一种以花瓣为外植体建立蓝晶花小鳞茎再生体系的方法与流程

本发明涉及植物快速繁殖领域，尤其涉及一种以花瓣为外植体建立蓝晶花小鳞茎再生体系的方法。

背景技术：

蓝晶花(Griffinia)为石蒜科(Amaryllidaceae)蓝晶花属，是原产于巴西的热带球根花卉；多生长于植被茂密、潮湿的热带雨林，直径2-3cm，为微型球根植物。自然生长条件下，蓝晶花一般通过分球法分生出侧生小鳞茎而形成新植株。该属植物无法自交，通过种子繁殖需要有两个不同的个体，并且种子成熟要历经长达8个月的时间。因此，营养生长期长、自然繁殖系数低成为了制约蓝晶花属植物扩繁的两个重要因素。

此外，由于原生地森林面积的日益缩减，作为濒危物种的蓝晶花在其原生地已面临灭绝的威胁。因此，通过人工方法建立高效的蓝晶花组培扩繁体系显得尤为重要。

目前，国内外已有关于石蒜科植物的再生体系建立方法的研究，例如：

申请公布号为CN105379618A的发明专利申请文献公开了一种石蒜离体快速繁殖方法，该方法包括如下步骤：取露地种植的石蒜种球，消毒，将母球附近附生的子球取下种植1～2个月；将种球消毒后去掉外麟皮，剥取种芽，进行不定芽的诱导生长培养，获得带有不定芽丛的组织块；将得到的组织块制成纵分组织块，在芽伸长培养基上进行芽伸长培养；得到的不定芽伸长产生侧芽时，进行切分后放入生根培养基中进行诱导生根培养，获得石蒜幼苗。该发明以石蒜的幼嫩小芽为外植体，直接再生大量不定芽，继而得到再生苗，再生效率增高，出芽率为90％以上，污染率降低，培养过程中不会出现反复污染的情况，通过调节培养基条件可提高诱导率并缩短再生周期。

申请公布号为CN102217540A的发明专利申请文献公开了一种中国石蒜的快速繁殖方法，该方法包括：取中国石蒜的种胚，接种于诱导培养基上诱导愈伤组织；将愈伤组织转接于含有蔗糖、NAA和6-BA的MS培养基上诱导不定芽；将不定芽转接于含有蔗糖、NAA和6-BA的MS培养基上诱导小鳞茎；将已展叶的小鳞茎转接于含琼脂和NAA的MS培养基上，光照下诱导生根；将已生根的鳞茎移栽于珍珠岩+腐殖质的移栽基质培养。该发明以中国石蒜的种胚为外植体，先诱导外植体产生愈伤组织，进而诱导不定芽、小鳞茎的发生，最终完成植株再生，为中国石蒜组织培养快速繁殖增添了又一条新途径。该方法不但增殖系数高，一年可生产百万个小鳞茎，能够为快速繁殖种球提供有效途径；而且试管苗分化同步程度高、一致性好，规模化生产开发价值高，具有很好的经济前景。

申请公布号为CN1596600A的发明专利申请文献公开了一种长筒石蒜繁殖方法，该方法以长筒石蒜带茎盘鳞片为外植体，采用“两步法”，即先诱导不定芽，进而诱导小鳞茎的发生。以MS为基本培养基，附加不同种类和浓度的植物生长调节物质诱导小鳞茎。通过该方法小鳞茎(芽)每20天增殖率可达480％，一年可生产百万个小鳞茎。

申请公布号为CN105475143A的发明专利申请文献公开了一种长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法，该方法主要包括以下步骤：步骤1、以长筒石蒜的种子胚或花朵为材料诱导出愈伤组织；步骤2、将愈伤组织顺次进行不定芽诱导培养以及生根诱导培养，即得到长筒石蒜再生植株。该发明利用石蒜种子胚或花朵为外植体诱导愈伤组织获得完整植株，不仅使石蒜的外植体来源更为广泛易得，而且诱导成功率大幅度提高，诱导成功率达到80％以上，相对于传统的利用石蒜鳞茎为外植体进行诱导的方法提高至少30％，从根本上解决了石蒜的快速繁殖的技术问题。此外，通过该种方法诱导培养所得植株也更为健壮，成活率高，生长速度快。

