专利名称：一种适用于栉孔扇贝的四倍体制备方法
技术领域：
本发明涉及贝类多倍体的诱导和培育，特别提供了一种适用于栉孔扇贝的四倍体制备方法。
背景技术：
利用生物技术培育优良的养殖品种，是发展海水贝类养殖亟待解决的关键问题之一。三倍体贝类具有许多优良生产性状，是一类很有价值的养殖贝类新品系。目前通常采用理化方法人工诱导多倍体，倍化率变化幅度大，很难达到100％，并且人工诱导对诱导对象造成的负面影响大，表现为存活率低、异常发育的胚胎和幼虫比例高。利用人工培育的四倍体，与正常二倍体杂交，可以高效获得高倍化率的三倍体，是最有前景的三倍体贝类制备方法。
目前国内外成熟的贝类四倍体技术仅见美国学者利用三倍体长牡蛎(通称为太平洋牡蛎)的卵子与来自二倍体的精子受精，采用细胞松弛素B抑制受精卵第一极体的释放，获得了四倍体长牡蛎。该技术中通过人工解剖方法分别从三倍体和二倍体获取卵子和精子。该技术已经受到国际专利的保护。我国学者也采用该方法，获得少量合浦珠母贝四倍体。但是直接从二倍体制备四倍体的技术，国内外鲜有报道。
栉孔扇贝三倍体性腺发育严重受阻，无法通过催产三倍体获取卵子，而且人工解剖获取的卵子无法完成受精。因此利用三倍体来诱导四倍体的技术不可行，需要探索栉孔扇贝四倍体的制备方法。
发明内容
本发明旨在提供一种适用于栉孔扇贝的四倍体制备方法，人工培育栉孔扇贝的四倍体，促进三倍体栉孔扇贝的开发利用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下
1)选取性腺发育饱满成熟，1～3龄，在自然海区栖息的二倍体栉孔扇贝；2)分别催产雄贝和雌贝获取精子和卵子，经人工同步授精获取受精卵，受精卵密度在10～50万粒/L，然后进行诱导加倍；3)利用细胞松弛素B或者6-二甲氨基嘌呤，处理受精卵，使其染色体数目从二倍体加倍至四倍体，用海水漂洗受精卵，利用筛绢网过滤去除药物，收集受精卵，重新用海水悬浮；4)在水温18～20℃下，按常规方法培育诱导出的胚胎和幼虫，直至幼虫变态为幼贝；5)利用流式细胞术，筛选四倍体，从而获得四倍体。其中四倍体诱导处理是在水温18～20℃下，加入细胞松弛素B或者6-二甲氨基嘌呤，有效剂量分别为0.1～1mg/L和300～500μmol/L，处理时间15～20min，处理开始的时间为受精后10-15min。
对实施诱导处理的材料，采用活体取样制备单细胞悬浮液，细胞密度为5000～100000个/mL，加入DNA特异性荧光染料DAPI(4′，6-二联脒-2-吲哚苯)，加入量为1～10mg/L，利用流式细胞仪检测样品的染色体倍性组成，筛选出四倍体。
本发明的原理在于现有技术中，从人工诱导培育的三倍体获取卵子，利用二倍体产生的精子受精后，采用细胞松弛素B抑制受精卵第一极体的释放，获得了四倍体长牡蛎。而本发明取材于自然栖息的二倍体，采用细胞松弛素B或6-二甲氨基嘌呤处理，并且通过控制水温、处理时间、处理开始的时间等，在抑制受精卵第一极体释放的基础上改变受精卵的染色体行为，实现部分受精卵的染色体数目从二倍体加倍至四倍体，经培育后，采用流式细胞术筛选出四倍体。
本发明提供的栉孔扇贝四倍体制备过程中，要求被处理的受精卵的发育具有较高同步性，以实现较高的四倍体胚胎诱导率。为了解决这一问题，首先选择性腺发育成熟的亲本，以保证高质量的精子和卵子。其次，实施同步人工授精，具体而言，将雌、雄亲本甄选分开，分别进行产卵和排精，然后进行人工授精，授精时的精子与卵子的比例不少于100∶1，授精后不断搅动。
