(从绵羊瘤胃种分离出)的厌氧发酵中可观察到硫化氢。所用的分解几丁质酶是来源于细菌粘质沙雷氏菌的几丁酶SIGMA C 1650。
将所研究的线虫的卵和幼虫进行下列处理24小时
1.对照处理不加几丁酶，空气通过阀门循环。
2.几丁酶处理每个重复0.2单位几丁酶。
3.硫化物处理产自Na2S的硫化氢，0.2通量0.3mg/分钟。
4.硫化物处理产自FeS的硫化氢，0.2通量0.3mg/分钟。
5.硫化物处理产自脱硫脱硫弧菌的硫化氢，0.2通量0.3mg/分钟。
6.组合处理同时施用处理2和3。
7.组合处理同时施用处理2和4。
8.组合处理同时施用处理2和5。
所有上述处理有4个重复。
开始实验后24小时，计数所有处理中新出现的幼虫(血矛线虫属和蛇形毛圆线虫和D.viviparous)和活幼虫(南方根结线虫)的数目。效果(E)示于表1。此数值是每个处理的4次重复的平均值。对于每种线虫观察结果分别进行方差分析(ANOVA)；进行邓肯最新多重差距检定(Lerch G.1977.La Experimentación en las cienciasbiológicas y agrícolas.1ra edición，p.p.203-308，EditorialCientífico-Técnica，La Habana)，其结果也示于表1。同样的字母表示处理间无显著差异(p＜0.05)。
表1处理效果(E)*
就本实施例来说，*效果(E)是1减去孵化出的或活的幼虫的有效比率的值。Fr是每个处理中新出现的或活的幼虫数(Ntto)与处理1中新出现或活的幼虫数(Nc)的比值
E＝1-Fr，其中Fr＝Ntto-Nc；因此E＝1-Ntto/Nc
为测定处理6、7和8中的协同作用，假定不排除其中存在的相互作用。
对于此类型分析来说，预期效果(EE)必定等于单个效果(EI)的总和减去交叉效果(ei)，EI是由几丁酶作用产生的效果(Eq)和硫化氢作用产生的效果(Esn、Esf和Esd)而得到的(Sigarroa，A.1985.Biometría y dise
o experimental.1ra.Parte.Minist.Educatión Sup.Ed.Pueblo y Educación.Cap.3.pag 69-107)。
EE＝Eq+Es-ei，其中ei＝Eq×Es
如果在两种杀线虫剂组合(处理6、7、8)的处理中的实验效果(E)大于那些处理的预期效果(EE)，则可确信当在同一处理中同时施用时，就分解几丁质剂(几丁酶)和硫化氢的杀线虫活性来说存在协同作用。获得的结果概述于表2。
表2.实验效果(E)和预期效果(EE)
在同时结合几丁酶和硫化氢的三种处理中，对所研究的四种线虫的实验效果(E)大于预期效果(EE)，这令人满意地证明了就其杀线虫活性来说，在这两种化合物间存在协同作用(当其同时作用时)。至于硫化物的来源及其杀线虫效果未观察到显著差异(表1)。
实施例2温室评价分解几丁质活性诱导剂(几丁质)和硫化氢产生剂(从土壤中分离出的脱硫脱硫弧菌脱硫亚种ATCC 29577)的杀线虫效果
选择中性pH的棕壤干燥并用0.5cm网过筛以除去不想要的颗粒。在立式加压釜内120℃和1个大气压下消毒1小时(SambrookJ.，Fritsch E.F.and Maniatis T.1989.Molecular CloningA Laboratory Manual.2nd.Ed.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，USA)。在室温下干燥3-4天以便稍后与河砂、蚯蚓腐殖土和几丁质处理上述混合物(ICN编号101334)。
用下列处理中设定的比例组成装满20个罐子(直径15cm×深13cm，容积1升)
1.对照处理土壤70％、河砂25％和腐殖土5％
2.几丁质处理土壤70％、河砂25％、腐殖土4％和几丁质1％。
3.微生物处理土壤70％、河砂25％、腐殖土5％和脱硫脱硫弧菌，该微生物的浓度为1010CFU/罐。
