一种抗根肿病的甘蓝‑大白菜远缘杂种的创制方法与流程

文档序号:11070991阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种抗根肿病的甘蓝-大白菜远缘杂种的创制方法,其特征在于包含以下步骤:

(1)授粉方法:以抗根肿病大白菜为母本,甘蓝为父本,配置杂交组合,采用人工剥蕾去雄重复授粉的方法,取父本新鲜花粉,涂抹在母本去雄的花蕾柱头上;

(2)胚珠培养:取授粉后10d的子房消毒灭菌,剥取子房中的胚珠接种到胚挽救培养基上,在环境25±0.5℃,光照强度50-100μmol·m–2·s–1,光照时长12-14h·d–1条件下培养25~30d,所述的胚挽救培养基为:MS+0.1mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.6g/L水解酪蛋白+7g/L琼脂+25g/L蔗糖,pH为5.90~5.95;

(3)分化培养:待幼胚长至子叶形胚时,接入分化培养基诱导不定芽分化,所述的分化培养基为:MS+0.1mg/L NAA+1mg/L 6-BA+6g/L琼脂+28g/L蔗糖,pH为5.90~5.95;

(4)继代培养:20~30d后转入继代培养,继代培养基为:MS+0.1mg/LNAA+0.2mg/L6-BA+7g/L琼脂+25g/L蔗糖,pH为5.90~5.95;

(5)生根培养:继代2周后接入生根培养基诱导生根,所述的生根培养基为:1/2MS+0.1mg/L NAA+0.1mg/L IBA+20g/L糖+7g/L琼脂,pH为5.90~5.95;

(6)人工加倍:将修剪好的植株根部浸泡在配制的秋水仙素溶液中进行加倍,所述的处理条件为含2%二甲基亚砜浓度为0.4%的秋水仙素溶液中处理18-20h,处理完毕后,将根部的秋水仙素残液冲洗干净,最后定植于含有草炭土、珍珠岩和蛭石的穴盘中;

(7)形态学鉴定:对幼苗营养生长阶段、生殖生长阶段的主要形态特征进行观察;

(8)细胞DNA相对含量测定:用流式细胞仪对后代加倍植株进行细胞DNA相对含量测定;

(9)根肿病抗性鉴定:通过菌土法接种鉴定和抗根肿病基因CRb的分子标记验证相结合鉴定根肿病抗性,将基质灭菌后,每克灭菌土中接种0.001g病根,然后直接将鉴定材料播于菌土中,于25-28℃下培养,2个月后拔出幼苗,洗净根部杂质,观察发病情况;同时,利用与大白菜抗根肿病CRb基因紧密连锁的SSR引物TCR13对后代植株进行分子标记鉴定,当后代材料的扩增谱带中出现抗根肿病大白菜所具有的特异条带时,即可判定其为携带CRb基因的真杂种。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(1)中所述的杂交组合的配置为:抗根肿病大白菜为母本,甘蓝为父本。其中母本为引进的1份对根肿病表现免疫、携带CRb基因的大白菜材料。

3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(2)中子房消毒灭菌方法为:用75%的乙醇消毒1min,然后用7%(体积分数)的次氯酸钠灭菌15min,再用用无菌水冲洗3次,每次5min。

4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(6)中秋水仙素溶液进行加倍处理时一定要没过根部。

5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(6)中草炭土、珍珠岩和蛭石的体积比为8:1:1。

6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(9)中所述的与大白菜抗根肿病CRb基因紧密连锁的SSR引物TCR13上游引物序列如SEQ ID NO.1所示,下游引物序列如SEQ ID NO.2所示。

7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(9)中当后代材料的扩增谱带中出现抗根肿病大白菜所具有的313bp特异条带时,即可判定其为携带CRb基因的真杂种。

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