用于提高植物的氨基酸含量的化合物及其应用的制作方法

用于提高植物的氨基酸含量的化合物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明的目的在于开发提高植物的氨基酸含量的技术，并且提供简单地制造氨基酸含量提高的植物的技术，使用氨基酸含量促进剂、含有氨基酸含量促进剂的组合物或者具备氨基酸含量促进剂或含氨基酸含量促进剂的组合物的试剂盒来提高植物的氨基酸含量，并且制造氨基酸含量提高的植物。
【专利说明】用于提高植物的氨基酸含量的化合物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及提高植物的氨基酸含量的化合物和含有该化合物的组合物以及它们的应用。
【背景技术】
[0002]氨基酸不仅与食品的浓郁味道、甜味等有很大关联，其生理活性近年来也特别受关注。随之开发了以氨基酸含量为特征的各种商品。另外，在农产品中也十分关心其营养价值。
[0003]已知因植物的栽培条件的不同，植物的氨基酸含量会有变化。例如，非专利文献I中，记载了卷心菜中的游离氨基酸的含量和组成根据收获期、氮施肥条件而变化。非专利文献2中，记载了因土壤、肥料的不同而菠菜中的游离氨基酸含量存在差异。
[0004]另外，也已知有生产氨基酸含量高的蔬菜的技术。例如，专利文献I中，公开了通过在蔬菜的收获期进行氮肥料的施肥来生产氨基酸含量高的蔬菜的方法。专利文献2~4中，公开了在用特定基因进行了转化的植物中游离氨基酸的含量增大的技术。
[0005]现有技术文献
[0006]专利文献
[0007]专利文献1:日本 国公开专利公报“日本特开平10 - 323128号公报(平成10年12月8日公开)”
[0008]专利文献2:日本国公开专利公报“日本特开2003 - 125661号公报(平成15年5月7日公开)”
[0009]专利文献3:日本国公开专利公报“日本特开2003 - 310072号公报(平成15年11月5日公开)”
[0010]专利文献4:国际公开公报“W02003/000041号小册子(2003 (平成15)年I月3日国际公开)”
[0011]专利文献5:日本国公开专利公报“日本特开2004 - 352679号公报(平成16年12月16日公开)”
[0012]专利文献6:日本国公开专利公报“日本特开2009 - 165494号公报(平成21年7月30日公开)”
[0013]专利文献7:日本国公开专利公报“日本特开2008 - 120815号公报(平成20年5月29日公开)”
[0014]专利文献8:国际公开公报“W001/080638号小册子(2001 (平成13)年11月I日国际公开)”
[0015]专利文献9:国际公开公报“W02008/072602号小册子(2008 (平成20)年6月19
日国际公开)”
[0016]专利文献10:国际公开公报“W02009/063806号小册子(2009(平成21)年5月22
日国际公开)”[0017]非专利文献
[0018]非专利文献1:Bull.Hyogo Pre.Agr1.1nst.(Agriculture) 50, 41-46 (2002)
[0019]非专利文献2:日本家政学会志Vol.53，N0.2，p.199-203 (2002)

【发明内容】

[0020]然而，为了得到氨基酸含量提高到2倍以上的植物，需使用如专利文献2~4中记载的转基因技术，想要仅通过如专利文献I中记载的培育管理来提高氨基酸含量，其效果寻層。
[0021]本发明是鉴于上述问题而进行的，其目的在于开发提高植物的氨基酸含量的技术，并且提供简单地制造氨基酸含量提高的植物的技术。
[0022]本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，其结果成功地发现通过在一定条件下培育给予了谷胱甘肽的植物，能够显著提高植物体内的氨基酸含量。该效果是专利文献I中所记载的现有的氮肥料无法实现的水平。另外，目前为止虽然生产出了如专利文献2~4所记载的通过转基因技术使氨基酸含量显著提高的植物，但没有报道仅通过培育管理使植物的氨基酸含量显著提高的例子。
[0023]本发明人等发现使用谷胱甘肽，能够使愈伤组织高效且短时间内再分化(专利文献5~6等)，能够调节细胞或器官的分化(专利文献7~8等)，能够提高植物的收获指数(专利文献9等)，能够提高植物的糖度(专利文献10等)。但是，目前为止并没有通过施用谷胱甘肽来提高植物的氨基酸含量这类的报告。另外，能够容易地提高植物的氨基酸含量的效果超出了本领域技术人员能够预测的范围，是特别显著的效果。
[0024]本发明的组合物的特征在于，为了提高植物的氨基酸含量而含有氨基酸含量促进剂。
[0025]本发明的试剂盒的特征在于，为了提高植物的氨基酸含量而具备氨基酸含量促进剂或含有氨基酸含量促进剂的组合物。
[0026]本发明的组合物和试剂盒可用于制造氨基酸含量提高的植物。
[0027]本发明的方法的特征在于，包含将氨基酸含量促进剂或含有氨基酸含量促进剂的组合物施用于植物的工序。
[0028]本发明的制造方法的特征在于，包含在氨基酸含量促进剂存在下栽培植物的工序。
[0029]本发明的植物的特征在于，是利用上述制造方法制造的。
[0030]本发明不仅不需要使用转基因技术，而且对任何植物品种均适用，所以可活用的作物、果树很多。本发明通过提高农产品的氨基酸含量，从而能够强化所需农产品的品牌力，有助于创造出新品牌。
[0031]如果采用本发明，能够提高和/或改善农产品的氨基酸的含量、组成，因而赋予农产品很大的附加价值。例如，如果采用本发明，则可期待提高春菊、菠菜、小松菜、波士顿生菜、中国菜心、卷心菜、胡萝卜、茶、毛豆等农产品的氨基酸含量，也有助于开发高功能?高附加价值的特定保健用蔬菜。另外，通过分析农产品的代谢物，或者使用碳、氮和/或硫的同位素进行分析，能够容易地确定出使用了本发明的植物，所以容易行使权利。【专利附图】

【附图说明】
[0032]图1是表示在各种栽培条件下培育的、播种4周后(a)或播种5周后(b)的、拟南芥中含有的总游离氨基酸含量的图。
[0033]图2是表示在各种栽培条件下培育的、播种4周后的拟南芥中含有的各种氨基酸(脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、蛋氨酸、组氨酸、精氨酸、GABA、羟脯氨酸、高丝氨酸)的单位鲜重的量的图(a)，以及将对照区(Cont)设为I时的比率(b)。
[0034]图3是表示在各种栽培条件下培育的、播种5周后的拟南芥中含有的各种氨基酸(丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸、GABA、羟脯氨酸、高丝氨酸)的单位鲜重的量的图(a)，以及将对照区(Cont)设为I时的比率(b)。
[0035]图4是表示施用了谷胱甘肽的拟南芥中的代谢物质的生成量的增减的图。
[0036]图5是表示施用了谷胱甘肽并调节了收获前的光条件的拟南芥的叶内的各氨基酸的含量的图。
[0037]图6是表示施用了谷胱甘肽并调节了收获前的光条件的拟南芥的叶内的丝氨酸的含量的图。
[0038]图7是表示施用了谷胱甘肽并调节了收获前的光条件的拟南芥的叶内的天冬酰胺的含量的图。
[0039]图8是将对照区设为I时表示在低温条件下施用了谷胱甘肽的菠菜中的各游离氨基酸含量的图。
[0040]图9是将对照区设为I时表示在高温条件下施用了谷胱甘肽的菠菜中的各游离氨基酸含量的图。
[0041]图10是将对照区设为I时表示在高温条件下施用了谷胱甘肽的小松菜中的各游
离氨基酸含量的图。
[0042]图11是将对照区设为I时表示在低温条件下施用了谷胱甘肽的小松菜中的各游
离氨基酸含量的图。
[0043]图12a是表示施用了各种浓度的谷胱甘肽的茼蒿(春菊)中的各游离氨基酸含量的图。
