本发明涉及植物组织培养技术领域,尤其涉及一种利用组织培养快速繁殖藏药柳茶的方法。
背景技术：
植物组织培养技术：指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株的过程。
植物组培技术目前主要应用于无性系的快速繁殖、培育无病毒种苗、选育新品种、人工种子和种质保存等方面，对于某些濒临灭绝的植物物种的大量繁殖具有重要的意义。
藏药柳茶系蔷薇科鲜卑花属植物，灌木，丛生，高1.0～2.0m。茎、枝圆柱形，微有棱角，棕红色至暗褐色，幼枝(当年生)浅黄绿色，枝幼时被短柔毛，后渐脱落。分布于四川、西藏、青海、甘肃及云南等省区，生于海拔3000～4000m的沙滩和高山灌丛中。藏药柳茶具有清胃热、助消化的功效，常以叶和嫩枝入药，藏族民间常做茶饮，用来治疗食后腹胀等诸多原因引起的消化不良等症状，为藏族常用药物。
传统的藏药柳茶的获取方法是以采集和消耗大量的野生资源为代价，当采集和消耗量超过自然资源的再生能力时，必然会导致其濒危甚至灭绝。此外，由于自然生态环境的日益恶化，也进一步导致柳茶自然资源的匮乏。
针对柳茶自然资源的匮乏，通过植物组培技术生产药用植物柳茶，能够解决人民日益增长的需求与柳茶自然资源不足之间的矛盾，对于保护原产地生态环境，为农区退耕还林提供一种新的经济苗木，具有重要的生态效益和经济效益。
目前，国内尚未有人针对柳茶进行组培研究。但针对其他藏药的组培研究有不少的报道，现有技术是通过ms培养基或其他培养基+不同浓度激素之间的配比，达到预期的目的。徐文华，陈桂琛等以藏药麻花艽的茎尖为外植体，在启动培养基ms+6-ba2.0mg/l+naa0.5mg/l和ms+ba2.0mg/l+naa0.5mg/l+zt2.0mg/l,增殖培养基ms+naa1.0mg/l,生根培养基1/2ms+naa1.0mg/l上,成功地实现了组织培养和快速繁殖。
目前现有组培技术不能解决柳茶培养过程中严重的褐化现象。
技术实现要素：
为解决现有技术和实际情况中存在的上述问题，本发明提供了一种利用组织培养快速繁殖藏药柳茶的方法，包括以下步骤，
1）外植体的选择与处理
2）柳茶愈伤组织的诱导
3）柳茶丛生芽的诱导与培养
4)柳茶的生根培养
5)柳茶组培苗的移栽驯化。
优选地，利用组织培养快速繁殖藏药柳茶的方法，采用以下组分的组织培养ms培养基：
硝酸钾1700-2100mg/l、硝酸铵1450-1850mg/l、硫酸镁150-190mg/l、二水氯化钙350-390mg/l、碘化钾420-460mg/l、硼酸0.81-0.85mg/l、硫酸锰6.0-6.4mg/l、硫酸锌20-24mg/l、钼酸钠8.4-8.8mg/l、硫酸铜0.23-0.27mg/l、氯化钴0.023-0.027mg/l、乙二胺四乙酸二钠35-39mg/l、硫酸亚铁25-30mg/l、肌醇95-105mg/l、甘氨酸1.8-2.2mg/l、盐酸硫胺素0.08-0.12mg/l、盐酸吡哆醇0.48-0.52mg/l、烟酸0.48-0.52mg/l、蔗糖28000-32000mg/l、琼脂6800-7200mg/l。
优选地，利用组织培养快速繁殖藏药柳茶的方法，采用以下组分的组织培养ms培养基：
硝酸钾1900mg/l、硝酸铵1650mg/l、硫酸镁170mg/l、二水氯化钙370mg/l、碘化钾440mg/l、硼酸0.83mg/l、硫酸锰6.2mg/l、硫酸锌22.3mg/l、钼酸钠8.6mg/l、硫酸铜0.25mg/l、氯化钴0.025mg/l、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/l、硫酸亚铁27.8mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸2mg/l、盐酸硫胺素0.1mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、烟酸0.5mg/l、蔗糖30000mg/l、琼脂7000mg/l。
优选地，步骤1）所述外植体的选择与处理方法为：