流式细胞术是对单个细胞或其他生物微粒进行快速定量分析与分选的技术，其原理是将悬浮在液流中的单细胞逐个通过测量区，用仪器检测细胞内的光学参数而达到快速、大量地测定细胞的一系列物理特性和生化特性。如果单细胞样品经DNA特异性荧光染料处理，就可测定样品的DNA含量，判断其倍性。自20世纪80年代以来，国际贝类多倍体研究中广泛利用流式细胞术检测实验材料的倍性组成。本发明采用流式细胞术对幼贝进行分析，在不杀死检测对象的条件下，实现了快速、准确筛选四倍体。
本发明的有益效果是1、本发明提供的四倍体制备方法，直接利用自然海区栖息具有繁殖力的自然二倍体栉孔扇贝，经人工授精制备受精卵，施加化学诱导剂处理使受精卵的染色体加倍，获得四倍体胚胎，利用流式细胞术对诱导培育获得的材料进行活体检测，筛选四倍体。本发明制备的四倍体栉孔扇贝是利用染色体组操作技术获得的特有种质资源。
2、本发明材料来源丰富，并且四倍体诱导率稳定，四倍体幼虫的比例在30％以上。
具体实施例方式
以下给出几个典型实施例，但本发明并不局限在以下实施例中。
实施例1利用本发明方法，制备栉孔扇贝四倍体，具体操作为1)从自然海区选取性腺发育饱满，性腺色泽鲜艳的1龄二倍体栉孔扇贝；2)雌雄分选，分别实施人工催产获取精子和卵子，人工授精，授精时的精子与卵子的比例为100∶1，获得受精卵，调整其密度为10万粒/L；3)在18℃下，受精后15min按0.5mg/L的浓度加入细胞松弛素B，处理15min；4)用海水漂洗受精卵，利用筛绢网过滤去除药物，收集受精卵，重新用海水悬浮，并以常规方法孵育(孵育密度为50个/mL左右)；
5)在水温18℃下，按常规方法培育诱导出的胚胎和幼虫，直至幼虫变态为幼贝；在受精后48h，采用流式细胞术分析表明四倍体幼虫比例为50％；6)在完成变态的幼贝中，活体获取少量鳃组织，振荡过滤制备成单细胞悬液，细胞密度为5000个/mL，加入DAPI，加入量为1mg/L，采用流式细胞术逐个分析，检测到四倍体，比例为3％。
实施例2利用本发明方法，进行栉孔扇贝的多倍体幼虫样品制备，具体操作为1)从自然海区选取性腺发育饱满，性腺色泽鲜艳的2龄二倍体栉孔扇贝；2)雌雄分选，分别实施人工催产获取精子和卵子，人工授精，授精时的精子与卵子的比例为120∶1，获得受精卵，调整其密度为50万粒/L(悬浮于海水中)；3)在20℃下，受精后12min按0.1mg/L的浓度加入细胞松弛素B，处理20min；4)用海水漂洗受精卵，利用筛绢网过滤去除药物，收集受精卵，重新用海水悬浮，并以常规方法孵育(孵育密度为50个/mL左右)；5)在水温20℃下，按常规方法培育诱导出的胚胎和幼虫，直至幼虫变态为幼贝；在受精后48h，采用流式细胞术分析表明四倍体幼虫比例为50％；6)在完成变态的幼贝中，活体获取少量鳃组织，振荡过滤制备成单细胞悬液，细胞密度为10000个/mL，加入DAPI，加入量为2mg/L，采用流式细胞术逐个分析，检测到四倍体，比例为2％。
实施例31)从自然海区选取性腺发育饱满，性腺色泽鲜艳的3龄二倍体栉孔扇贝；
2)雌雄分选，分别实施人工催产获取精子和卵子，人工授精，授精时的精子与卵子的比例为100∶1，获得受精卵，调整其密度为10万粒/L(悬浮于海水中)；3)在18℃下，受精后10min按1mg/L的浓度加入细胞松弛素B，处理15min；4)用海水漂洗受精卵，利用筛绢网过滤去除药物，收集受精卵，重新用海水悬浮，并以常规方法孵育(孵育密度为50个/mL左右)；5)在水温18℃下，按常规方法培育诱导出的胚胎和幼虫，直至幼虫变态为幼贝；在受精后48h，采用流式细胞术分析表明四倍体幼虫比例为60％；6)在完成变态的幼贝中，活体获取少量鳃组织，振荡过滤制备成单细胞悬液，细胞密度为50000个/mL，力入DAPI，加入量为5mg/L，采用流式细胞术逐个分析，检测到四倍体，比例为3％。