[0044]图12b是表示将施用了各种浓度的谷胱甘肽的茼蒿(春菊)中的各游离氨基酸含量按照对照区(cont)为I进行换算的图。
[0045]图13是表示施用了谷胱甘肽粒剂的番茄中的果实的各游离氨基酸含量的图。
[0046]图14是表示施用了谷胱甘肽粒剂的韭菜中的精氨酸和赖氨酸的含量的图。
【具体实施方式】 [0047]若对本发明的一个实施方式进行说明，如下所示。应予说明，为慎重起见申明本发明不限定于该实施方式。
[0048]〔1.氨基酸含量促进剂〕
[0049]本说明书中使用的情况下，“氨基酸含量促进剂”是指能够提高植物的氨基酸含量的物质，增加谷胱甘肽的合成或谷胱甘肽生成量的物质也包含在氨基酸含量促进剂中。本发明中，优选氨基酸含量促进剂是通过与植物接触被植物吸收而发挥作用的物质，优选谷胱甘肽或其衍生物。
[0050]如后述的实施例所示，与在通常的条件下栽培的植物或施用硝酸铵栽培的植物相t匕，施用氧化型谷胱甘肽或还原型谷胱甘肽栽培的植物中，总氨基酸含量显著增加。另外，特定的氨基酸(例如，丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、蛋氨酸、组氨酸、精氨酸、GABA、羟脯氨酸、高丝氨酸)的含量增加到本领域技术人员基于仅通过培育管理来提高植物的氨基酸含量的现有技术所无法预测的特别显著的程度。
[0051]具有生物体内的解毒作用、抗氧化作用的谷胱甘肽是由Y -Glu- Cys 一 Gly构成的三肽，是植物中的硫的贮存形态和运输形态。作为谷胱甘肽的衍生物，可举出高谷胱甘肽(homoglutathione)、羧基丙基谷胱甘肽、二羧基乙基谷胱甘肽等,只要与谷胱甘肽同样地具有提高植物的氨基酸含量的功能就不限定于这些。豆科植物中具有与谷胱甘肽同样的功能的高谷胱甘肽是谷胱甘肽的Gly被取代成β — Ala而得的化合物。另外，谷胱甘肽或上述衍生物的酯也包含在谷胱甘肽的衍生物中。即，本发明中使用的氨基酸含量促进剂可以是选自氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽、高谷胱甘肽、羧基丙基谷胱甘肽、二羧基乙基谷胱甘肽以及它们的酯中的物质。
[0052]本发明中使用的谷胱甘肽其制造条件没有特别限定，可以是人工合成的物质，也可以是来自天然物的物质。另外，其精制度可以高也可以低，可以利用市售品。
[0053]谷胱甘肽或其衍生物可以是还原型也可以是氧化型，大多情况下优选是氧化型。
[0054]目前为止本发明人等对植物的发芽、生长、开花的机制进行了研究，发现了如下内容:通过在含有谷胱甘肽的再分化培养基中培养从植物体的一部分衍生的愈伤组织，从而促进生根，高效且短期间 内由愈伤组织得到再分化体(专利文献5等)；通过使用谷胱甘肽进行植物的栽培，能够显著增加该栽培植物的种子数、花数；通过使用谷胱甘肽栽培植物激素(例如赤霉素)的合成功能或应答功能具有变异的植物体，能够显著增加侧芽，随之也能够着增加花(荚)数(专利文献8等)；提高植物体的糖度(专利文献10等)。但是，使用谷胱甘肽或其衍生物作为氨基酸含量促进剂的、即用于简便地提高植物的氨基酸含量这样的用途是与现有的该物质的用途完全不同的新用途。另外，可得到氨基酸含量提高的植物这样的效果是由现有的用途完全无法预测到的。这样本发明是基于本发明人等全新的发现而完成的。
[0055]为了实现这样的用途，可以直接使用作为化合物的氨基酸含量促进剂，也可以使用含有氨基酸含量促进剂的组合物，另外，还可以使用试剂盒中具备的氨基酸含量促进剂或组合物。通常，组合物是指“二种以上的成分整体均质存在，被控制成一种物质的形态”，本说明书中使用的情况下，“组合物”是指各种成分被包含在一种物质中的形态。另外，本说明书中使用的情况下，“试剂盒”是指组合物中应含有的各种成分分别包含在不同的容器(例如，瓶、板、管、盘等)中且全部容器作为整体被打包成I个的形态，可以具备后述的支承体或培养容器。
[0056]若使用氨基酸含量促进剂，能够简便地提高植物的氨基酸含量，并且能够制造氨基酸含量提高的植物。例如，可以使氨基酸含量促进剂包含在培养基中，使用该培养基栽培植物，也可以对植物体整体或一部分(茎、叶等)以液体形态的组合物形式散布、滴加、涂布氨基酸含量促进剂。另外，植物是水草这样的水生植物时，可以作为底床添加剂由根吸收，或者使固体制剂缓慢溶解在水中。因此，与上述现有技术比较，不需要熟练的技术、特殊的技术、特殊的生产装置等就能简便地提高植物的氨基酸含量，而且能够极简便地得到氨基酸含量提高的植物。
[0057]本说明书中使用的情况下，“氨基酸含量提高的植物”是指与在氨基酸含量促进剂不存在下栽培的同一种植物相比氨基酸含量提高的植物。若使用氨基酸含量促进剂栽培植物，则与不使用氨基酸含量促进剂栽培的情况相比，能够提高该植物的氨基酸含量。应予说明，植物中的氨基酸含量的测定方法遵照一直以来公知的步骤即可。
[0058]在将氧化型谷胱甘肽(GSSG)以液体形态的组合物的方式施用于植物的情况下，氨基酸含量促进剂的使用浓度优选为0.2mM~5mM，更优选为0.5mM~5mM，进一步优选为ImM~5mM，更进一步优选为2mM~5mM。只要为该范围，就能够进一步提高制造的植物的氨基酸含量。液体形态的组合物可以通过使氨基酸含量促进剂溶于适当的溶剂(例如，水等)中而制备。水可以利用去离子水、蒸馏水、反渗透水、自来水等。溶剂也可以含有氨基酸含量促进剂以外的成分，例如市售的各种肥料、表面活性剂等。应予说明，该浓度可以根据使用的植物的种类、使用时期等适当地变更。
[0059]植物使用的氨基酸含量促进剂的量可以根据其浓度、施用条件调节，关于其量，可以利用实际供于植物的氨基酸含量促进剂的总量来定义。
[0060]例如，作为用 氨基酸含量促进剂湿润用于栽培植物的支承体的方法，可例示将含氨基酸含量促进剂的溶液从支承体上部散水的方法、在装满含氨基酸含量促进剂的溶液的容器内将支承体置床从底面灌水的方法等。从支承体上部散水的情况下，从上部的散水量可以根据氨基酸含量促进剂的使用条件.盆容积等栽培条件适当地调整，例如假定使用ImM的GSSG的情况下，每个个体优选为5mL/次~150mL/次，更优选为8.5mL/次~IOOmL/次，进一步优选为20mL/次~50mL/次。从底面灌水的情况下，只要含氨基酸含量促进剂的溶液使支承体实质上均匀湿润即可，作为这样的情况下使用的液量?浓度，也可以定义为施用于单位土壤的氨基酸含量促进剂的量。
[0061]将液体形态的组合物直接散布于植物的情况下，只要使用喷雾机等将溶液呈雾状散布于植物的一部分或全体即可。溶液的散布量根据溶液中的氨基酸含量促进剂的浓度适当地设定。散布次数可以是I次或2次以上，优选在栽培开始时散布。并且根据氨基酸含量促进剂的使用条件，可以在栽培期间中通过适当(例如每隔数日(2日~7日))追加进行散布。
[0062]应予说明，含氨基酸含量促进剂的培养基或溶液优选在氨基酸含量促进剂被调整到上述浓度范围内后供于植物，但只要在被植物获取的阶段使氨基酸含量促进剂与培养基或溶液混合即可。因此，不含有氨基酸含量促进剂的培养基或溶液和辅助剂可以同时或连续地直接供于植物的外表面，也可以供于植物的附近(支承体或土壤)。通过采用这样的步骤，植物能够获得混合有辅助剂的培养基或溶液。
[0063]〔2.用于提高植物的氨基酸含量的组合物〕
[0064]本发明提供用于提高植物的氨基酸含量的组合物(以下，也称为“本发明的组合物”)。本发明的组合物含有氨基酸含量促进剂即可。