然而，目前尚无关于蓝晶花扩繁体系建立的报道。因此，有必要探究一种更适合于蓝晶花离体扩繁体系建立的再生体系建立方法。

技术实现要素：

本发明提供了一种以花瓣为外植体建立蓝晶花小鳞茎再生体系的方法，该方法可显著提高蓝晶花小鳞茎的诱导率，有效缩短蓝晶花的育种周期。

一种以花瓣为外植体建立蓝晶花小鳞茎再生体系的方法，包括以下步骤：

(1)取蓝晶花花蕾，消毒处理后，切取花瓣，接种于愈伤诱导培养基上，培养获得含小鳞茎的愈伤组织；

(2)将小鳞茎从步骤(2)所述愈伤组织中剥离下来，并转入增殖培养基中，培养获得小鳞茎增殖体；

(3)取所述小鳞茎增殖体，接入生根培养基中，进行小鳞茎的膨大和生根诱导，获得蓝晶花小鳞茎。

关于石蒜属植物扩繁体系的建立已有相关报道，但是两者(石蒜属、蓝晶花属)虽为同科(石蒜科)而形态、生理、生长发育等属性相差较大，所以在组培扩繁体系的建立方法上也存在着较大的差异。

石蒜属植物的鳞茎直径达6-7cm，而蓝晶花属植物的鳞茎直径仅2-3cm，不适合选取娇小的鳞茎为外植体；石蒜属植物易结实，可以选用种子胚；但蓝晶花属植物结实率较低，不适合选用种子、种子胚作为外植体；石蒜属植物一年仅开花一次，且一球仅抽生一个花序，花期较短，而多数蓝晶花属植物一年可多次开花，一球可抽生1-2个花序；因此，蓝晶花属植物花器官易得，本发明将花器官用于组培外植体的来源。

开花前一周含苞期的花苞因花被片未打开，外植体不易受到污染，且花器官幼嫩，诱导力强；作为优选，所述蓝晶花花蕾为处于含苞期且长1.5～2.5cm的花苞。

在消毒处理前，将蓝晶花花蕾(即外植体)进行冷藏可有效减少花蕾表面细菌的污染，有利于降低花苞外植体的污染率。

具体地，所述消毒处理的过程，包括：将所述蓝晶花花蕾置于4℃下冷藏1周后，用表面活性剂浸泡蓝晶花花蕾，清洗后；再用消毒试剂浸泡蓝晶花花蕾，清洗后，得到已消毒的蓝晶花花蕾。

其中，所述表面活性剂为吐温和/或洗洁精，浸泡时间为15～20min。所述消毒试剂为体积分数75％的乙醇以及质量体积比为0.1％的升汞；外植体先在乙醇中浸泡30s，再在升汞中浸泡8～10min；最后用无菌水漂洗3～5遍，直至无明显泡沫。

清洗时，采用纱布包裹蓝晶花花蕾可避免因流水直接冲击幼嫩花蕾而造成的花蕾损伤。由于蓝晶花花器官个体小，组织材料薄，在湿润的情况下接种，花瓣易粘连在一起，不利于外植体与培养基的接触，且容易造成污染；所以，接种前需将消毒处理后的蓝晶花花蕾表面水分吸干。

作为优选，步骤(1)中，所述愈伤诱导培养基为：MS 4.43g/L，蔗糖30g/L，琼脂8g/L，6-苄氨基腺嘌呤0.5～1.0mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸1～2mg/L，pH 5.8。

作为优选，步骤(1)中，培养的条件为：25±2℃条件下，全黑暗培养45～60d。

作为优选，步骤(2)中，所述增殖培养基为：MS 4.43g/L，蔗糖30g/L，琼脂8g/L，6-苄氨基腺嘌呤1.0～2.0mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.5～1.0mg/L，pH 5.9。

因诱导蓝晶花属植物愈伤组织并维持愈伤组织的持续增殖较为不易，所以在诱导培养过程中，需要每30d继代一次，将诱导形成的愈伤组织团块连同其雄蕊外植体一起转接至新鲜的愈伤诱导培养基上至不定芽形成。因为此时刚刚诱导出的愈伤组织无法直接从培养基中吸收营养，所以需要连带外植体一同继代，通过外植体母体来传递养分；如果过早的将其从母体上剥离下来单独接种，会导致愈伤组织的干瘪或者褐化死亡，无法分化形成不定芽。