实施例4利用本发明方法，制备栉孔扇贝四倍体，具体操作为1)从自然海区选取性腺发育饱满，性腺色泽鲜艳的3龄二倍体栉孔扇贝；2)雌雄分选，分别实施人工催产获取精子和卵子，人工授精，授精时的精子与卵子的比例为150∶1，获得受精卵，调整其密度为30万粒/L(悬浮于海水中)；3)在19℃下，受精后10min加入终浓度为300μmol/L的6-二甲氨基嘌呤，处理20min；4)用海水漂洗受精卵，利用筛绢网过滤去除药物，收集受精卵，重新用海水悬浮，并以常规方法孵育(孵育密度为50个/mL左右)；5)在水温19℃下，按常规方法培育诱导出的胚胎和幼虫，直至幼虫变态为幼贝；在受精后48h，采用流式细胞术分析表明四倍体幼虫比例为70％；
6)在完成变态的幼贝中，活体获取少量鳃组织，振荡过滤制备成单细胞悬液，细胞密度为80000个/mL，加入DAPI，加入量为8mg/L，采用流式细胞术逐个分析，检测到四倍体，比例为3％。
实施例5利用本发明方法，制备栉孔扇贝四倍体，具体操作为1)从自然海区选取性腺发育饱满，性腺色泽鲜艳的3龄二倍体栉孔扇贝；2)雌雄分选，分别实施人工催产获取精子和卵子，人工授精，授精时的精子与卵子的比例为150∶1，获得受精卵，调整其密度为40万粒/L(悬浮于海水中)；3)在19℃下，受精后15min加入终浓度为500μmol/L的6-二甲氨基嘌呤，处理18min；4)用海水漂洗受精卵，利用筛绢网过滤去除药物，收集受精卵，重新用海水悬浮，并以常规方法孵育(孵育密度为50个/mL左右)；5)在水温19℃下，按常规方法培育诱导出的胚胎和幼虫，直至幼虫变态为幼贝；在受精后48h，采用流式细胞术分析表明四倍体幼虫比例为60％；6)在完成变态的幼贝中，活体获取少量鳃组织，振荡过滤制备成单细胞悬液，细胞密度为100000个/mL，加入DAPI，加入量为10mg/L，采用流式细胞术逐个分析，检测到四倍体，比例为2％。
权利要求
1.一种适用于栉孔扇贝的四倍体制备方法，其特征在于包括如下过程1)选择亲本选取自然栖息的二倍体栉孔扇贝，性腺发育饱满成熟；2)获取受精卵分别催产雄贝和雌贝获取精子和卵子，经人工同步授精获取受精卵，受精卵密度在10～50万粒/L，然后进行诱导加倍；3)诱导加倍在水温18～20℃下，利用化学诱导剂处理受精卵使其染色体数目从二倍体加倍至四倍体，受精后10～15min开始处理，处理时间15～20min，用海水漂洗受精卵，利用筛绢网过滤去除药物；4)培育幼体在水温18～20℃下，按常规方法培育诱导出的胚胎和幼虫，直至幼虫变态为幼贝；5)筛选四倍体采用流式细胞术逐个分析幼贝，筛选获得四倍体。
2.按照权利要求1所述适用于栉孔扇贝的四倍体制备方法，其特征是所述化学诱导剂为细胞松弛素B，或者为6-二甲氨基嘌呤。
3.按照权利要求1或2所述适用于栉孔扇贝的四倍体制备方法，其特征是所述化学诱导剂的剂量，细胞松弛素B为0.1～1mg/L，6-二甲氨基嘌呤为300～500μmol/L。
4.按照权利要求1所述适用于栉孔扇贝的四倍体制备方法，其特征是所述流式细胞术包括活体取样，制备单细胞悬浮液，加入DNA特异性荧光染料DAPI，利用流式细胞仪检测样品的染色体倍性。
全文摘要
本发明公开一种适用于栉孔扇贝的四倍体制备方法。它利用具有繁殖力的自然二倍体栉孔扇贝，经人工授精制备受精卵，施加化学诱导剂处理使受精卵的染色体加倍，获得四倍体，利用流式细胞术活体筛选四倍体。本发明制备的四倍体栉孔扇贝是利用染色体组操作技术获得的特有种质资源。本发明材料来源丰富，并且四倍体诱导率稳定，四倍体幼虫的比例在30％以上。
文档编号A01K61/00GK1739343SQ20041005030
公开日2006年3月1日 申请日期2004年8月24日 优先权日2004年8月24日
发明者阙华勇, 张国范, 张福绥 申请人:中国科学院海洋研究所