[0065]如果将本发明的组合物与上述氨基酸含量促进剂同样地使用，则能够简便地提高植物的氨基酸含量，并且能够制造氨基酸含量提高的植物。[0066]如上所述，本发明中的氨基酸含量促进剂优选为谷胱甘肽或其衍生物。谷胱甘肽中，有还原型谷胱甘肽(以下，称为“GSH”)和氧化型谷胱甘肽(以下，称为“GSSG”)，本发明中使用的谷胱甘肽可以是任一个类型。无论是使用GSSG的情况还是使用GSH的情况，如后述实施例所示，均能够得到与对照区相比全部氨基酸的含量更高的植物。应予说明，“氧化型谷胱甘肽”被定义为2分子还原型谷胱甘肽由二硫键连接而成的分子。应予说明，GSH具有容易氧化的性质是本领域技术人员所熟知的。因此，如果本发明的组合物中含有GSH作为氨基酸含量促进剂，则本发明的组合物中含有不少GSSG。换言之，本发明的组合物中作为谷胱甘肽可以GSH和GSSG以混合的状态被含有。另外，可以使本发明的组合物中含有GSH，在其保存时或使用时，成为被氧化成GSSG的形态而被利用，也可以在施用于植物后成为被氧化成GSSG的形态而被利用。应予说明，将GSH氧化成GSSG的方法没有特别限定。例如，能够通过空气氧化将GSH容易地转换GSSG。另外，可以用一直以来公知的所有人为方法将GSH转换成GSSG。
[0067]只要在不损害氨基酸含量促进剂的作用效果的范围，本发明的组合物中可以含有其它的成分。例如，本发明的组合物可以溶于水或一直以来公知的液体载体等而以液剂、乳剂、凝胶剂等形态提供。作为这样的液体载体，可举出二甲苯等芳香族烃类；乙醇、乙二醇等醇类；丙酮等酮类；二《*恶烷、四氢呋喃等醚类；二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙烯腈等，但不限于这些。另外，本发明的组合物也可以是将氨基酸含量促进剂担载于固体的载体成分的固体制剂、粉剂等。作为这样的固体的载体成分，可例示滑石、粘土、蛭石、硅藻土、高岭土、碳酸钙、氢氧化钙、白土、硅胶等无机物；小麦粉、淀粉等有机物等，但不限于这些。另外，本发明的组合物可以适当地配合其它的辅助剂。作为这样的辅助剂，例如可举出烷基硫酸酯类、烷基磺酸盐、烷基芳基磺酸盐、二烷基磺基琥珀酸盐等阴离子表面活性剂；高级脂肪族胺的盐类等阳离子表面活性剂；聚氧乙二醇烷基醚、聚氧乙二醇酰基酯、聚氧乙二醇多元醇酰基酯、纤维素衍 生物等非离子表面活性剂；明胶、酪蛋白、阿拉伯胶等增粘剂；增量剂、粘合剂等。
[0068]如后述的实施例所示，本发明的组合物的形态没有特别限定，可以是液体、片剂、散剂或颗粒剂的形态。例如，以液体形态提供时，可以将本发明的组合物包含在植物培育时使用的培养基等中，也可以散布、滴加、涂布在培育点、芽、叶、茎等植物的一部分或整体。应予说明，本说明书中使用的情况下，用于栽培植物的“培养基”包含土壤、土壤改良剂。
[0069]另外，本发明的组合物以片剂、散剂或颗粒剂提供时，可以使其包含在植物培育时使用的培养基中，应用于水上栽培的植物时可以放入水中使其缓慢溶解。也可以以用于溶于水的固体制剂等提供，在使用时溶于水。另外，可以将本发明的组合物与一直以来公知的肥料、植物激素等试剂混合而给予植物。
[0070]应予说明，如后述的实施例所示，施用本发明的组合物栽培的植物与施用氮肥料(硝酸铵)栽培的植物相比，氨基酸含量显著提高。这表示想要提高氨基酸含量不一定非要并用现有的氮肥料。这样，本发明的组合物可以不含氮源。
[0071]另外，本发明提供用于提高植物的氨基酸含量的试剂盒(以下，也称为“本发明的试剂盒”)。本发明的试剂盒只要具备含有氨基酸含量促进剂的组合物(本发明的组合物)或氨基酸含量促进剂即可。另外，本发明的试剂盒可以用于制造氨基酸含量提高的植物。
[0072]本发明的试剂盒可以具备这些物质以外的其它成分。氨基酸含量促进剂和上述其它成分可以装入以适当的容量和/或形态包含它们的I个容器中而提供，也可以分别装入不同的容器中而提供。另外，可以具备用于培育植物的器具、培养基等。另外，为了实现提高植物的氨基酸含量这样的用途，本发明的试剂盒优选具备记载了用于提高植物的氨基酸含量的使用步骤的说明书，或者具备记载了用于制造氨基酸含量提高的植物的使用步骤的说明书。“说明书”可以被书写或印刷在纸或其它的介质上，或者被刻录在磁带、计算机可读取的盘或带、CD - ROM等电子介质上。本发明的试剂盒可以用于构成上述组合物，也可以分别具备上述组合物所含的物质，也可以分别具备上述组合物和附加成分。
[0073]将本发明的组合物或氨基酸含量促进剂施用于植物的时期没有特别限定，可以在植物能不断吸收氨基酸含量促进剂的条件下施用本发明的组合物或氨基酸含量促进剂，也可以在栽培期间在能间歇地吸收氨基酸含量促进剂的条件(例如，以每周I次、每周2次这样的间隔施用的条件)下施用本发明的组合物或氨基酸含量促进剂，也可以仅在特定的培育时期施用本发明的组合物或氨基酸含量促进剂。通过间歇地施用本发明的组合物或氨基酸含量促进剂，能够减少氨基酸含量促进剂的使用量，能够减少植物栽培所需成本。应予说明，间歇地施用本发明的组合物或氨基酸含量促进剂的情况下，优选按一定的时间间隔施用，但并不局限于此，也可以按不定的时间间隔施用。例如，可以从播种植物的种子的时候开始施予本发明的组合物或氨基酸含量促进剂。具体而言，按播种后2个月~半年以内左右对直到收获期的植物施予本发明的组合物或氨基酸含量促进剂的情况下，可以在播种日施予，优选在播种日~播种后4周，更优选在播种日~播种后7周，进一步优选在播种日~收获日，定期施予。该情况下，作为施予本发明的组合物或氨基酸含量促进剂的间隔，没有特别限定，优选I周I次~4次，更优选2~3次。
[0074]另外，施用本发明的组合物或氨基酸含量促进剂的时间间隔没有特别限定，根据施用的氨基酸含量促进剂的浓度、作为对象的植物以及施用本发明的组合物或氨基酸含量促进剂的时期等决定即可。通常作为适用对象的植物是草本植物的情况下，优选每周I次~每周2次，或者与追肥时期同时期进行。
[0075]在假定种子、果实作为氨基酸含量提高的收获物的情况下，优选在从营养生长期向生殖成长期的转换时期的前后(包含从营养生长期向生殖成长期的转换时期)或其后的花芽形成期或发生向目标收获物的转换的时期施用。根据这样的构成，由于仅在特定时期使用本发明的组合物或氨基酸含量促进剂，能够减少植物栽培所需成本。
[0076]仅在特定时期施用本发明的组合物或氨基酸含量促进剂的情况下，可以在特定时期的一定期间，在植物能不断吸收氨基酸含量促进剂的条件下施用本发明的组合物或氨基酸含量促进剂，也可以在特定时期的一定期间，在能间歇吸收氨基酸含量促进剂的条件下施用本发明的组合物或氨基酸含量促进剂。通过在特定时期的一定期间，间歇地施用本发明的组合物或氨基酸含量促进剂，能够进一步减少植物的栽培成本。
[0077]施用的氨基酸含量促进剂的量没有特别限定，根据植物的种类适当地设定即可，施用GSSG作为氨基酸含量促进剂时，在栽培期间对每个个体施用的GSSG优选以0.02mmol~0.5mmol的方式提供，更优选为0.05mmol~0.5mmol。另外，这样施用的氨基酸含量促进剂更优选在上述的使用浓度的范围使用，但不局限于此。
[0078]另外，可以从播种后且育出苗后等某种程度培育后开始，在规定的期间施用本发明的组合物。例如，对甜玉米等稻科植物施用本发明的组合物的情况下，可以在育苗后施用本发明的组合物。该情况下，可以使制作的栽植苗的培养基预先含有本发明的组合物，也可以在将苗栽植到该培养基后，定期对培养基施用本发明的组合物。在移植苗后，将本发明的组合物提供给培养基的情况下，更具体的施用时期没有特别限定，例如，优选在从移植苗后开始到收获期间，I周施予I次~4次，更优选2~3次。作为使用量，没有特别限定，根据植物的种类适当地设定即可。
[0079]另外，也可以从收获期反算而设定施予本发明的组合物或氨基酸含量促进剂的时期。例如，可以设定成从收获期的10天前开始施予，或者从20天前开始施予等。在此所说的收获期在种子为收获物的情况下指种子收获的时期，在叶为收获物的情况下指叶的收获期，与收获物的样式无关。
[0080]将种子、果实作为收获物的情况下，可以根据花期，设定施予本发明的组合物或氨基酸含量促进剂的时期。例如，可以在花蕾的时期施用，可以在花瓣散落后施用，也可以在花蕾的时期~果实成熟期间、开花时期~果实成熟期间、花瓣散落~果实成熟期间施用本发明的组合物或氨基酸含量促进剂，可以涂布在花序上。