步骤(2)中，所述剥离有助于分化形成的小鳞茎的增殖；因为若小鳞茎继续附着于花瓣外植体上，会抑制其进一步增殖。

作为优选，步骤(3)中，所述生根培养基为：MS 4.43g/L，α-萘乙酸0.5～2.0mg/L、蔗糖60～90g/L、琼脂8g/L，pH 5.9。

作为优选，步骤(2)和(3)中，培养的条件为：在光照强度为12.5μmol·m^-2·s^-1、光照时间为14h·d^-1，温度为25±2℃的条件下，培养60～90d。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明以花瓣为外植体，通过消毒处理、诱导愈伤、小鳞茎再生和增殖以及小鳞茎膨大和生根培养，获得蓝晶花小鳞茎再生体系；显著降低了污染率，提高了诱导率和增殖效率，缩短了扩繁周期。

(2)本发明利用花器官作为外植体，污染率低(污染率可降低为0)、愈伤诱导率高(愈伤诱导率达75％以上)、花器官材料易得；同时，不损耗母球，有利于小球型球根花卉蓝晶花属植物的种质资源保护；建立通过花器官(花瓣)扩繁得到大量蓝晶花小鳞茎的人工繁殖体系，可应用于蓝晶花属植物的生产化扩繁。

(3)本发明通过幼嫩花瓣诱导愈伤，经再分化途径可形成大量小鳞茎，增殖效率显著高于通过自然条件下鳞茎分球的方法，增殖效率高(增殖比率达1:9-1:25)、扩繁周期短(从诱导愈伤至获得大量膨大健壮的小鳞茎仅需要10-11个月)，每个花瓣外植体可获得16-30株小鳞茎，直径达0.7～1.3cm。

附图说明

图1为实施例1中接种至愈伤诱导培养基60d后，花瓣外植体诱导形成的愈伤组织团块。

图2为实施例3中接种至增殖培养基90d后获得的蓝晶花小鳞茎增殖个体。

图3为实施例3中接种至膨大及生根培养基90d后，诱导形成的蓝晶花小鳞茎。

具体实施方式

实施例1

(1)外植体取材及处理

于蓝晶花花期6月，采长1.5～2.5cm的幼嫩花蕾(花苞未打开)，置于封口袋中在4℃冰箱中冷藏1周。

将冷藏后的花蕾材料转移至烧杯中，在滴加了少许吐温及洗洁精的水中浸泡15min，随后将纱布覆盖于烧杯口，隔纱布用流水冲洗1h。将冲洗后的外植体置于(v/v)75％的乙醇中浸泡30s，再置于(w/v)0.1％升汞中浸泡处理8min，浸泡过程中不断摇晃使外植体与消毒试剂充分接触。

最后，用无菌水漂洗3遍，每遍不少于3分钟，直至无明显泡沫出现。用镊子取出外植体，置于无菌操作台上，用滤纸吸干表面水分，待接种。

(2)外植体接种及愈伤组织诱导

于超净工作台上，用灭菌镊子和解剖刀将步骤(1)消毒处理后的幼嫩花蕾剥离开，切取花瓣，将其平铺接种于愈伤诱导培养基上，花瓣基部伤口处轻插入培养基中。在培养温度为25±2℃的全黑暗诱导条件下45d开始出现愈伤组织，愈伤组织诱导率为75％(如图1)，污染率为6％。

所述愈伤诱导培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即每升培养基添加4.43g MS粉，所述培养基中还含有30g/L的蔗糖，8g/L琼脂，0.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-benzyladenine,6-BA)，1.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic，2,4-D)，pH值为5.8。

(3)小鳞茎再生

将花瓣外植体连同愈伤组织团块一起于超净工作台上转接到新鲜的愈伤诱导培养基(愈伤诱导培养基配制见步骤(2))，进行60d的小鳞茎诱导培养，愈伤组织团块再生分化率达90％。每30d继代一次，至小鳞茎直径达0.3～0.5cm。

