一种杭白菊组织培养及繁殖的方法
【专利摘要】本发明公开了一种杭白菊的组织培养和离体快速繁殖的方法，使得在短期内可以获得大量的优质杭白菊种苗，满足市场的需要；所述方法分为无菌材料的获得及诱导培养、芽的增殖和生根、壮苗培养和生根苗移栽；本发明以腋芽为外植体，应用组织培养的方法进行快速繁殖，克服了杭白菊常规扦插和分株繁殖周期长、繁殖系数低、易感染和传播病毒等缺点；用该方法生产出来的组培苗具有病毒少、遗传性稳定等优点。
【专利说明】一种杭白菊组织培养及繁殖的方法
(一)【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物组织培养技术，特别涉及一种杭白菊的组织培养和快速繁苗方法，通过这种方法，可以进行优良种苗规模生产。
(二)【背景技术】
[0002]杭白菊(Chrysanthemum morifolium Ramat)是产于我国浙江的一种药食两用的菊科草本植物，是浙江省八大名药材“浙八味”之一。杭白菊既可作药材，又可制作成饮料供饮用，还可作庭院观赏。杭白菊花中含有挥发油、黄酮类、多酚类、菊甙、嘌呤、胆碱、水苏碱、维生素A、维生素B和氨基酸等。中西医的研究表明，杭白菊具有散风清热，平肝明目，解毒消炎、提神利尿的作用，可用于治疗湿热黄疸、胃痛食少、水肿尿少等症，对中枢神经也有镇静作用。若以菊汤沐浴，有去痒爽身、护肤美容的功能。经常饮用杭白菊，还能增强毛细血管抵抗力，抑制毛细血管的通性，起到抗炎强身的作用。近几年研究发现，杭白菊中还含丰富的镍、锌、铁元素，尤其是铁元素含量很高。铁是细胞中的重要组成成分，细胞新陈代谢中许多酶的活性均需要铁或需要铁作为辅助因子，铁元素在协调锌、钙、镁的体内代谢和人体免疫防御功能方面有重要作用。杭白菊的提取物对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、变形杆菌、伤寒杆菌、霍乱弧菌、乙型溶血链球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、流感病毒均有抑制作用。
[0003]新的研究还发现杭白菊具有治疗高血压、偏头痛、急性结膜炎等功效。因此，杭白菊除了作为食品饮料、保健品以外，还被开发为新型的抑菌和抗高血压药物，受到越来越广泛的关注。
[0004]目前杭白菊的繁殖主要采用扦插繁殖和分株繁殖，繁殖时间长，繁殖系数低，无法满足日益高涨的生产和市场需求。病毒病是杭白菊种植过程中的重要病害之一，而杭白菊扦插繁殖和分株繁殖这些繁殖方法易导致病毒的感染和传播，并且世代相传，逐年加重，致使其品种严重退化，许多杭白菊的优良品种资源得不到保护和利用，直接影响了其花的产量和质量，使杭白菊的经济效益受到一定影响。
[0005]生物技术的快速发展，特别是植物组织和细胞培养技术，为杭白菊的快速繁殖育种研究提供了重要基础。因此，寻找一种快速高效的杭白菊繁殖方法是非常必要的。
[0006]目前国内外对杭白菊组织培养的研究报道均是以叶片、叶柄、下胚轴、茎段和花瓣为外植体进行杭白菊的组织培养(罗紫娟，1987 ;张媛，2008 ;郅慧，2004 ;牛颜冰，2007 ;张娜，2009)，但是这些方法均不能有效的脱去杭白菊体内的病毒，虽然郅慧使用茎尖进行了培养，但是先产生大量愈伤组织，然后从愈伤组织分化成不定芽，通过这个过程获得的不定芽在增殖过程中容易出现变异，影响了种苗原有优良遗传性状。本发明是以杭白菊芽繁芽的方式直接诱导分化，再诱导侧芽分化不定芽进行增殖，通过这种途径获得的不定芽能有效避免继代增殖过程中出现的变异，更好地保持母株原有的优良性状。
(三)
【发明内容】
[0007]本发明目的是提供一种杭白菊的组织培养和离体快速繁殖的方法，使得在短期内可以获得大量的优质杭白菊种苗，满足市场的需要。
[0008]本发明采用的技术方案是:
[0009]一种杭白菊组织培养及繁殖方法，所述方法按如下步骤进行:
[0010](I)无菌材料的获得及诱导培养:切取长势良好、无病虫害的杭白菊幼嫩的腋芽，用自来水冲洗0.5~2h,然后在体积浓度为1%洗洁精的水溶液中振摇2~5mins,用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70~75%乙醇水溶液浸泡30~60s,然后用混合消毒液浸泡10~20mins,再用无菌水冲洗3~5遍；在灭菌的滤纸上吸干水分,用解剖刀剥取0.3~0.6mm的腋芽尖，然后将腋芽尖接种到装丛生芽诱导培养基的培养瓶中，盖上瓶盖并用封口膜封住瓶口，置于培养箱中，在24~26°C，光照1500~25001x条件下培养15~25天；所述混合消毒液为体积比1:200的吐温20和84消毒液的混合液；所述丛生芽诱导培养基为添加6-BA (即6-苄氨基腺嘌呤)1.0~3.0mg/L、NAA (即萘乙酸)0.05~0.5mg/L和谷氨酰胺80~120mg/L的MS基本培养基；
[0011](2)芽的增殖和生根:观察步骤(1)所述24~26°C，光照1500~25001x条件下培养5~15天后，切口部位出现绿色突起，20~40天后出现丛生芽，再培养10~20天，当丛生芽长到2~4cm时，将丛生 芽切下转接到芽增殖培养基中，在24~26°C，光照1500~25001x条件下进行增殖培养，获得大量增殖的丛生苗，再培养6~10天，丛生苗长出2~5条根系，一步完成芽增殖和生根步骤，最终的生根率为90~95%，形成完整植株；所述芽增殖培养基为添加6-BA0.5~2.0mg/L,ΝΑΑ0.05~0.2mg/L、谷氨酰胺80~120mg/L和马铃薯提取物80g/L~120g/L的MS基本培养基；所述马铃薯提取物是将马铃薯洗净，去皮，称取马铃薯80~120克，切成2 X 2cm3的小块，放入500ml去离子水中，煮沸15~25mins，冷却至50~60°C后，用双层纱布过滤，滤液添加到MS基本培养基中，即为在MS基本培养基中添加80g/L~120g/L马铃薯提取物；(本发明所述马铃薯提取物是指马铃薯削皮后于水中煮沸过滤后的滤液，滤液的加入量以煮沸前去皮马铃薯的重量计);
[0012](3)壮苗培养:将生根的丛生苗(即长出2~5条根系的丛生苗)接入1/2MS固体培养基中，在24~26°C，光照1500~25001x条件下进行壮苗培养，获得叶片舒展、叶色浓绿，根系粗壮，苗高3~5cm的小苗；
[0013](4)生根苗移栽:打开瓶盖炼苗2~4天后，将小苗植株上的琼脂和杂物洗净，移栽至消毒后的育苗基质上，浇透水，盖上薄膜，保持湿度80%以上，置通风阴凉处，在24~26°C、光照1500~25001x条件下培养8~12d，杭白菊叶色浓绿，茎正常挺立，实现杭白菊的繁殖；基质干湿适宜，太湿会引起烂根，太干会出现叶片干枯，并定期进行喷药预防病虫害的发生；所述育苗基质为细沙、腐殖土与谷糠灰按照质量比5:2:2的比例配置而成，所述育苗基质的消毒方法为:采用体积浓度0.5%福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖3~5天后揭开薄膜再曝晒基质I~3天，完成对育苗基质的消毒，或者采用体积浓度0.5%福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖3~5天后揭开薄膜再在60°C下干燥2天，完成对育苗基质的消毒。
[0014]进一步，步骤(1)所述丛生芽诱导培养基优选为添加6-BA1.5mg/L、NAA0.2mg/L和谷氨酰胺100mg/L的MS基本培养基。
[0015]进一步，步骤(2)所述的芽增殖培养基优选为添加6-BA1.0mg/L、NAA0.lmg/L、谷氨酰胺100mg/L和马铃薯提取物100g/L的MS基本培养基。[0016]进一步，所述的MS基本培养基终浓度组成为=NH4NO3L 65克/升、KNO3L 9克/升、CaCl2.2Η200.44 克 / 升、MgSO4.7Η200.37 克 / 升、KH2PO40.17 克 / 升、ΚΙ0.83 毫克 / 升、Η3Β036.2 毫克 / 升、MnSO4.4Η2022.3 毫克 / 升、ZnSO4.7Η208.6 毫克 / 升、Na2MoO4 CH2O0.25毫克 / 升、CuSO4.5Η200.025 毫克 / 升、CoCl2.6Η200.025 毫克 / 升、Na2EDTA37.25 毫克 /升、FeSO4.7H2027.85晕克/升、肌醇100晕克/升、甘氨酸2晕克/升、盐酸硫胺素0.4晕克/升、盐酸吡哆醇0.5毫克/升、烟酸0.5毫克/升、蔗糖20~40克/升、琼脂粉7~11克/升，溶剂为水，PH为5.6~6.0。