[0081]应予说明，出于顺利制备含氨基酸含量促进剂的溶液的目的而使用时，本发明的组合物优选为片剂、散剂或颗粒剂的形态。而且，优选以得到的溶液中的氨基酸含量促进剂的最终浓度在上述范围内 的方式使组合物中含有氨基酸含量促进剂。
[0082]这样，在栽培期间施用本发明的组合物或氨基酸含量促进剂的情况下，如上所述可以将肥料和/或植物激素等试剂与该组合物混合施用于植物。该情况下，施予该肥料等与组合物的混合物的时期没有特别限定，可以根据上述的例示，也可以根据施予肥料等的优选的时期。
[0083]本说明书中，“植物”是指整株植物、植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、种子等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部、维管束、栅栏组织、海绵组织等)或者植物培养细胞或者各种形态的植物细胞(例如，悬浮培养细胞)、原生质体、叶的切片、愈伤组织
坐寸ο
[0084]作为本发明的适用对象的植物，没有特别限制，可适用于各种单子叶植物、双子叶植物、树木等全体植物。例如，作为单子叶植物，例如可例示包含紫萍属植物(紫萍)和浮萍属植物(稀脉萍和品藻)的浮萍科植物，包含卡特兰属植物、蕙兰属植物、石斛兰属植物、蝴蝶兰属植物、万代兰属植物、兜兰属植物、文心兰属植物等的兰科植物，香蒲科植物、黑三棱科植物、眼子菜科植物、茨藻科植物、芝菜科植物、泽泻科植物、水鳖科植物、霉草科植物、稻科植物(甜玉米等玉米等)、莎草科植物、棕榈科植物、天南星科植物、谷精草科植物、鸭妬草科植物、雨久花科植物、灯心草科植物、百部科植物、百合科植物、石蒜科植物、薯蓣科植物、鸢尾科植物、芭蕉科植物、姜科植物、美人蕉科植物、水玉簪科植物等。
[0085]另外，作为双子叶植物，例如可例示包含牵牛属植物(牵牛花)、打碗花属植物(日本打碗花、打碗花、肾叶打碗花)、番薯属植物(厚藤、甘薯)、菟丝子属植物(日本菟丝子、南方菟丝子)的旋花科植物，包含石竹属植物(康乃馨等)、繁缕属植物、米努草属植物、卷耳属植物、漆姑草属植物、无心菜属植物、种阜草属植物、孩儿参属植物、滨繁缕属植物、大爪草属植物、拟漆姑属植物、蝇子草属植物、剪秋萝属植物、女娄菜属植物、狗筋蔓属植物的石竹科植物，木麻黄科植物、三白草科植物、胡椒科植物、金粟兰科植物、杨柳科植物、杨梅科植物、胡桃科植物、桦木科植物、山毛榉科植物、榆科植物、桑科植物、荨麻科植物、川草科植物、山龙眼科植物、铁青树科植物、檀香科植物、槲寄生科植物、马兜铃科植物、帽蕊草科植物、蛇菰科植物、寥科植物、藜科植物、苋科植物、紫茉莉科植物、假繁缕科植物、商陆科植物、番杏科植物、马齿觅科植物、木兰科植物、昆栏树科植物、连香树科植物、睡莲科植物、金鱼藻科植物、毛茛科植物、木通科植物、小檗科植物、防己科植物、蜡梅科植物、樟科植物、罂粟科植物、山柑科植物、十字花科植物、茅膏菜科植物、猪笼草科植物、景天科植物、虎耳草科植物、海桐花科植物、金缕梅科植物、悬铃木科植物、蔷薇科植物、豆科植物、酢浆草科植物、栊牛儿苗科植物、亚麻科植物、蒺藜科植物、芸香科植物、苦木科植物、楝科植物、远志科植物、大戟科植物、水马齿科植物、黄杨科植物、岩高兰科植物、马桑科植物、漆树科植物、冬青科植物、卫矛科植物、省沽油科植物、茶茱萸科植物、槭树科植物、七叶树科植物、无患子科植物、清风藤科植物、凤仙花科植物、鼠李科植物、葡萄科植物、杜英科植物、椴树科植物、锦葵科植物、梧桐科植物、猕猴桃科植物、山茶科植物、金丝桃科植物、沟繁缕科植物、柽柳科植物、堇菜科植物、刺篱木科植物、旌节花科植物、西番莲科植物、秋海棠科植物、仙人掌科植物、瑞香科植物、胡颓子科植物、千屈菜科植物、石榴科植物、红树科植物、八角枫科植物、野牡丹科植物、菱科植物、柳叶菜科植物、小二仙草科植物、杉叶藻科植物、五加科植物、伞形科植物、山茱萸科植物、岩梅科植物、山柳科植物、鹿蹄草科植物、杜鹃科植物、紫金牛科植物、报春花科植物、蓝雪科植物、柿树科植物、山矾科植物、野茉莉科植物、木樨科植物、醉鱼草科植物、龙胆科植物、夹竹桃科植物、萝蘑科植物、花惹科植物、紫草科植物、马鞭草科植物、唇形科植物、茄科植物(番茄等)、玄参科植物、紫葳科植物、胡麻科植物、列当科植物、苦苣苔科植物、狸藻科植物、爵床科植物、苦槛蓝科植物、透骨草科植物、车前科植物、茜草科植物、忍冬科植物、五福花科植物、败酱科植物、川续断科植物、葫芦科植物、桔梗科植物、菊科植物等。另外，作为本发明的对象的植物不仅是上述例示的植物的野生型，也可以是变异体、转化体。
[0086]应予说明，如后述的实施例所示，植物中的氨基酸含量提高的部位没有特别限定，可以是收获物也可以是其以外的部位(例如，仅用于提取氨基酸的目的的器官或组织)。“收获物”是该植物中成 为食粮的部分，例如，食用果实的植物的情况下指果实，食用种子的植物的情况下指种子，食用茎的植物的情况下指茎，食用根的植物的情况下指根，食用花的植物的情况下指花，食用叶的植物的情况下指叶等，但不限于这些。
[0087]〔3.提高植物的氨基酸含量的方法和制造氨基酸含量提高的植物的方法〕
[0088]本发明提供提高植物的氨基酸含量的方法(以下，称为“本发明的方法”)。本发明的方法包含将本发明的组合物或氨基酸含量促进剂施用于植物的工序即可。
[0089]由于氨基酸含量促进剂能够通过与植物接触而被植物吸收，所以上述工序可以是使氨基酸含量促进剂与目标植物接触的工序，也可以是使目标植物吸收氨基酸含量促进剂的工序。作为使植物吸收氨基酸含量促进剂的步骤，没有特别限定，例如，可以通过在含有本发明的组合物或氨基酸含量促进剂的培养基(包括土壤和土壤改良剂)栽培植物而从根吸收，也可以在栽培植物期间将本发明的组合物或氨基酸含量促进剂以粒剂或液肥的方式施予、吹送或涂布从而使植物吸收氨基酸含量促进剂。另外，可以使本发明的组合物或氨基酸含量促进剂吸附于离子交换树脂等吸附体，将其埋设于土壤等配置在培养基中的基础上，栽培该植物。即，本发明的方法进一步包含在氨基酸含量促进剂的存在下栽培植物的工序。应予说明，本发明的方法中的工序的具体步骤依照如上所述的本发明的组合物或氨基酸含量促进剂的使用方式即可。
[0090]另外，施用的氨基酸含量促进剂的浓度在能提高植物的氨基酸含量的范围内，可以是高浓度也可以是低浓度，通过适当地设定被提供的间隔、时期、期间等可得到所希望的效果。例如，与植物接触的氨基酸含量促进剂的浓度范围优选为0.2mM~5mM，更优选为0.5mM~5mM,进一步优选为ImM~5mM,更进一步优选为2mM~5mM。
[0091]在栽培期间施用的氨基酸含量促进剂的总量为特定的范围内时，能够提高植物的氨基酸含量。在栽培期间施予植物的氨基酸含量促进剂的总量可以换算成GSSG的量。例如，4周栽培期间内使用的GSSG的量按每株植物算优选为12.5mg~300mg的范围内，按每升土壤算优选为60mg~1450mg的范围内。施用GSSG栽培植物的期间没有特别限定，优选从收获的4周(28日)前到收获时刻。应予说明，将氨基酸含量促进剂的吸附体等埋设于土壤使用的情况下，与植物体的接触时间变长，与以液肥的形式用于土壤、植物的情况相比以少量的施用就能够发挥效果。
[0092]当然，使用了本发明的方法的植物中氨基酸含量提高。为了确认这点，本发明的方法可以进一步包含测定施用了氨基酸含量促进剂的植物中的氨基酸含量的工序。另外，如后述的实施例5所示，采用本发明的方法，植物的目标收获物中的氨基酸含量得到提高。为了确认这点，本发明的方法可以进一步包含测定施用了氨基酸含量促进剂的植物的目标收获物中的氨基酸含量的工序。应予说明，植物中的氨基酸含量的测定方法依据一直以来公知的步骤即可，也可以是后述实施例中记载的步骤。