4.组合处理土壤70％、河砂25％、腐殖土4％、几丁质1％和浓度为1010CFU/罐的脱硫脱硫弧菌。
每个处理重复5次(罐)。
在处理2和4中，按4∶1比例制备腐殖质和几丁质的预混物，接着与土壤和沙子一起形成最终的混合物。在处理3和4中，将脱硫脱硫弧菌与每罐100ml去离子水一起施用。在第一次灌水过程中均匀地施用这些体积的水。
所有的处理中，将500个预先从自然感染的香蕉根中采集的香蕉穿孔线虫样本在罐中培植。使用离心-浮选技术(Jenkins，W.R.1964.A rapid centrifugal-flotation technique forseparation nematodes from soil.Plant Disease Reporter，48692)；样本在5ml蒸馏水中稀释并被均匀地施用到土表下深5cm处。
将罐子放置在温室中并在施加处理和接种线虫后仍保留3天。在此期间每天浇水以保持良好的湿度条件。在处理的第四天之前，将通过体外组织培养获得的香蕉品种Cavendish移植到罐中。从此时开始，进行严格的灌溉管理，令土壤湿度始终保持在其土壤容水量。
实验开始三个月后进行最终评价，将植物的根从土壤中小心地取出。然后使用离心-浮选技术(Jenkins，W.R.1964.A rapidcentrifugal-flotation technique for separation nematodesfrom soil.Plant Disease Reporter，48692)和倒置显微镜计数，记录从植物中收集到的样本(幼虫和成虫)和活线虫的数目。不同处理的效果示于表3。这是每种处理的5次重复的平均值。对于获得的结果进行方差分析(ANOVA)，接着进行邓肯最新多重差距检定(Lerch G.1977.La Experimentación en las cienciasbiológicas y agrícolas.1ra edición，p.p.203-308，EditorialCientifico-Técnica，La Habana)，其结果示于表3。同样的字母表示处理间无显著差异(p＜0.05)。
表3.处理效果(E)*
*效果(E)是1减去活样本的相对频数值的结果。Fr是每个处理中活样本数(Ntto)与处理1中活样本数(Nc)的比值
E＝1-Fr，其中Fr＝Ntto-Nc，因此E＝1-Ntto/Nc。
为确定处理4中可能的协同作用，假定不排除存在的相互作用(杀线虫作用)。
象实施例1一样，预期效果(EE)必定等于单个效果(EI)的总和减去两个处理间的交叉效果(ei)(Sigarroa，A.1985.Biometría ydise
o experimental.1ra.Parte.Minist.Educación Sup.Ed.Pueblo y Educación.Cap.3.pag 69-107)，EI是由作为土壤和腐殖土中存在的微生物的分解几丁质活性的诱导剂的几丁质作用产生的效果(Eq)和产自脱硫脱硫弧菌的硫化氢作用产生的效果(Esd)而得到的。
EE＝Eq+Es-ei，其中ei＝Eq×Es
如果在结合两种杀线虫剂的处理4中的实验效果(E)大于预期效果(EE)，则可确信当在同一处理中同时施用时，分解几丁质活性诱导剂(几丁质)和硫化氢(产自脱硫脱硫弧菌)间存在协同作用。获得的结果概述于表4。
表4实验效果(E)和预期效果(EE)
在处理4中，结合了分解几丁质活性诱导剂(几丁质)和生物来源的硫化氢(脱硫脱硫弧菌)。在这种情况下，实验效果(E)大于预期效果(EE)，因此证明当将这两种化合物同时施用到土壤时它们之间存在协同作用(就其杀线虫活性而论)。
实施例3论证细菌微代谢棒状杆菌C-924和微代谢冢村氏菌DSM 20162的分解几丁质活性和产生硫化物
硫化物产生测定
用100ml集气试管，从菌株C-924和DSM 20162的5L生物反应器的发酵气流中采样。整个培养时间是24小时。在第16小时时首次检测到形成硫化氢。
样本以类似于产生的H2S模式的方式处理。在Varian气谱中进行分析，条件如下
