本发明涉及植物组织培养技术领域，具体是一种涉及苹果砧木初代培养防褐变的方法。
背景技术：
近年来，随着科学技术的迅猛发展，植物组织培养技术已进入生产应用阶段，广泛应用于花卉、果树苗木的大规模离体快繁。植物组培脱毒快繁在人工控制条件下一年四季生产，并可在短时间内获得大量组培脱毒苗木。但一些优良的苹果砧木组培苗由于在组培初代培养过程中极易发生褐变，使得初代培养成活率极低，从而限制了苹果优良砧木组培苗的大量繁殖和生产，制约了苹果优良砧木规模化、产业化生产和推广。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中苹果优良砧木初代培养易褐变，且引种困难，限制了苹果优良砧木的大量繁殖和生产，制约了苹果优良砧木规模化、产业化生产和推广的问题，提供的一种苹果优良砧木组培初代培养防褐变方法。该方法大幅度降低了苹果优良砧木组培初代培养中出现的褐变问题，提高了初代培养成活率。
为解决本发明的技术问题采用如下技术方案：
一种苹果砧木组培初代培养防褐变的方法，具体步骤如下：
a、初代培养材料的剪取：5-6月份，选连续晴天的第3或第4天的早晨，选取苹果砧木1-2年生、健壮的春梢顶芽和顶芽下面的第一侧芽，切取1.2-1.5 cm长的带芽茎段，剪去叶子，放入盛有无菌水的密闭培养瓶内，备用；
b、材料的清洗和杀菌：将带芽茎段在2‰的84消毒液中浸泡5-10分钟后在流水下冲洗2-5 min，放入洗洁精稀释液中清洗5-10 min，后放入脱脂纱布在流水中冲洗下冲洗1.5-2 h，控干水分后装入干净的烧杯，在超净工作台上用酒精浸泡20-22ms后无菌水冲洗2-3次，然后在汞溶液中处理4-5min，处理时不断搅动使药液均匀浸到处理材料表面，处理完成后移到无菌水中冲洗4-5次，然后在无菌培养皿中切0.4-0.5cm带芽茎段，将做好的培养基分装到培养瓶中，每瓶25-30ml，灭菌，每瓶接2个芽，移入培养室培养；
c、培养室温湿度管理：移入培养室的初代培养瓶苗先进行暗培养，用遮光布遮光，温度21-23℃，湿度70％-75％，暗培养5-7天后去掉遮光布，在1500-1800Lx的光照下培养，温度21-23℃，新芽萌发长到0.5-0.8cm时剪取新芽0.4-0.6cm转接，每瓶接2个芽，转接后光照增加到2200-2500Lx，温度21-23℃，20-25天后等新芽基部长出从生芽时进行常规扩繁转接培养。
所述步骤b中防褐变培养基的配方为：MS+BA0.3mg/L+NAA0.05mg/L+VC80mg/L+白砂糖30g/L+琼脂4.5g/L,pH为5.8。
所述步骤b中灭菌为将做好的培养基放置高压锅中在137-140MPa大气压下灭菌20-25分钟，取出放置2-3天接种。
所述步骤b中每个培养瓶中培养基为每瓶25-30ml。
所述步骤a中用消过毒的手术刀片切取1.2-1.5 cm长的带芽茎段。
所述步骤b中洗洁精稀释液为1L水加入2-3ml洗洁精。
所述步骤b中流水的流速均为0.66-0.7米/秒。
所述步骤b中酒精的质量分数为75％。
所述步骤b中汞溶液质量分数为0.1％。
本发明提供的一种苹果砧木初代培养防褐变方法,大幅度降低苹果优良砧木初代培养中出现的褐变问题，可使苹果砧木初代培养的褐变率减少到5%以下，同时提高了初代培养成活率,使成活率提高到90%，且操作简单，生产成本降低，出苗率提高，短期内可获得大量材料，在生产上体现为直接的经济效益。
具体实施方式
实施例1
一种苹果砧木组培初代培养防褐变的方法，包括初代培养材料的剪取、材料的清洗、杀菌、防褐变培养基的配置、培养室温湿度管理、转接等方法，具体步骤如下：
1、初代培养材料的剪取5-6月份，选连续晴天的第3的早晨，选取苹果砧木1年生、健壮的春梢顶芽和顶芽下面的第一侧芽，用消过毒的手术刀片切取1.5 cm长的带芽茎段，剪去叶子，放入盛有无菌水的密闭培养瓶内，备用；
2、材料的清洗和杀菌：将带芽茎段在2‰的84消毒液中浸泡5分钟后在流速为0.66米/秒的流水中冲洗2 min，放入洗洁精稀释液中清洗5 min，其中洗洁精稀释液为1L水加入2ml洗洁精，然后放入脱脂纱布在流速为0.66米/秒的流水下冲洗3h，控干水分后装入干净的烧杯，在超净工作台上用浓度为75％的酒精浸泡20ms，无菌水冲洗2次，然后在质量分数为0.1％的汞溶液中处理5min，处理时不断搅动使药液均匀浸到处理材料表面，处理完成后移到无菌水中冲洗4次，然后在无菌培养皿中切0.5cm带芽茎段，接入抗褐变培养基，每瓶接2个芽，移入培养室培养。