[0093]本发明的方法为了控制由本发明产生的效果(即，提高植物的氨基酸含量的效果)，可以进一步包含对应用本发明的植物的收获期的光条件进行控制的工序。如后述的实施例所示，通过组 合氨基酸含量促进剂的施用和收获前的光照射从而存在收获物中的含量上升的氨基酸或含量降低的氨基酸。根据上述构成，能够顺利增加目标氨基酸的含量，或者能够将收获物中的氨基酸的含量比调节到所希望的值。应予说明，光条件的控制可以从明条件下向暗条件下转变，也可以从暗条件下向明条件下转变，还可以变更明条件下的光量，在将收获物收获之前进行即可，只要在控制开始8小时以上后且到控制结束前进行收获，则开始时期和控制期间没有特别限定。另外，控制的开始可以在开始对植物施用氨基酸含量促进剂之前或之后，优选在开始施用氨基酸含量促进剂之后进行。
[0094]另外，本发明的方法为了控制由本发明产生的效果(即，提高植物的氨基酸含量的效果)，可以进一步包含对应用了本发明的植物的栽培期的温度条件进行控制的工序。如后述的实施例所示，即便在植物培育最佳的温度范围外的温度下进行培育的情况下，通过施用氨基酸含量促进剂且控制温度条件也能够提高植物中的氨基酸含量。应予说明，温度条件的控制可以从高温条件向低温条件转变，也可以从低温条件向高温条件转变，只要在播种(优选为发芽)后开始控制，到控制结束之前进行收获，则开始时期和控制期间没有特别限定。另外，控制的开始可以在开始对植物施用氨基酸含量促进剂之前或之后，优选在开始施用氨基酸含量促进剂后进行。
[0095]本发明进一步提供制造氨基酸含量提高的植物的方法(以下，称为“本发明的制造方法”)。本发明的制造方法的特征在于使用上述的本发明的方法，包含将本发明的组合物或氨基酸含量促进剂施用于植物的工序和在氨基酸含量促进剂的存在下栽培植物的工序即可。另外，本发明的制造方法优选进一步包含测定施用了氨基酸含量促进剂的植物中的氨基酸含量的工序，另外还优选进一步包含测定施用了氨基酸含量促进剂的植物的目标收获物中的氨基酸含量的工序。
[0096] 另外，为了确认利用本发明的制造方法制造的植物中氨基酸含量得到提高这点，本发明的制造方法更优选进一步包含与在氨基酸含量促进剂不存在下栽培的植物相比选择氨基酸含量提高的植物的工序。通过具有上述构成，能够顺利地选拔目标植物。
[0097]另外，可以基于代谢物质的生成量或基因的表达量分析是否为利用本发明的制造方法制造的植物。即，为了顺利地选拔利用本发明的制造方法制造的植物，可以包含选择如下所述的在氨基酸含量促进剂的存在下栽培的植物中具有特征分布的植物的工序，在此使用的分布可以是绘制代谢物质的生成量而得的代谢物质生成量分布，也可以是绘制基因的表达量而得的基因表达量分布。此时，根据与预先取得的代谢物质生成量分布或基因表达量分布的比较选择目标植物即可，可以进一步包含取得植物中的代谢物质生成量分布或基因表达量分布的工序。
[0098]取得代谢物质生成量分布的方法没有特别限定，可以使用用于测定代谢物质的量的一直以来公知的方法，例如优选进行依据代谢组学解析等的综合解析。例如，代谢物质生成量分布例如可以如下取得。通过使用层次聚类分析(HCA Hierarchical ClusterAnalysis)，能够将大量代谢物质根据其生成量的模式分类，并将该分类结果用树形图表示(参照图4)，上述层次聚类分析是将使用CE - TOFMS测定的样本间的各代谢物质的生成量的增减的趋势数值化，将表示类似结果的数值分组的分析。另外，通过将增减的程度用热点图(Heat Map)的样式表示，也能够将代谢物质的分类更直观地表示出来。这样而得的树形图和热点图根据施用的条件各自包含特有的趋势，因此能够容易地区别出例如采用本发明的方法得到的植物体与对照区的植物体。
[0099]本发明进一步提供氨基酸含量提高的植物(以下，称为“本发明的植物”)。本发明的植物是利用本发明的制造方法而得的植物。本发明的植物只要是作为“成为本发明的适用对象的植物”而在之前列举的植物就没有特别限定，可以是陆生植物或水生植物，作为水生植物，优选藻类。
[0100]如上所述，本发明的植物能通过比较利用代谢组学解析等取得的代谢物质生成量分布而确定。使用氨基酸含量促进剂的情况下，例如，如图4所示，施用氨基酸含量促进剂(例如GSSG)栽培的植物中的代谢物质生成量分布(也称为本发明的代谢物质生成量分布)与利用其它方法栽培的植物中取得的代谢物质生成量分布不同。因此，通过取得调查对象的植物的代谢物质生成量分布，将其与预先取得的本发明的代谢物质生成量分布比较，能够简便且明确地判定出是否为利用本发明的制造方法而得的植物。
[0101]除研究代谢物质生成量分布的方法以外，例如通过使用DNA微阵列等取得基因表达量分布，对其进行比较，也能够简便且明确地判定出是否为利用本发明的制造方法而得的植物。使用氨基酸含量促进剂的情况下，例如，施用氨基酸含量促进剂(例如GSSG)栽培的植物的基因表达量分布(也称为本发明的基因表达量分布)与用其它方法栽培的植物中取得的基因表达量分布会不同。因此，通过取得调查对象的植物的基因表达量分布，将其与预先取得的本发明的基因表达量分布比较，能够简便且明确地判定出是否为利用本发明的制造方法而得的植物。另外作为其它例子，通过与由谷胱甘肽结合蛋白质的二维电泳图像预先研究的模式变化进行比较，能够判断出是否施用了 GSSG。另外，通过利用PCR法、Southern杂交法、Northern杂交法等确认植物内的目标基因，能够确认本发明的植物不是通过基因导入(转化)而得的植物。此外作为其它的方法，通过研究植物中的氨基酸含量促进剂的量和比例中的至少一方，能够明确地将用本发明的方法得到的植物与用本发明的方法以外的方法得到的植物区别。这样的方法可以单独进行，也可以组合多个进行。通过组合多个进行，能够更明确地区别本发明的植物和用本发明的方法以外的方法得到的植物。
[0102]以下示出实施例，对本发明的实施方式进一步进行详细说明。另外，本说明书中记载的全部文献在本说明书中作为参考引用。
[0103]实施例1
[0104]〔 1:谷胱甘肽对拟南芥中的总游离氨基酸含量的影响〕
[0105]将拟南芥以100 μ E/m2的强度的光在16小时明期/8小时暗期的日照条件下在22°C培养。培养基使用依照下层蛭石(旭工业)2、中层吴羽育苗培养土(吴羽)1、上层蛭石(旭工业)I的比例重叠而形成的土壤进行培育实验。
[0106]本实验中，对植物施予仅水(对照)、lmM的氧化型谷胱甘肽(GSSG)溶液、2mM的还原型谷胱甘肽(GSH)溶液或3mM的硝酸铵(NH4NO3)。具体而言，在65mm(W) X 65mm(D) X 50mm(H)左右的盆中以成为3个个体的方式，I周I次,对根施予每盆25mL的溶液。 [0107]氨基酸含量的测定中使用播种4周后的植物和播种5周后的植物。应予说明，作为检查材料，使用叶(或地上部分)，利用CE - T0FMS(毛细管电泳一飞行时间型质量分析仪:Agilent CE-TOFMS system (Agilent technologies 公司))的阳离子模式、阴离子模式实施测定。针对被检测的峰以m/Z和泳动时间为依据与数据库比较，进行氨基酸的检索?鉴
定.定量。
[0108]CE — TOFMS中使用的检查材料如下制备。首先，将叶试样和含有内标物50 μ M的500 μ L甲醇溶液装入粉碎用管中，用液氮冷冻，使用台式粉碎机进行粉碎。向其中加Λ 500 μ L的氯仿和200 μ L的Milli — Q水进行搅拌，进行离心分离(2300X g、4°C、5分钟)。离心分离后，将水相转移到超滤管(MILLIPORE，Ultrafree MC UFC3LCC离心过滤单元5kDa)400y LXl根。对其进行离心分离(9100 X g、4°C、120分钟)，进行水相的超滤处理。使滤液干固，并溶于50 μ L的Mi 11 i — Q水中，供于测定。
[0109]将使用CE — TOFMS定量的氨基酸含量的结果示于图1。如图1 (a)所示，比较播种4周后的植物中的总游离氨基酸含量时，相对于仅施予水的对照区(I)的总游离氨基酸含量，GSSG处理区(2)或GSH处理区(3)的总游离氨基酸含量分别为约2.8倍或约2.9倍，发现显著上升。另外，在硝酸铵作为氮源的处理区(4)，没有发现氨基酸含量上升。