■带对含硫化合物敏感的过滤器的火焰光度检测器
■硫化氢模式43.2ng/ml，重复
■样本每次取样重复两次。
■注入1ml或μl液上气体。
■柱DB-5(15m×0.53mm)。
■温度35℃
■载体氮气，1.5ml/分钟。
■检测器FPD-S
■吹扫气氮气30ml/分钟。
表5显示两个菌株在不同时间进行的硫化物气体分析的概况。
表5.硫化物气体分析
两种菌株都产生硫化物，但C-924产生的流量高于菌株DSM20162。
分解几丁质活性测定
使用微代谢棒状杆菌C-924、微代谢冢村氏菌DSM 20162、粘质沙雷氏菌ATCC 13880和大肠杆菌ATCC 25922菌株。
在LB培养基中进行上述菌株的细菌培养，条件为28℃和100rpm24小时，接着3500rpm离心；上清液过0.2μm网过滤。滤出物在预备了几丁质胶状悬浮液(0.5％)的平板上进行分析，并且添加至多0.8％的琼脂糖以达到培养基凝胶化和保证多空性以利于蛋白质扩散。凝胶化后，打开直径5mm的孔，向其中添加100μl从各种细菌菌株得到的滤出的上清液。每个平板进行三次重复，并且在暗处28℃下培养。
从第48小时开始，在培养基中观察到似晕圈的混浊，这证明几丁质的水解。在下表(表6)中，显示了用不同的研究菌株的培养中产生的上清液培养，在不同的培养时间出现水解晕圈而得到的定性结果。
表6.水解晕圈的出现
+++指观察到最大的水解晕圈，
++指中等水解晕圈，和
+指观察到最小的水解晕圈。
两种菌株(微代谢棒状杆菌和微代谢冢村氏菌)均显示几丁质水解晕圈，就象所用的阳性对照(粘质沙雷氏菌)一样，而大肠杆菌(阴性对照)不产生水解晕圈。
实施例4体外评价由微代谢棒状杆菌C-924和微代谢冢村氏菌DSM 20162产生的硫化物和几丁酶对寄生的肝片吸虫(吸虫)的作用
使用寄生肝片吸虫的卵。卵直接采自预先贡献出的被感染的牛的肝胆汁。将胆汁内容物再悬浮于三倍体积的蒸馏水中并在28℃再保持2-3小时，以达到卵的沉淀。然后取出尽可能最大体积的上清液。沉淀物过71μm筛网过滤，从而将卵捕获在筛网上。
从此时开始，在无菌条件下在垂直层流中进行所有的操作，使用24孔组织培养平板。将带肝片吸虫卵的筛网置入0.5％醋酸洗必太溶液中处理3分钟，接着用在无菌蒸馏水中稀释10倍的LB培养基洗三次。消毒后，将卵从筛网上取下并小心地重新悬浮于无菌蒸馏水稀释10倍的LB培养基溶液。用倒置Olympus显微镜计数和记录活幼虫以检查最终的收集和消毒结果。还要观察此阶段的发育状态的一致性。
在28℃预先体外设定条件下孵化此寄生吸虫的卵大约15天；当孵育期结束时有超过60％的卵孵化，就可认为制备出了良好的样本。
为展开实验，将大约100个已消毒的卵放入1ml稀释10倍的LB培养基中。通过20个安全阀均匀引入的空气体积应能使空气能穿过液体；因此使气体与卵接触。在所有五种处理中每个阀门是相同的(每个处理4个)。
在孵育的最后4天对肝片吸虫卵进行下列处理
1.对照处理向每个阀门添加1ml无几丁酶的稀释10倍的LB培养基，并使空气通过阀门循环。
2.向每个阀门添加1ml无细菌细胞的分解几丁质上清液，该上清液产自微代谢棒状杆菌C-924每毫升1010菌落形成单位(CFU/ml)的培养物。
3.向每个阀门添加1ml无细菌细胞的分解几丁质上清液，该上清液产自微代谢冢村氏菌DSM 20162 1010CFU/ml的培养物。
4.令由1010CFU/ml微代谢棒状杆菌C-924连续培养产生的气体流过阀门。
5.令由1010CFU/ml微代谢冢村氏菌DSM 20162连续培养产生的气体流过阀门。
6.组合处理同时施用处理2和4。
7.同时处理同时施用处理3和5。
在实验开始后的第4天计数孵化的卵。就肝片吸虫来说，由于其游动性，不可能计数幼虫(纤毛幼虫)；因此，通过显微镜进行的观察集中在卵上。不同处理的效果示于表7。这是每种处理的四次重复的平均值。相同的字母表示处理间缺乏显著差异(p＜0.05)。
表7.处理效果(E)*