[0017]本发明所述MS基本培养基包含大量元素、微量元素、铁盐、有机物、蔗糖和琼脂粉。所述大量元素组成是在配置I升(1000毫升)培养基时，加硝酸铵(NH4NO3) 1.65克、硝酸钾(KNO3) 1.9 克、氯化钙(CaCl2.2H20) 0.44 克、硫酸镁(MgSO4.7H20) 0.37 克、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.17克。所述微量元素组成是在配置I升(1000毫升)培养基时，加碘化钾(KI >0.83毫克、硼酸(H3B03)6.2毫克、硫酸锰(MnSO4.4Η20)22.3毫克、硫酸锌(ZnSO4.7Η20)8.6毫克、钥酸钠(Na2MoO4.2Η20) 0.25 毫克、硫酸铜(CuSO4.5Η20) 0.025 毫克、氯化钴(CoCl2.6Η20)0.025毫克。所述铁盐元素组成是在配置I升(1000毫升)培养基时，加乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA) 37.25毫克，硫酸亚铁(FeSO4.7Η20) 27.85毫克。所述有机物组成是在配置I升(1000毫升)培养基时，加肌醇100毫克、甘氨酸2毫克、盐酸硫胺素(VB1) 0.4毫克，盐酸吡哆醇(VB6) 0.5毫克，烟酸(VB5) 0.5毫克。蔗糖浓度是20~40克/升，琼脂粉浓度是7~11克/升。
[0018]本发明所述杭白菊幼嫩腋芽选自浙江桐乡杭白菊基地中长势良好、无病虫害的杭白菊。
[0019]本发明所述1/2MS固体培养基是指将MS基本培养基中大量元素的含量降低为1/2的含量，微量元素、铁盐、有机物和蔗糖均不添加，即终浓度组成为=NH4NO30.825克/升、KNO30.95 克 / 升、CaCl2.2Η200.22 克 / 升、MgSO4.7Η200.185 克 / 升、KH2PO40.085 克 / 升，琼脂粉9克/升，溶剂为水，pH为5.6~6.0。
[0020]本发明所述洗洁精是市售的各种洗洁精，作为清洗剂使用时通常以体积比1:100添加水。
[0021]与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在:
[0022](I)以腋芽为外植体，应用组织培养的方法进行快速繁殖，克服了杭白菊常规扦插和分株繁殖周期长、繁殖系数低、易感染和传播病毒等缺点；用该方法生产出来的组培苗具有病毒少、遗传性稳定等优点；
[0023](2)改进外植体消毒方法:用毒性小并且易降解的84消毒液代替传统的不可降解的氯化汞消毒剂，氯化汞属于重金属有相当大的腐蚀性，并含有剧毒；长期接触更可能引起皮肤过敏或肾病综合症，进入环境对人类食物链也有相当大的破坏性，采用84消毒液对生态环境更安全环保；
[0024]( 3 )对培养基进行了改良，添加了谷胺酰胺抗褐化剂，避免使用活性炭作为抗褐化剂降低琼脂凝固能力的缺点，而抗坏血酸作为抗褐化剂要经过过滤除菌的复杂程序，其他褐化剂又价格昂贵。在培养基中添加经济廉价的马铃薯天然提取物，提取物中的活性因子大大提高了杭白菊芽分化和增殖率；
[0025](4)改进了组培程序，本方法获得的杭白菊不定芽分化和诱导过程，不经愈伤组织脱分化，直接以腋芽繁殖诱导无菌芽，比通过叶片和花瓣为外植体先获得愈伤组织，再从愈伤组织获得的无菌芽材料更快，更容易，而且能有效避免继代增殖过程中造成的种苗变异，提高了其性状的稳定性，保证了种苗的品质和质量，有利于种质资源保存和生产利用，可有效解决杭白菊的优质种苗的供应问题。