培养环境的光照强度为12.5μmol·m^-2·s^-1，光照时间14h·d^-1，温度为(25±2)℃。

(4)小鳞茎增殖

将分化形成的小鳞茎从愈伤组织团块上剥离下来，转入增殖培养基，每4周继代一次，以维持小鳞茎持续增殖；在光照强度为12.5μmol·m^-2·s^-1、光照时间14h·d^-1，温度为(25±2)℃的条件下进行60d的小鳞茎增殖培养，获得小鳞茎增殖比率为1:9。

所述增殖培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即每升继代培养基中添加4.43gMS粉，增殖培养基中还含有30g/L的蔗糖、8g/L琼脂、1.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-benzyladenine,6-BA)、0.5mg/Lα-萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid,NAA)，pH值为5.9。

(5)小鳞茎膨大及生根培养：

用灭菌的镊子和解剖刀将经由增殖培养得到的小鳞茎丛剥落分离成单独的小鳞茎个体，基盘向下轻插入培养基中，进行小鳞茎的膨大及生根诱导；在光照强度为12.5μmol·m^-2·s^-1、光照时间14h·d^-1，温度为(25±2)℃的培养条件下培养60d，可获得生长健壮、根系发达、鳞茎显著膨大(直径0.7cm左右)的蓝晶花小鳞茎。

所述膨大及生根培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即每升培养基中添加有4.43g MS粉，膨大培养基中还含有浓度为0.5mg/L的α-萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid,NAA)、60g/L的蔗糖、8g/L的琼脂；pH值为5.9。

实施例2

(1)外植体取材及处理

于蓝晶花花期6月，采长1.5～2.5cm的幼嫩花蕾(花苞未打开)，置于封口袋中在4℃冰箱中冷藏1周。

将冷藏后的花蕾材料转移至烧杯中，在滴加了少许吐温及洗洁精的水中浸泡15min，随后将纱布覆盖于烧杯口，隔纱布用流水冲洗1.5h。将冲洗后的外植体置于(v/v)75％的乙醇中浸泡30s，再置于(w/v)0.1％升汞中浸泡处理10min，浸泡过程中不断摇晃使外植体与消毒试剂充分接触。

最后，用无菌水漂洗4遍，每遍不少于3分钟，直至无明显泡沫出现。用镊子取出外植体，置于无菌操作台上，用滤纸吸干表面水分，待接种。

(2)外植体接种及愈伤组织诱导

于超净工作台上，用灭菌镊子和解剖刀将步骤(1)消毒处理后的幼嫩花蕾剥离开，切取花瓣，将其平铺接种于愈伤诱导培养基上，花瓣基部伤口处轻插入培养基中。在培养温度为25±2℃的全黑暗诱导条件下60d开始出现愈伤组织，愈伤组织诱导率为80％，污染率为0。

所述愈伤诱导培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即每升培养基添加4.43g MS粉，所述培养基中还含有30g/L的蔗糖，8g/L琼脂，1.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-benzyladenine,6-BA)，1.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic，2,4-D)，pH值为5.8。

(3)小鳞茎再生

将花瓣外植体连同愈伤组织团块一起于超净工作台上转接到新鲜的愈伤诱导培养基(愈伤诱导培养基配制见步骤(2))，进行75d的小鳞茎诱导培养，愈伤组织团块再生分化率达90％。每30d继代一次，至小鳞茎直径达0.3～0.4cm。

培养环境的光照强度为12.5μmol·m^-2·s^-1，光照时间14h·d^-1，温度为(25±2)℃。

(4)小鳞茎增殖

将分化形成的小鳞茎从愈伤组织团块上分离下来，转入增殖培养基，每4周继代一次，以维持小鳞茎持续增殖；在光照强度为12.5μmol·m^-2·s^-1、光照时间14h·d^-1，温度为(25±2)℃的条件下进行75d的小鳞茎增殖培养，获得小鳞茎增殖比率为1:17。

所述增殖培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即每升继代培养基中添加4.43g MS粉，增殖培养基中还含有30g/L的蔗糖、8g/L琼脂、2.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-benzyladenine,6-BA)、1.0mg/Lα-萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid,NAA)，pH值为5.9。