[0110]播种5周后的植物在全部的条件下，总游离氨基酸含量与播种4周后的植物相比下降，但如图1(b)所示，相对于仅施予水的对照区(I)的总游离氨基酸含量，GSSG处理区
(2)或GSH处理区(3)的总游离氨基酸含量分别为约2.0倍或约2.4倍，发现显著上升。另外，在硝酸铵作为氮源的处理区(4)，与播种4周后的植物的情况不同氨基酸含量稍有上升(约1.37倍)，但与谷胱甘肽处理区相比明显少。
[0111]〔2:谷胱甘肽对拟南芥中的各游离氨基酸含量的影响〕
[0112]图2(a)示出了在与上述同样的条件的氨基酸含量促进剂的存在下，播种后培育4周，用CE - TOFMS定量的拟南芥的各游离氨基酸的量。各氨基酸的绝对量对于每种氨基酸而言有很大不同，但图2示出的任何氨基酸与对照区(Cont)相比，在GSSG处理区和GSH处理区均发现大幅增加。如图2(b)所示，发现许多氨基酸含量都显著增加(约1.5倍~约30倍)。具体而言，发现脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、蛋氨酸、组氨酸、精氨酸的含量明显增加，尤其是发现天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸显著增加。另外，发现GABA、羟脯氨酸、高丝氨酸等构成蛋白质的主要的α氨基酸以外的氨基酸也增加。应予说明，在添加氮肥料(NH4NO3)时，几乎没有发现氨基酸含量的增加。
[0113]图3(a)示出了在与上述同样的条件的氨基酸含量促进剂的存在下，播种后培育5周，用CE - TOFMS定量的拟南芥的各游离氨基酸的量。各氨基酸的绝对量对于每种氨基酸而言有很大不同，但图3所示的任何氨基酸与对照区(Cont)相比，在GSSG处理区和GSH处理区均发现大幅增加。如图3(b)所示，发现许多氨基酸的含量都显著增加(约1.5倍~约20倍)。具体而言，发现丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸的含量明显增加，尤其是发现脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸含量显著增加。另外，发现GABA、羟脯氨酸、高丝氨酸等构成蛋白质的主要的α氨基酸以外的氨基酸也增加。应予说明，添加氮肥料(NH4NO3)时，与对照区比较几乎没有发现氨基酸含量的增加。
[0114]〔3:谷胱甘肽对拟南芥的代谢物质生成量分布的影响〕
[0115]图4是与上述氨基酸分析同时制作对拟南芥进行氧化型谷胱甘肽(GSSG)和还原型谷胱甘肽(GSH)处理时的代谢物质生成量分布，对其进行比较解析而得的图。CE —TOFMS能够检测氨基酸以外的许多代谢物质，在此，在将由CE - TOFMS而得的132个候补物质定量的结果中，使用将测定的样本间的各代谢物质量的增减的趋势数值化、将表示类似结果的数值分组的层次聚类分析(HCA-Hierarchical Cluster Analysis)进行分类。将测定的代谢物质的生成量如图4的树形图所示分类。并且，通过将增减的程度用热点图的样式表示从而更直观地 表示代谢物质的分类。在层次聚类分析和热点图的制作中，使用SampleStat ver3.13 和 PeakStat ver.3.17 (均为 Human Metabolome Technologies 公司制)。由图4能够确认在GSH处理区特征增加的代谢物质的组、在GSSG处理区特征增加的组。这样表示由谷胱甘肽施用区得到特征代谢物质的生成分布，可知能够区别出谷胱甘肽处理过氨基酸提高的植物和未处理的植物。
[0116]实施例2
[0117]〔利用光条件控制谷胱甘肽的氨基酸含量提高效果〕
[0118]在以与实施例1同样的栽培条件培育的拟南芥中，比较照射光(100μΕ/mVs)前(LO)的叶与照射8小时光后(L8)的叶中的氨基酸含量。与实施例1同样地进行氨基酸含量的测量。将对照区(Cont)、ImM GSSG处理区、2mM GSH处理区、3mM硝酸铵(NH4NO3)处理区中的叶内的各氨基酸含量示于图5。
[0119]由谷胱甘肽带来的各游离氨基酸含量提高的程度根据取样时的光条件而异。例如，如图5所示，β —丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸在光照射8小时后(L8)的叶中的含量与光照射前(LO)的叶中的含量相比上升。另一方面，亮氨酸、缬氨酸、组氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、精氨酸、谷氨酰胺在光照射前(LO:暗条件)取样的叶中的含量比光照射8小时后(L8)的叶中的含量高。
[0120]作为通过光照射含量上升的氨基酸的例子，将丝氨酸的含量(nmol/gFW)示于图6。如图6所示，通过将氧化型谷胱甘肽或还原型谷胱甘肽的处理与光照射组合，能够显著提高叶中的丝氨酸含量。这样的显著效果在对照区和硝酸铵施肥区没有观察到。
[0121]作为通过光照射含量下降的氨基酸的例子，将天冬酰胺的含量(nmol/gFW)示于图7。如图7所示，天冬酰胺的含量通过施用氧化型谷胱甘肽或还原型谷胱甘肽而大幅提高，但该效果在光照射前大。这样的效果在对照区和硝酸铵施肥区没有观察到。
[0122]由这些结果可知，除施用谷胱甘肽之外，通过控制收获期的光条件也能够进一步提高氨基酸的含量。
[0123]实施例3 [0124]〔利用栽培温度条件控制谷胱甘肽的氨基酸含量提高效果〕
[0125]〔1:菠菜的栽培温度控制对各游离氨基酸含量的影响〕
[0126]对作为藜科蔬菜的菠菜在施用谷胱甘肽的情况下的栽培条件进行研究。菠菜选用播种后发芽整齐的苗，在恒温箱(明期:14小时/暗期:10小时，光强度:约250μ E/m2/s)中栽培，28天后取样。作为栽培温度，设定低温条件LT (Low Temperature:明期20°C /暗期15°C )和高温条件HT(High Temperature:明期25°C /暗期20°C )这两种。应予说明，菠菜的培育适温范围是本试验中的低温条件，但在高温条件下也能够无问题地培育。
[0127]培养基使用依照下层蛭石(旭工业)2、中层吴羽育苗培养土(吴羽)1、上层蛭石(旭工业)I的比例叠层而形成的土壤。
[0128]本实验中，对植物施予仅水(对照)、lmM氧化型谷胱甘肽(GSSG)溶液、2mM还原型谷胱甘肽(GSH)溶液。具体而言，以每个65mm (W) X 65mm⑶X 50mm⑶左右的盆为I个个体的方式，I周I次,对根施予每盆25mL的溶液。
[0129]与实施例1同样地，作为检查材料使用叶(或地上部分)，利用CE - TOFMS (毛细管电泳一飞行时间型质量分析仪:Agilent CE-TOFMS system (Agilent technologies 公司))的阳离子模式、阴离子模式实施测定。针对被检测的峰以m/Z和泳动时间为依据与数据库比较，进行氨基酸的检索.鉴定.定量。将得到的结果示于图8和图9。
[0130]图8和图9是将对照区设为I来表示进行了谷胱甘肽处理的菠菜的氨基酸含量的图。如图8所示，在低温条件下，由谷胱甘肽带来的效果仅在一部分氨基酸中观察到，其效果小。另一方面，如图9所示，在高温条件下，各种氨基酸含量得到提高。在菠菜中显示出通过施用氧化型谷胱甘肽，使得酪氨酸、甘氨酸、高丝氨酸、苯丙氨酸的氨基酸含量提高到5倍以上。另外，可知在菠菜中与还原型谷胱甘肽相比更优选使用氧化型谷胱甘肽。
[0131]〔2:小松菜的栽培温度控制对各游离氨基酸含量的影响〕
[0132]对作为十字花科蔬菜的小松菜在施用谷胱甘肽的情况下的栽培条件进行研究。小松菜选用播种后发芽整齐的苗，在恒温箱(明期:14小时/暗期:10小时，光强度:约250 μ E/m2/s)中栽培，28天后取样。作为栽培温度，设定低温条件LT (Low Temperature:明期20°C /暗期15°C )和高温条件HT (High Temperature:明期25°C /暗期20°C )这两种。应予说明，小松菜的培育适温范围是本试验中的高温条件，但在低温条件下也能够无问题地培育。