[0026](5)在芽增殖阶段直接生根，一次性完成芽增殖和生根培养过程，不需要配置专门的生根培养基进行生根培养过程，常规培养从接种无菌芽到生根要3个月，约90天，本发明方法需要2个半月，约75天，大大节省了培养时间，降低了工厂化生产的成本。
(四)【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1为杭白菊在未添加谷氨酰胺和马铃薯天然提取物的芽增殖培养基(MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.lmg/L)上生长(20 天)情况；
[0028]图2为杭白菊在添加谷氨酰胺(100mg/L)和马铃薯天然提取物(100g/L)的芽增殖培养基(MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.lmg/L)上生长(20 天)情况。
(五)【具体实施方式】
[0029]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0030]本发明所述MS基本培养基包含大量元素、微量元素、铁盐、有机物、蔗糖和琼脂粉:所述大量元素组成是在配置I升(1000毫升)培养基时，加硝酸铵(NH4NO3) 1.65克、硝酸钾(KNO3) 1.9 克、氯化钙(CaCl2.2H20) 0.44 克、硫酸镁(MgSO4.7H20) 0.37 克、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.17克。所述微量元素组成是在配置I升(1000毫升)培养基时，加碘化钾(KI >0.83毫克、硼酸(H3B03)6.2毫克、硫酸锰(MnSO4.4Η20)22.3毫克、硫酸锌(ZnSO4.7Η20)8.6毫克、钥酸钠(Na2MoO4.2Η20) 0.25 毫克、硫酸铜(CuSO4.5Η20) 0.025 毫克、氯化钴(CoCl2.6Η20)0.025毫克。所述铁盐元素组成是在配置I升(1000毫升)培养基时，加乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA) 37.25毫克，硫酸亚铁(FeSO4.7Η20) 27.85毫克。所述有机物组成是在配置I升(1000毫升)培养基时，加肌醇100毫克、甘氨酸2毫克、盐酸硫胺素(VB1)0.4毫克，盐酸吡哆醇(VB6)0.5毫克，烟酸(VB5)0.5毫克。蔗糖浓度是30克/升，琼脂粉浓度是9克/升，溶剂为水，PH为5.6~6.0。
[0031]所述1/2MS固体培养基是指将MS基本培养基中大量元素的含量降低为1/2的含量，微量元素、铁盐、有机物和蔗糖均不添加，即终浓度组成为=NH4NO30.825克/升、KNO30.95 克 / 升、CaCl2.2Η200.22 克 / 升、MgSO4.7Η200.185 克 / 升、KH2PO40.085 克 / 升，琼脂粉9克/升，溶剂为水，pH为5.6~6.0。
[0032]本发明所述洗洁精为浙江传化洗洁精。
[0033]本发明所述封口膜购自山东青岛普朗特生物有限公司。
[0034]所述马铃薯提取物是将马铃薯洗净，削皮，称取马铃薯80~120克，切成2 X 2cm3的小块，放入500ml去离子水中，煮沸15~25mins，冷却至50~60°C后，用双层纱布过滤，滤液添加到MS基本 培养基中，即为在MS基本培养基中添加80g/L~120g/L马铃薯提取物。
[0035]实施例1
[0036](I)野外选种:选择浙江桐乡杭白菊基地中长势良好、无病虫害的杭白菊。[0037](2)无菌材料的获得及诱导培养:切取长势良好、无病虫害的杭白菊幼嫩的腋芽，用自来水冲洗0.5h，然后在体积浓度为1%洗洁精的水溶液中振摇2mins，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70%乙醇水溶液浸泡30s，然后用混合消毒液浸泡lOmins，再用无菌水冲洗3遍；在灭菌的滤纸上吸干水分，用解剖刀剥取0.3mm的腋芽尖，然后将腋芽尖接种到装丛生芽诱导培养基的培养瓶中，盖上瓶盖并用封口膜封住瓶口，置于培养箱中，在240C，光照15001x条件下培养15天；所述混合消毒液为体积比1:200的吐温20和84消毒液的混合液；所述丛生芽诱导培养基为添加6-BA1.0mg/L、NAA0.05mg/L和谷氨酰胺80mg/L的MS基本培养基；