*效果是1减去孵化的相对频数值的结果。Fr是每个处理中孵化的卵数(Ntto)与处理1中孵化的卵数(Nc)的比值
E＝1-Fr，其中Fr＝Ntto-Nc因此E＝1-Ntto/Nc
为测定处理6和7中的可能存在的协同作用，假定不排除上述处理中存在的作用(抗寄生物作用)。
对于此类型分析来说，预期效果(EE)等于由几丁酶作用产生的效果(Eq)和硫化氢作用产生的效果(Esn、Esf和Esd)减去交叉效果(ei)(Sigarroa，A.1985.Biometría y dise
o experimental.1ra.Parte.Minist.Educación Sup.Ed.Pueblo y Educación.Cap.3.pag 69-107)。
EE＝Eq+Es-ei，其中ei＝Eq×Es
如果在结合两种抗寄生物剂的处理中(处理6和7)的实验效果(E)大于那些处理的预期效果(EE)，则可确信当在同一处理中同时施用时，就分解几丁质剂(几丁酶)和硫化氢的抗寄生物活性来说存在协同作用。获得的结果概述于表8。
表8.实验效果(E)和预期效果(EE)
在结合几丁酶和硫化氢的处理中，实验效果(E)大于预期效果(EE)，这证明了就其杀线虫活性来说，当其同时作用时在这两种化合物间存在协同作用。
实施例5产硫化氢并对一些细菌和真菌有分解几丁质活性的细菌菌株(微代谢棒状杆菌C-924)的体外效果评价
使用下列真菌品种掌状盘多毛孢、Alternaria tabacina、Sarocladium orizae、Pitium debaryanum；还使用下列细菌品种菊欧文氏杆菌、荚壳伯克霍尔德氏菌、粘质沙雷氏菌ATCC 13880、枯草芽孢杆菌F1695和大肠杆菌ATCC 25922。
A)真菌测定。
测定微代谢棒状杆菌C-924对这些真菌的相互作用掌状盘多毛孢、Alternaria tabacina、Sarocladium orizae和Pitiumdebayianum。使用粘质沙雷氏菌ATCC 13880作为杀真菌活性的阳性对照，大肠杆菌ATCC 25922作为杀真菌活性的阴性对照。采用常规的振摇和温度条件对所有品种进行24小时细菌培养。进行必要的稀释，读取λ530nm吸光率以确保细胞浓度为109cfu/ml。将其放入含PDA培养基(琼脂-马铃薯-葡萄糖)的培替氏培养皿中，用微生物接种环沿中线接种。培养皿在28℃孵育48小时，然后接种(平板含PDA培养基)取自不同的预先长满的真菌菌株的直径8mm盘状物并放在平板表面上已接种细菌的中线的两极。每种所研究真菌进行三次重复并在28℃孵育10天。在实验开始的第五天开始读取结果。
b)细菌测定。
研究微代谢棒状杆菌C-924、大肠杆菌ATCC 25922和枯草芽孢杆菌F1695对这些细菌的相互作用菊欧文氏杆菌、荚壳伯克霍尔德氏菌。使用枯草芽孢杆菌F1695作为与其他细菌有拮抗作用的阳性对照，大肠杆菌ATCC 25922用作阴性对照。采用常规的振摇和温度条件对所有品种进行24小时细菌培养。进行必要的稀释，预先读取λ530nm吸光率以确保细胞浓度为109cfu/ml。分别将5μl C-924滴加到LB培养基平板的三个不同位点，阳性对照为两个不同位点，阴性对照为另外两个不同位点。培养皿在28℃孵育48小时。然后用氯仿蒸气处理3分钟(使其失活并避免在之后的步骤中分散)，然后将平板半开地留在层流中，以除去多于的气体。进行菊欧文氏杆菌和荚壳伯克霍尔德氏菌的接种，先进行各微生物的纯培养，使在添加至多3毫升半固体LB培养基(0.1％工业级琼脂No.3)后，能达到109cfu/ml细胞浓度的必要量。将混合物分散到含所研究菌株的平板上，然后在28℃孵育48小时，评价结果。
表9显示在上述相互作用检测中获得的结果。
表9.相互作用测定获得的结果。
+++观察到强拮抗作用，生长停止并因C-924的作用形成晕圈。在真菌的情况下，典型的放射状生长被抑制。
++C-924对微生物的中等拮抗作用。
+C-924对微生物的轻微拮抗作用。
-未观察到C-924对微生物的拮抗作用。