3、防褐变培养基的配置
a、培养基配方：MS+BA0.3mg/L+NAA0.05mg/L+VC80mg/L+白砂糖30g/L+琼脂4.5g/L,pH为5.8。
b、培养基分装：将做好的培养基分装到培养瓶中，每瓶25ml
c、灭菌：做好的培养基放置高压锅中在137MPa大气压下灭菌20分钟，取出放置2天接种。
4、培养室温湿度管理：移入培养室的初代培养瓶苗先进行暗培养，用黑色棉布遮光，温度23℃，湿度72％，暗培养5天后去掉棉布，再在1500Lx的光照下培养，温湿度不变，等新芽萌发长到0.5cm时剪取新芽0.4cm转接，每瓶接2个芽，二次转接后光照增加到2500Lx，温湿度不变，20天后等新芽基部长出从生芽时进行常规扩繁转接培养。
实施例2
一种苹果砧木组培初代培养防褐变的方法，包括初代培养材料的剪取、材料的清洗、杀菌、防褐变培养基的配置、培养室温湿度管理、转接等方法，具体步骤如下：
1、初代培养材料的剪取：5～6月份，选连续晴天的第4的早晨，选取苹果砧木2年生、健壮的春梢顶芽和顶芽下面的第一侧芽，用消过毒的手术刀片切取1.5 cm长的带芽茎段，剪去叶子，放入盛有无菌水的密闭培养瓶内，带回实验室备用；
2、材料的清洗和杀菌：将带芽茎段在2‰的84消毒液中浸泡5分钟后在流速为0.7米/秒的流水中冲洗5 min，放入洗洁精稀释液中清洗10 min，洗洁精稀释液为1L水加入2ml洗洁精，然后放入脱脂纱布在流速为0.66米/秒的流水下冲洗2h，控干水分后装入干净的烧杯，在超净工作台上用质量分数为75％的酒精浸泡22ms，无菌水冲洗3次，然后在质量分数为0.1％的汞溶液中处理4min，处理时不断搅动使药液均匀浸到处理材料表面，处理完成后移到无菌水中冲洗5次，然后在无菌培养皿中切0.4cm带芽茎段，接入抗褐变培养基，每瓶接2个芽，移入培养室培养。
3、防褐变培养基的配置
a、培养基配方：MS+BA0.3mg/L+NAA0.05mg/L+VC80mg/L+白砂糖30g/L+琼脂4.5g/L，pH为5.8。
b、培养基分装：将做好的培养基分装到培养瓶中，每瓶30ml
c、灭菌：做好的培养基放置高压锅中在137Pa大气压下灭菌20分钟，取出放置3天接种。
4、培养室温湿度管理：移入培养室的初代培养瓶苗先进行暗培养，用黑色棉布遮光，温度23℃，湿度75％，暗培养5天后去掉棉布，再在1500Lx的光照下培养，温湿度不变，等新芽萌发长到0.8cm时剪取新芽0.4cm转接，每瓶接2个芽，二次转接后光照增加到2200Lx，温湿度不变， 22天后等新芽基部长出从生芽时进行常规扩繁转接培养。
实施例3
一种苹果砧木组培初代培养防褐变的方法，包括初代培养材料的剪取、材料的清洗、杀菌、防褐变培养基的配置、培养室温湿度管理、转接等方法，具体步骤如下：
1、初代培养材料的剪取：5～6月份，选连续晴天的第4的早晨，选取苹果砧木2年生、健壮的春梢顶芽和顶芽下面的第一侧芽，用消过毒的手术刀片切取1.2cm长的带芽茎段，剪去叶子，放入盛有无菌水的密闭培养瓶内，带回实验室备用；
2、材料的清洗和杀菌：将将带芽茎段在2‰的84消毒液中浸泡10分钟后在流速为0.66米/秒的流水中冲洗2 min，放入洗洁精浓稀释液中清洗8 min，洗洁精稀释液为1L水加入2ml洗洁精，然后放入脱脂纱布在流速为0.7米/秒的流水下冲洗2h，控干水分后装入干净的烧杯，在超净工作台上用质量分数为75％的酒精浸泡20ms，无菌水冲洗2次，然后在质量分数为0.1％的汞溶液中处理5min，处理时不断搅动使药液均匀浸到处理材料表面，处理完成后再移到无菌水中，冲洗5次，然后在无菌培养皿中切0.5cm带芽茎段，接入抗褐变培养基，每瓶接2个芽，移入培养室培养。
3、防褐变培养基的配置
a、培养基配方：MS+BA0.3mg/L+NAA0.05mg/L+VC80mg/L+白砂糖30g/L+琼脂4.5g/L，pH为5.8。
b、培养基分装：将做好的培养基分装到培养瓶中，每瓶28ml
c、灭菌：做好的培养基放置高压锅中在140MPa大气压下灭菌25分钟，取出放置3天接种。
4、培养室温湿度管理：移入培养室的初代培养瓶苗先进行暗培养，用黑色棉布遮光，温度21℃，湿度70％，暗培养6天后去掉棉布，再在1800Lx的光照下培养，温湿度不变，等新芽萌发长到0.6cm时剪取新芽0.5cm转接，每瓶接2个芽，二次转接后光照增加到2500Lx，温湿度不变，25天后等新芽基部长出大量从生芽时进行常规扩繁转接培养。