[0038] (3)芽的增殖和生根:观察步骤(1)所述24°C，光照15001x条件下培养5天后，切口部位出现绿色突起，20天后出现丛生芽，再培养10天，当丛生芽长到2cm时，将丛生芽切下转接到芽增殖培养基中，在24°C，光照15001x条件下进行增殖培养，获得丛生苗，再培养6天左右，丛生苗长出2~5条根系，一步完成芽增殖和生根步骤，生根率为90%，形成完整植株；所述芽增殖培养基为添加6-BA0.5mg/L、NAA0.05mg/L、谷氨酰胺80mg/L和马铃薯提取物80g/L的MS基本培养基；
[0039](4)壮苗培养:将生根的丛生苗(长出2~5条根系的丛生苗)接入1/2MS固体培养基中，在24°C，光照15001x条件下进行壮苗培养，获得叶片舒展、叶色浓绿，根系粗壮，苗高3cm的小苗。
[0040](5)生根苗移栽:打开瓶盖炼苗2天后准备进行移栽，移栽前将小苗上的琼脂和杂物洗净，移栽至消毒后的育苗基质上，浇透水，盖上薄膜，保持湿度80%以上，置通风阴凉处，在24°C、光照15001x条件下培养8天，杭白菊叶色浓绿，茎正常挺立，实现杭白菊的繁殖；基质干湿适宜为好，太湿会引起烂根，太干会出现叶片干枯，并定期进行喷药预防病虫害的发生。所述育苗基质为细沙、腐殖土与谷糠灰按照质量比5:2:2的比例配置而成，所述育苗基质的消毒方法为:采用体积浓度0.5%福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖3天后揭开薄膜再曝晒基质I天，完成对育苗基质的消毒。
[0041 ] 实施例2消毒剂对杭白菊外植体生长的影响
[0042]分别用质量浓度10%的过氧化氢(H2O2)水溶液和质量浓度0.1%的氯化汞(HgCl2)水溶液两种消毒剂替代实施例1步骤(2)中的混合消毒液对杭白菊的外植体材料(即腋芽)进行消毒，其它操作同实施例1，观察统计不同消毒剂对杭白菊芽诱导和生长的影响(即观察腋芽尖在丛生芽诱导培养基上的生长)，结果见表1所示。结果表明，混合消毒液和质量浓度0.l%HgCl2的消毒效果基本相同，质量浓度10%的过氧化氢消毒效果稍差，污染率达到10%，生长缓慢。但是质量浓度0.1ffigCl2消毒对芽的诱导有影响，诱导率仅88%，而且外植体有发褐现象，芽的生长也比较慢，可能是HgCl2毒害细胞对芽的诱导有一定的影响。
[0043]表1不同的消毒剂对杭白菊外植体生长的影响
[0044]
【权利要求】
1.一种杭白菊组织培养及繁殖方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行: (1)无菌材料的获得及诱导培养:切取长势良好、无病虫害的杭白菊幼嫩的腋芽，用自来水冲洗0.5~2h，然后在体积浓度为1%洗洁精的水溶液中振摇2~5mins，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70~75%乙醇水溶液浸泡30~60s，然后用混合消毒液浸泡10~20mins,再用无菌水冲洗3~5遍；在灭菌的滤纸上吸干水分，剥取0.3~0.6mm的腋芽尖，然后将腋芽尖接种到装丛生芽诱导培养基的培养瓶中，盖上瓶盖并用封口膜封住瓶口，置于培养箱中，在24~26°C，光照1500~25001x条件下培养15~25天；所述混合消毒液为体积比1:200的吐温20和84消毒液的混合液；所述丛生芽诱导培养基为添加6-BA1.0~3.0mg/L、ΝΑΑ0.05~0.5mg/L和谷氨酰胺80~120mg/L的MS基本培养基； (2)芽的增殖和生根:观察步骤(1)所述24~26°C，光照1500~25001x条件下培养5~15天后，切口部位出现绿色突起，20~40天后出现丛生芽，再培养10~20天，当丛生芽长到2~4cm时，将丛生芽切下转接到芽增殖培养基中，在24~26°C，光照1500~25001x条件下进行增殖培养，获得丛生苗，再培养6~10天，丛生苗长出2~5条根系，完成芽增殖和生根，形成完整植株；所述芽增殖培养基为添加6-BA0.5~2.0mg/L、NAA0.05~0.2mg/L、谷氨酰胺80~120mg/L和马铃薯提取物80g/L~120g/L的MS基本培养基；所述马铃薯提取物是将马铃薯洗净，去皮，称取马铃薯80~120克，切成2 