一种利用氨磺乐灵诱导大蒜四倍体的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用氨磺乐灵诱导大蒜四倍体的方法，本发明选用氨磺乐灵为诱导大蒜四倍体诱变剂，采用最优诱变处理方法，通过研究获得最佳的诱导大蒜四倍体的效果，为大蒜种质创新和新品种选育提供种质资源储备。
【专利说明】一种利用氨磺乐灵诱导大蒜四倍体的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于农业【技术领域】，具体而言，涉及一种利用氨磺乐灵诱导大蒜四倍体的方法。
【背景技术】
[0002]秋水仙素是常用的诱导染色体加倍的化学诱变剂。氨磺乐灵与秋水仙素相比，具有较小的毒性，而且染色体加倍效果更好。目前，氨磺乐灵在多种作物上都成功诱导出多倍{φ (Chalakl996; Va i no! a 2000; Carvalho et al.2005 ；RegO Μ.Μ.et al., 2011),另外还应用在马铃薯(Leire Barandalla et al., 2006)、玫瑰(J.F.Allum et al., 2007)、湖北紫荆(Joshua D.Nadlera et al., 2012)、百合(简佳等，2013)、观赏姜(HamidouF., 2009)、西瓜(阎志红等，2008 ；赵依杰等,2011),栊柑(何建等,2011)兰花(TildenP.等，2011)等作物上。《一种薄皮甜瓜四倍体诱导方法》发明专利(申请号CN201310258679)也是用的氨磺乐灵诱导四倍体。
[0003]大蒜以无性系选育为主，难以进行大蒜种质创新及新品种选育。而倍性育种是大蒜种质创新及新品种选育的一种有效途径。目前大蒜有利用秋水仙素诱导多倍体成功的报道(张素芝等，2006)，未见利用氨磺乐灵诱导大蒜四倍体。虽然秋水仙素是常用的多倍体加倍诱变剂，但毒性大，成本高，诱变效率低，然而，直接使用氨磺乐灵诱导大蒜四倍体成功率低，如何提高大蒜四倍体成功率是本领域技术亟待解决的技术问题。
【发明内容】
[0004]因此针对以上缺点，本发明选用氨磺乐灵为诱导大蒜四倍体诱变剂，通过合理的选择诱变条件，获得四倍体植株，为大蒜种质创新和新品种选育提供种质资源储备。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案:
[0005]本发明一方面涉及一种利用氨磺乐灵诱导大蒜四倍体的方法，其特征在于包括如下步骤:
[0006](I)将1.0mg6-苄氨基腺嘌呤、0.5mg萘乙酸溶解在1LB5基本培养基中，配制成液体培养基和固体培养基两种培养基，将两种培养基pH调整至5.8-6.0,并进行高压灭菌；
[0007](2)将2_12mg氨磺乐灵过滤灭菌后加入到IL高压灭菌好的液体培养基中，分装备用；
[0008](3)大蒜鳞茎经自然晾干打破休眠后，将其鳞芽去皮在自来水下冲洗0.25-1.0h,然后在无菌条件下用75% (质量百分浓度)的酒精消毒浸泡0.51.0-2.0min，在解剖镜下剥离出带2个叶原基0.15-0.25mm左右的茎尖作为外植体；
[0009](4)将剥离的茎尖外植体接种在含有2_12mg/L氨磺乐灵的B5分装好的液体培养基中，暗培养48-144h ；，然后取出茎尖在无菌水中冲洗3-5遍，然后再将茎尖转入固体培养基，培养条件为温度23.0 ±2.(TC，光照25~31 μ mo I.m_2.s-1，光照16h/d。
[0010](5)茎尖在固体培养基上培养50-70d后，形成带根的芽苗(植株)。[0011](6)将获得的植株进行倍性鉴定，通过两种方法进行鉴定，先用植株叶片通过流式细胞仪检测，再通过根尖染色体计数鉴定，进一步验证植株的倍性，从而鉴定出获得的四倍体植株。
[0012]本发明选用氨磺乐灵为诱导大蒜四倍体诱变剂，通过研究获得最佳的诱导大蒜四倍体的效果，为大蒜种质创新和新品种选育提供种质资源储备。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1:染色体计数鉴定结果:其中左图:二倍体染色体；右图:四倍体染色体。
[0014]图2:流式细胞仪检测结果:其中左图:二倍体DNA含量；右图:四倍体DNA含量。
【具体实施方式】
[0015]实施例1
[0016]诱变处理方法:大蒜鳞茎经自然晾干打破休眠后，将其去皮的鳞芽在自来水下冲洗0.5h，然后在无菌条件下用75%的酒精消毒lmin，在解剖镜下剥离出带2个叶原基0.2mm左右的茎尖作为外植体。接种在含有2-12mg/L氨磺乐灵的B5+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L的液体培养基中，暗培养到设定的处理时间48-144h ;然后取出茎尖在无菌水中冲洗3-5遍，再将茎尖转入固体培养基，培养条件为温度23.0±2.0°〇，光照25~311111101.m_2.s—1，16h/d。
[0017]四倍体鉴定方法:将获得的植株进行倍性鉴定，通过流式细胞仪检测和染色体计数两种方法进行鉴定。获得25.6%的四倍体诱导率。而用秋水仙素做对照来比较，秋水仙素四倍体获得率最高为18.9%。
[0018]以上所述， 仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
【权利要求】
1.一种利用氨磺乐灵诱导大蒜四倍体的方法，其特征在于包括如下步骤: (1)将1.0mg6-苄氨基腺嘌呤、0.5mg萘乙酸溶解在1LB5基本培养基中，配制成液体培养基和固体培养基两种培养基，将两种培养基pH调整至5.8-6.0，并进行高压灭菌； (2)将2-12mg氨磺乐灵过滤灭菌后加入到IL高压灭菌好的液体培养基中，分装备用； (3)大蒜鳞茎经自然晾干打破休眠后，将其鳞芽去皮在自来水下冲洗0.5-1.0h，然后在无菌条件下用75% (质量百分浓度)的酒精浸泡1.0-2.0min，在解剖镜下剥离出带2个叶原基0.15-0.25mm左右的茎尖作为外植体； (4)将剥离的茎尖接种在含有2-12mg/L氨磺乐灵的分装好的液体培养基中，暗培养48-144h，然后取出茎尖在无菌水中冲洗3-5遍，再转入固体培养基，培养条件为温度23.0±2.(TC，光照 25 ~31 μ mo I.m 2.s \光照 16h/d ； (5)茎尖在固体培养基上培养50-70d后，形成带根的芽苗植株； (6)将获得的芽苗植株进行倍性鉴定，通过以下两种方法进行鉴定，先用植株叶片通过流式细胞仪检测， 再通过根尖染色体计数鉴定，进一步验证植株的倍性；从而鉴定出获得的四倍体植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于将氨磺乐灵处理后茎尖转入固体培养基上培养，其固体培养基中琼脂粉的浓度为0.6-0.8%。
【文档编号】A01H4/00GK103918554SQ201410143290
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月11日 优先权日:2014年4月11日
【发明者】孔素萍, 徐坤, 刘波, 高莉敏, 刘冰江, 刘贤娴, 陈伟 申请人:山东省农业科学院蔬菜花卉研究所