如表9所示，微代谢棒状杆菌C-924对真菌掌状盘多毛孢、Alternaria tabacina和Sarocladium orizae有显著的拮抗作用，上述真菌的特征在于其结构中有高几丁质含量。观察到硫化氢的活性只引起轻微的拮抗作用。就与所研究细菌的相互作用来说，在两种致病菌(菊欧文氏杆菌和荚壳伯克霍尔德氏菌)中均观察到拮抗作用，而在枯草芽孢杆菌的情况下未观察到拮抗作用，因为其是从拮抗其他微生物的土壤中分离出的；因此对不利的环境因素会产生更强的抗性。
权利要求
1.一种农用和兽用组合物，含至少一种分解几丁质剂或分解几丁质活性诱导剂，和硫化物或硫化物产生剂。
2.权利要求1的组合物，其中所述分解几丁质剂是几丁酶。
3.权利要求1的组合物，其中所述分解几丁质是几丁酶产生剂。
4.权利要求3的组合物，每克组合物含介于107菌落形成单位(CFU)和1012CFU之间的所述微生物。
5.权利要求1的组合物，其中所述分解几丁质活性诱导剂是几丁质。
6.权利要求5的组合物，其中的几丁质含量为1-50％。
7.权利要求1的组合物，其中所述硫化物产生剂是微生物。
8.权利要求7的组合物，每克组合物含介于107菌落形成单位(CFU)和1012CFU之间的所述微生物。
9.权利要求1的组合物，其中所述硫化物产生剂是化学试剂。
10.权利要求1的组合物，其中每克组合物中硫化物的产量介于0.1mg/min和1.0mg/min之间。
11.权利要求1的组合物，其中的分解几丁质剂和硫化物产生剂是微生物。
12.根据权利要求1-11所述的组合物，用于防治寄生性动物线虫。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中的寄生性动物线虫是血矛线虫属、毛圆线虫属和网尾线虫属。
14.根据权利要求1-11所述的组合物，用于防治植物寄生性线虫。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中的植物寄生线虫是根结线虫属和相似穿孔线虫。
16.根据权利要求1-11所述的组合物，用于防治植物和动物致病细菌。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中的致病细菌是欧文氏杆菌属和伯克霍尔德氏菌属。
18.根据权利要求1-11所述的组合物，用于防治植物和动物致病真菌。
19.根据权利要求18的组合物，其中的致病真菌是掌状盘多毛孢、Alternaria tabacina、Sarocladium orizae。
20.根据权利要求1-11所述的组合物，用于防治寄生吸虫。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中的寄生吸虫是肝片吸虫。
22.根据上述权利要求所述的农用和兽用组合物，与所述适宜载体如肥料、预填充土壤、包覆种子装置、粉剂、颗粒剂、喷雾剂、悬浮液、液体或任何已知形式制成胶囊制剂用于防治寄生性蠕虫和细菌及致病真菌。
全文摘要
本发明涉及农药和抗寄生虫药组合物，用于防治侵袭植物和动物的害虫、病害和寄生虫。所述组合物包括来源于微生物或化合物的至少一种分解几丁质剂或分解几丁质活性诱导剂，和硫化物或硫化物产生剂，其中的来源于微生物或化合物的分解几丁质剂或分解几丁质活性诱导剂和硫化物或硫化物产生剂以远低于上述化合物单独使用获得有效控制时的用量同时施用。
文档编号A01N25/02GK1484494SQ0182172
公开日2004年3月24日 申请日期2001年12月17日 优先权日2001年1月3日
发明者J·梅纳, 坎波斯, E·皮门特尔, 巴斯克斯, A·T·埃尔南德斯, 加西亚, L·韦洛兹, 冈萨雷斯, M·马林, 布鲁佐斯, O·孔特, 阿尔贝托, M·多明戈, 普恩特, L·莱昂, 巴雷拉斯, M·普若尔, 费雷罗, J·D·门琼, 庞塞, C·博罗托, 诺德洛, 坎波斯 J 梅纳, 加西亚 埃尔南德斯, 尥 诺德洛, 盘囟 巴斯克斯, 舳 费雷罗, 遄 冈萨雷斯, 庞塞 门琼, 鞲 普恩特 申请人:遗传工程与生物技术中心