X 2cm3的小块，放入500ml去离子水中，煮沸15~25mins，冷却至50~60°C后，用双层纱布过滤，滤液添加到MS基本培养基中，即 为在MS基本培养基中添加80g/L~120g/L马铃薯提取物； (3)壮苗培养:将生根的丛生苗接入1/2MS固体培养基中，在24~26°C，光照1500~25001x条件下进行壮苗培养，获得叶片舒展、叶色浓绿，根系粗壮，苗高3~5cm的小苗； (4)生根苗移栽:打开瓶盖炼苗2~4天后，将小苗植株上的琼脂和杂物洗净，移栽至消毒后的育苗基质上，浇透水，盖上薄膜，保持湿度80%以上，置通风阴凉处，在24~26°C、光照1500~25001x条件下培养8~12d，杭白菊叶色浓绿，茎正常挺立，实现杭白菊的繁殖；所述育苗基质为细沙、腐殖土与谷糠灰按照质量比5:2:2的比例配制而成，所述育苗基质的消毒方法为:采用体积浓度0.5%福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖3~5天后揭开薄膜再曝晒基质I~3天，完成对育苗基质的消毒，或者采用体积浓度0.5%福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖3~5天后揭开薄膜再在60°C下干燥2天，完成对育苗基质的消毒。
2.如权利要求1所述杭白菊组织培养方法，其特征在于步骤(1)所述丛生芽诱导培养基为添加6-BA1.5mg/L、NAA0.2mg/L和谷氨酰胺100mg/L的MS基本培养基。
3.如权利要求1所述杭白菊组织培养方法，其特征在于步骤(2)所述的芽增殖培养基为添加6-BA1.0mg/L、NAA0.lmg/L、谷氨酰胺100mg/L和马铃薯提取物100g/L的MS基本培养基。
4.如权利要求1所述杭白菊组织培养方法，其特征在于所述的MS基本培养基终浓度组成为:NH4NO31.65 克 / 升、KNO3L 9 克 / 升、CaCl2.2Η200.44 克 / 升、MgSO4.7Η200.37克 / 升、KH2PO40.17 克 / 升、ΚΙ0.83 毫克 / 升、Η3Β036.2 毫克 / 升、MnSO4.4Η2022.3 毫克 /升、ZnSO4.7Η208.6 毫克 / 升、Na2MoO4.2Η200.25 毫克 / 升、CuSO4.5Η200.025 毫克 / 升、CoCl2.6Η200.025 毫克 / 升、Na2EDTA37.25 毫克 / 升、FeSO4.7Η2027.85 毫克 / 升、肌醇 100毫克/升、甘氨酸2毫克/升、盐酸硫胺素0.4毫克/升、盐酸吡哆醇0.5毫克/升、烟酸.0.5毫克/升、蔗糖20~40克/升、琼脂粉7~11克/升，溶剂为水，pH为5.6~6.0。
5.如权利要求1所述杭白菊组织培养方法，其特征在于所述1/2MS固体培养基终浓度组成为:NH4NO30.825 克 / 升、KNO30.95 克 / 升、CaCl2.2Η200.22 克 / 升、MgSO4.7Η200.185克/升、KH2PO40.085克/升，琼脂粉9克/升，溶剂为水，pH为5.6~6.0。
【文档编号】A01H4/00GK103975851SQ201410126818
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年3月31日 优先权日:2014年3月31日
【发明者】邹克琴, 李素芳, 王为民, 张兴涛 申请人:中国计量学院