[0133]培养基使用依照下层蛭石(旭工业)2、中层吴羽育苗培养土(吴羽)1、上层蛭石(旭工业)I的比例叠层而形成的土壤。
[0134]本实验中，对植物施予仅水(对照)、lmM氧化型谷胱甘肽(GSSG)溶液、2mM还原型谷胱甘肽(GSH)溶液。具体而言，以每个65mm (W) X 65mm⑶X 50mm⑶左右的盆为I个个体的方式，I周I次,对根施予每盆25mL的溶液。
[0135]与实施例1同样地，作为检查材料使用叶(或地上部分)，利用CE - TOFMS (毛细管电泳一飞行时间型质量分析仪:Agilent CE-TOFMS system (Agilent technologies 公司))的阳离子模式、阴离子模式实施测定。针对被检测的峰以m/Z和泳动时间为依据与数据库比较，进行氨基酸的检索.鉴定.定量。将得到的结果示于图10和图11。
[0136]图10和图11是将对照区设为I来表示进行了谷胱甘肽处理的小松菜的氨基酸含量的图。如图10所示，在高温条件下，由谷胱甘肽带来的氨基酸含量提高的效果仅在β-丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺等一部分氨基酸中观察到。另一方面，如图11所示，在低温条件下，更多的氨基酸的含量得到提高。在小松菜中显示出通过施用还原型谷胱甘肽，使得天冬氨酸、苏氨酸、GABA、异亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸的氨基酸含量提高到2倍以上。另外，可知在小松菜中与氧化型谷胱甘肽相比更优选使用还原型谷胱甘肽。
[0137]由以上的结果可知，通过进行栽培温度的管理，能够更有效地发挥由谷胱甘肽带来的氨基酸含量提高效果。
[0138]实施例4
[0139]〔用于提高氨基酸含量的谷胱甘肽的使用浓度的研究〕
[0140]验证对作为菊科蔬菜的茼蒿(春菊)施用各种浓度的谷胱甘肽时对氨基酸含量的影响。茼蒿选用播种后发芽整齐的苗，在恒温箱(明期:14小时20°C /暗期:10小时15°C，光强度:约250yE/m2/s)中栽培 ，28天后取样。培养基使用依照下层蛭石(旭工业)2、中层吴羽育苗培养土(吴羽)1、上层蛭石(旭工业)I的比例叠层而形成的土壤。
[0141]本实验中，对植物施予仅水(对照)，0.lmM、0.2mM、0.5mM、lmM、2mM、5mM的氧化型谷胱甘肽(GSSG)溶液。具体而言，以每个65mm(W) X 65mm⑶X 50mm⑶左右的盆为I个个体的方式，I周I次,对根施予每盆25mL的溶液。
[0142]与实施例1同样地，作为检查材料使用叶(或地上部分)，利用CE - TOFMS (毛细管电泳一飞行时间型质量分析仪:Agilent CE-TOFMS system (Agilent technologies 公司))的阳离子模式、阴离子模式实施测定。针对被检测的峰以m/Z和泳动时间为依据与数据库比较，进行氨基酸的检索.鉴定.定量。将得到的结果示于图12a和图12b。
[0143]如图12a所示，通过对茼蒿施用GSSG，除了无法检测的半胱氨酸之外，几乎全部游离氨基酸的含量都变动了。GSSG为0.1mM时，除赖氨酸、色氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺之外的氨基酸的含量降低，总游离氨基酸含量降低。以0.2mM~5mM的条件使用的情况下，相对于对照区的总游离氨基酸含量，处理区的游离氨基酸含量浓度依赖性地上升。这表示了对于使用低浓度的GSSG时效果小的氨基酸，通过使用高浓度GSSG也能够提高其含量。
[0144]图12b示出了将对照区的游离氨基酸含量设为I时的各浓度下的处理区中的游离氨基酸含量之比。如图12b所示，使用5mM的GSSG时，总游离氨基酸含量变成24.8倍，显示了特别显著的效果。另外，对于甘氨酸、天冬酰胺、组氨酸、高丝氨酸、谷氨酰胺、精氨酸而言在使用5mM的GSSG时含量上升到约100倍以上，对于精氨酸示出了最大的1070倍这样的显著上升。
[0145]由以上的结果显示在以提高氨基酸含量为目的而使用谷胱甘肽时，优选在
0.2mM~5mM的范围内使用氨基酸含量促进剂。[0146]实施例5
[0147]〔果实中的氨基酸含量提高效果的验证〕
[0148]验证谷胱甘肽对作为爺科蔬菜的圣女果(品种:Chandelier)的效果。购入市售的苗，将其用于实验。购入后，将苗移植到l/2000a(公亩)盆中，驯化栽培6周。作为栽培土壤，使用将下层蛭石(旭工业)6L、中层吴羽育苗培养土(吴羽)3L、上层蛭石(旭工业)3L叠层而形成的土壤。
[0149]驯化栽培后，将在该时刻挂果的番茄果实全部除去。将加工成含有1%的氧化型谷胱甘肽或I %的还原型谷胱甘肽的粒剂状的载体(以下，称为GSSG粒剂或GSH粒剂)各20g分别撒在各盆的地表面，将该日作为实验第O天。另外，准备没有使用任何粒剂的对照区。在实验开始的8天后、20天后、36天后、50天后进行追肥。追肥使用组合S604号(N16%)，每次6kg/a (每个个体为3g(N480mg))。在实验开始的20天后、29天后、57天后回收变红成熟的番茄果实，作为样本。
[0150]与实施例1同样地，将回收的果实作为检查材料使用，利用CE - TOFMS(毛细管电泳一飞行时间型质量分析仪:Agilent CE-TOFMS system (Agilent technologies 公司))的阳离子模式、阴离子模式实施测定。针对被检测的峰以m/Z和泳动时间为依据与数据库比较，进行氨基酸的检索.鉴定.定量。将得到的结果示于图13。
[0151]图13示出了施用了 GSSG粒剂或GSH粒剂时的果实中的氨基酸含量相对于对照区的果实的各氨基酸含量之比。使用GSSG粒剂时，确认了在粒剂处理的20天后回收的果实中氨基酸含量增加。并且，在粒剂处理的29天后回收的果实中，全部氨基酸的含量提高，总游离氨基酸含量变 成2.2倍。另一方面，即便使用GSH粒剂时，也确认了在粒剂处理的20天后一些氨基酸的含量增加，在29天后全部氨基酸含量提高。GSH粒剂处理时的总游离氨基酸含量为对照区的1.5倍，可知优选使用GSSG粒剂。
[0152]在粒剂处理后57天后回收的果实中，氨基酸含量与对照区的含量相近，这暗示了第O天施用的粒剂的效果变弱。
[0153]另外，对在粒剂处理后第20天追肥的氮肥料的效果进行验证，结果在对照区总游离氨基酸含量降低，与此相对使用GSSG粒剂的情况下，氨基酸含量提高。
[0154]由以上的结果显示本发明的方法不仅对作物的叶有效，对果实也能够提高氨基酸含量。另外，显示了本发明中使用的谷胱甘肽不依赖剂形，除液肥之外，还可使用保持谷胱甘肽的粒剂等。
[0155]实施例6
[0156]〔韭菜中的氨基酸含量提高效果的验证〕
[0157]对作为单子叶植物(石蒜科)的韭菜中的氨基酸含量提高效果进行验证。将韭菜植物的种子按3粒/孔的条件在2011年6月8号播种在育苗盘(128孔)中，培育它们后，按6根/株的条件在2011年9月12号移植到盆(l/5000a(公亩))中。作为土壤，将以2:1:1混合砂土:珍珠岩:泥炭土而成的土壤按3L/盆使用。另外，基肥按4g/盆使用固体30号(N — P — K:10 — 10 — 10)。在盆上进行溶液土培栽培，作为追肥，将大塚营养液土培5号(N — P — K:12 — 20 — 20)稀释成EC0.6~1.0dS/m而得的肥料I天2~3次与灌水同时供给。