(5)小鳞茎膨大及生根培养：

用灭菌的镊子和解剖刀将经由增殖培养得到的小鳞茎丛剥落分离成单独的小鳞茎个体，基盘向下轻插入培养基中，进行小鳞茎的膨大及生根诱导；在光照强度为12.5μmol·m^-2·s^-1、光照时间14h·d^-1，温度为(25±2)℃的培养条件下培养75d，可获得生长健壮、根系发达、鳞茎显著膨大(直径1.0cm左右)的蓝晶花小鳞茎。

所述膨大及生根培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即每升培养基中添加有4.43g MS粉，膨大培养基中还含有浓度为1.0mg/L的α-萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid,NAA)、60g/L的蔗糖、8g/L的琼脂；pH值为5.9。

实施例3

(1)外植体取材及处理

于蓝晶花花期6月，采长1.5～2.5cm幼嫩花蕾(花苞未打开)，置于封口袋中在4℃冰箱中冷藏1周。

将冷藏后的花蕾材料转移至烧杯中，在滴加了少许吐温及洗洁精的水中浸泡20min，随后将纱布覆盖于烧杯口，隔纱布用流水冲洗1.5h。将冲洗后的外植体置于(v/v)75％的乙醇中浸泡30s，再置于(w/v)0.1％升汞中浸泡处理10min，浸泡过程中不断摇晃使外植体与消毒试剂充分接触。

最后，用无菌水漂洗5遍，每遍不少于3分钟，直至无明显泡沫出现。用镊子取出外植体，置于无菌操作台上，用滤纸吸干表面水分，待接种。

(2)外植体接种及愈伤组织诱导

于超净工作台上，用灭菌镊子和解剖刀将步骤(1)消毒处理后的幼嫩花蕾剥离开，切取花瓣，将其平铺接种于愈伤诱导培养基上，花瓣基部伤口处轻插入培养基中。在培养温度为25±2℃的全黑暗诱导条件下60d开始出现愈伤组织，愈伤组织诱导率为85％，污染率为0。

所述愈伤诱导培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即每升培养基添加4.43gMS粉，所述培养基中还含有30g/L的蔗糖，8g/L琼脂，0.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-benzyladenine,6-BA)，2.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic，2,4-D)，pH值为5.8。

(3)小鳞茎再生

将花瓣外植体连同愈伤组织团块一起于超净工作台上转接到新鲜的愈伤诱导培养基(愈伤诱导培养基配制见步骤(2))，进行90d的小鳞茎诱导培养，愈伤组织团块再生分化率达95％。每30d继代一次，至小鳞茎直径达0.4～0.5cm。

培养环境的光照强度为12.5μmol·m^-2·s^-1，光照时间14h·d^-1，温度为(25±2)℃。

(4)小鳞茎增殖

将分化形成的小鳞茎从愈伤组织团块上分离下来，转入增殖培养基，每4周继代一次，以维持小鳞茎持续增殖；在光照强度为12.5μmol·m^-2·s^-1、光照时间14h·d^-1，温度为(25±2)℃的条件下进行90d的小鳞茎增殖培养(如图2)，获得小鳞茎增殖比率为1:25。

所述增殖培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即每升继代培养基中添加4.43gMS粉，增殖培养基中还含有30g/L的蔗糖、8g/L琼脂、2.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-benzyladenine,6-BA)、0.5mg/Lα-萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid,NAA)，增殖培养基的pH值为5.9。

(5)小鳞茎膨大及生根培养：

用灭菌的镊子和解剖刀将经由增殖培养得到的小鳞茎丛剥落分离成单独的小鳞茎个体(如图3)，基盘向下轻插入培养基中，进行小鳞茎的膨大及生根诱导；在光照强度为12.5μmol·m^-2·s^-1、光照时间14h·d^-1，温度为(25±2)℃的培养条件下培养90d，可获得生长健壮、根系发达、鳞茎显著膨大(直径1.3cm左右)的蓝晶花小鳞茎，如图3。

所述膨大及生根培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即每升培养基中添加有4.43g MS粉，膨大培养基中还含有浓度为2.0mg/L的α-萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid,NAA)、90g/L的蔗糖、8g/L的琼脂；pH值为5.9。

最后，需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。