[0158]将谷胱甘肽的GSSG粒剂按4.8g/盆在2012年7月31号施用。将粒剂施用开始的4周后采集的可食部供于氨基酸含量的测定。将可食部作为检查材料使用，与实施例I同样地，利用CE - TOFMS(毛细管电泳一飞行时间型质量分析仪:Agilent CE-TOFMSsystem (Agilent technologies公司))的阳离子模式、阴离子模式实施测定。针对被检测的峰以m/Z和泳动时间为依据与数据库比较，进行氨基酸的检索.鉴定.定量。将得到的结果不于图14。
[0159]图14示出了进行了 GSSG处理的韭菜中的精氨酸含量和赖氨酸含量。与GSSG未处理区(对照)比较，在GSSG粒剂处理区(GSSG)，精氨酸含量提高到1.8倍，赖氨酸含量提高到1.6倍。由此可知对于作为单子叶植物的韭菜而言，通过谷胱甘肽处理也能够提高氨
基酸含量。
[0160]由此，本发明可以是以下的方式:
[0161][I] 一种用于提高植物的氨基酸含量的组合物，含有氨基酸含量促进剂。
[0162][2]根据I的组合物，上述氨基酸含量促进剂是谷胱甘肽或其衍生物。
[0163][3]根据I或2的组合物，上述氨基酸含量促进剂是氧化型谷胱甘肽或还原型谷胱甘肽或它们的酯。
[0164][4]根据I~3的组合物，是液体、片剂、散剂或颗粒剂的形态。
[0165][5]根据I~4的组合物，不含有氮源。
[0166][6]根据I~5的组合物，用于制造氨基酸含量提高的植物。
[0167][7] 一种用于提高植物的氨基酸含量的试剂盒，具备氨基酸含量促进剂或含有氨基酸含量促进剂的组合物。
[0168][8]根据7的试剂盒，具备记载了用于提高植物的氨基酸含量的使用步骤的说明书。
[0169][9]根据7或8的试剂盒，用于制造氨基酸含量提高的植物。
[0170][10] 一种提高植物的氨基酸含量的方法，包含将氨基酸含量促进剂或含有氨基酸含量促进剂的组合物施用于植物的工序。
[0171][11]根据10的方法，进一步包含在氨基酸含量促进剂的存在下栽培植物的工序。
[0172][12]根据11的方法，使0.1mM~5mM的浓度范围的氨基酸含量促进剂与植物接触。
[0173][13]根据11或12的方法，对每株植物施用的氨基酸含量促进剂的总量为
12.5mg~300mg的范围内。
[0174][14]根据11~13的方法，对每升土壤施用的氨基酸含量促进剂的总量为60mg~1450mg的范围内。
[0175][15]根据10~14的方法，进一步包含对施用了氨基酸含量促进剂的植物中的氨基酸含量进行测定的工序。
[0176][16]根据10~15的方法，进一步包含对施用了氨基酸含量促进剂的植物的目标收获物中的氨基酸含量进行测定的工序。
[0177][17]根据10~16的方法，上述施用的工序连续或间歇地进行。 [0178][18]根据10~17的方法，进一步包含控制植物的收获期的光条件的工序。
[0179][19]根据10~18的方法，进一步包含控制植物的栽培期的温度条件的工序。
[0180][20] 一种使用10~19的方法制造氨基酸含量提高的植物的方法。[0181][21]根据20的方法，进一步包含选择与在氨基酸含量促进剂不存在下栽培的植物相比氨基酸含量提高的植物的工序。
[0182][22]根据20或21的方法，进一步包含选择与在氨基酸含量促进剂不存在下栽培的植物相比目标收获物中的氨基酸含量提高的植物的工序。
[0183][23]根据20~22的方法，进一步包含在氨基酸含量促进剂存在下栽培的植物中选择具有特征代谢物质生成量分布或基因表达量分布的植物的工序。
[0184][24]根据23的方法，进一步包含取得植物中的代谢物质生成量分布或基因表达量分布的工序。
[0185][25]根据I~24的方法，应用对象的植物是陆生植物。
[0186][26]根据I~24的方法，应用对象的植物是水生植物。
[0187][27]根据26的方法，上述水生植物是藻类。
[0188][28] 一种利用20~27的方法制造的植物。
[0189][29]根据28的植物，应用对象的植物是陆生植物。
[0190][30] 根据28的植物，应用对象的植物是水生植物。
[0191][31]根据30的方法或植物，上述水生植物是藻类。
[0192]应予说明，利用上述I~31中使用的氨基酸含量促进剂使植物中的含量提高的氨基酸根据植物种类而异，没有特别限定，优选是选自GABA、谷氨酸、β_丙氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、苏氨酸、羟脯氨酸、亮氨酸、丝氨酸、色氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、组氨酸、高丝氨酸、谷氨酰胺以及精氨酸中的至少I种氨基酸，更优选是选自脯氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、组氨酸、高丝氨酸、谷氨酰胺以及精氨酸中的至少I种氨基酸，特别优选精氨酸。
[0193]本发明不限于上述各实施方式，可以在要求保护的范围内进行各种变更，将不同实施方式中分别公开的技术手段适当组合而得的实施方式也包含在本发明的技术范围内。
[0194]产业上的可利用性
[0195]根据本发明的组合物，能够容易地制造氨基酸含量提高的植物，因此本发明可用于农业、食品产业等产业。认为应用范围普及全部植物?农产品，极其广泛。考虑到如今的健康意愿，氨基酸含量提高的植物的市场性高。
【权利要求】
1.一种用于提高植物的氨基酸含量的组合物，含有氨基酸含量促进剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述氨基酸含量促进剂是谷胱甘肽或其衍生物。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，不含有氮源。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的组合物，其中，含量得到提高的氨基酸是选自GABA、谷氨酸、β -丙氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、苏氨酸、羟脯氨酸、亮氨酸、丝氨酸、色氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、组氨酸、高丝氨酸、谷氨酰胺以及精氨酸中的至少I种氨基酸。
5.一种用于提高植物的氨基酸含量的试剂盒，具备氨基酸含量促进剂或含有氨基酸含量促进剂的组合物。
6.权利要求1~4中任一项所述的组合物或权利要求5所述的试剂盒在制造氨基酸含量提高的植物中的应用。
7.一种提高植物的氨基酸含量的方法，包含将氨基酸含量促进剂或含有氨基酸含量促进剂的组合物施用于植物的工序。
8.根据权利要 求7所述的方法，进一步包含在氨基酸含量促进剂的存在下栽培植物的工序。
9.根据权利要求7或8所述的方法，进一步包含对施用了氨基酸含量促进剂的植物中的氨基酸含量进行测定的工序。
10.根据权利要求7~9中任一项所述的方法，进一步包含控制植物收获期的光条件的工序。
11.根据权利要求7~10中任一项所述的方法，进一步包含控制植物栽培期的温度条件的工序。
12.一种制造氨基酸含量提高的植物的方法，使用权利要求7~11中任一项所述的方法。
13.根据权利要求12所述的方法，进一步包含选择与氨基酸含量促进剂不存在下栽培的植物相比氨基酸含量提高的植物的工序。
14.根据权利要求12或13所述的方法，进一步包含在氨基酸含量促进剂存在下栽培的植物中选择具有特征代谢物质生成量分布或基因表达量分布的植物的工序。
15.—种利用权利要求12~14中任一项所述的方法制造的植物。
【文档编号】A01G1/00GK103987249SQ201280061106
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2012年11月28日 优先权日:2011年12月12日
【发明者】小川健一, 逸见健司, 岩崎郁 申请人:冈山县