选取5-7月份健康、强壮的野生柳茶植株，剪取其嫩叶作为外植体，用饱和的中性肥皂水浸泡20-30min；流水冲洗2-3小时后，移至超净工作台上用75%酒精消毒5-10s，无菌水冲洗4次；再用0.1%升汞消毒，然后用无菌水冲洗4-6次，每次冲洗时间2-3分钟，再用无菌滤纸吸干水分后，置无菌瓶中，备用。
优选地，步骤2）所述柳茶愈伤组织的诱导方法如下：
将制备好的柳茶叶片外植体切成大小为0.5cm左右的小块，转入已灭菌的ms+1.0mg/l2,4-d+0.5mg/l6-ba+0.5mg/lnaa,ph值为5.8的培养基上，置于温度20-25℃，光照时间12小时，光照强度为1500-2500lx的人工气候培养箱中进行培养，直至诱导形成愈伤组织。
优选地，步骤3）柳茶丛生芽的诱导与培养方法如下：
将步骤2）培养获得的呈绿色的子叶愈伤组织接种在配比为ms+1.0mg/l6ba+0.5mg/lnaa的丛生芽诱导培养基上进行培养，培养条件为：20～25℃条件下全暗培养7～14天，然后置于培养温度为20～25℃，每天光照10～12小时，光照强度为2000～3000lx的条件下培养直至形成丛生芽。
优选地，步骤4）所述柳茶的生根培养方法如下：
将步骤3)培养获得的丛生芽分切成单芽后接种到配比为1/2ms+0.5mg/lnaa的生根培养基上进行生根培养培养至生根；培养条件为：温度20～25℃，每天光照10～12小时，光照强度为3000～4000lx。
优选地，步骤5）所述柳茶组培苗的移栽驯化方法如下：
将步骤4）获得的生根柳茶组培苗先去掉瓶盖置于自然光照下炼苗5天后，先将组培苗从培养瓶中取出，用蒸馏水洗掉根部的培养基，栽入优选腐殖土+蛙石的基质上进行驯化，并使基质相对湿度85%左右，每种基质移栽10株组培苗，每组3次重复。
优选地，所述优选腐殖土+蛙石的质量比为7:3。
本发明有以下有益效果：
1、经济效益：通过组培技术对柳茶进行培育，获得大量的组培试管苗，为人工栽培提供种苗来源，具有很好的经济推广价值。
2、生态效益：人工柳茶的大量繁殖能够满足人们的需求，解决野生柳茶因人们过度采集而导致的匮乏，对于保护原产地的生态环境具有重大意义。
3、社会效益：柳茶作为一种药用资源，具有清胃热、助消化等功效，它的开发利用对于人类社会，特别是医药领域是个宝贵的财富。
具体实施方式
实施例1
一种利用组织培养快速繁殖藏药柳茶的方法，包括以下步骤，
1）外植体的选择与处理
2）柳茶愈伤组织的诱导
3）柳茶丛生芽的诱导与培养
4)柳茶的生根培养
5)柳茶组培苗的移栽驯化。
所述利用组织培养快速繁殖藏药柳茶的方法，采用以下组分的组织培养ms培养基：
硝酸钾1700mg/l、硝酸铵1450mg/l、硫酸镁150mg/l、二水氯化钙350mg/l、碘化钾420mg/l、硼酸0.81mg/l、硫酸锰6.0mg/l、硫酸锌20mg/l、钼酸钠8.4mg/l、硫酸铜0.23mg/l、氯化钴0.023mg/l、乙二胺四乙酸二钠35mg/l、硫酸亚铁25mg/l、肌醇95mg/l、甘氨酸1.8mg/l、盐酸硫胺素0.08mg/l、盐酸吡哆醇0.48mg/l、烟酸0.48mg/l、蔗糖28000mg/l、琼脂6800mg/l。
步骤1）所述外植体的选择与处理方法为：
选取5-7月份健康、强壮的野生柳茶植株，剪取其嫩叶作为外植体，用饱和的中性肥皂水浸泡20-30min；流水冲洗2-3小时后，移至超净工作台上用75%酒精消毒5-10s，无菌水冲洗4次；再用0.1%升汞消毒，然后用无菌水冲洗4-6次，每次冲洗时间2-3分钟，再用无菌滤纸吸干水分后，置无菌瓶中，备用。
步骤2）所述柳茶愈伤组织的诱导方法如下：
将制备好的柳茶叶片外植体切成大小为0.5cm左右的小块，转入已灭菌的ms+1.0mg/l2,4-d+0.5mg/l6-ba+0.5mg/lnaa,ph值为5.8的培养基上，置于温度20-25℃，光照时间12小时，光照强度为1500-2500lx的人工气候培养箱中进行培养，直至诱导形成愈伤组织。
步骤3）柳茶丛生芽的诱导与培养方法如下：
将步骤2）培养获得的呈绿色的子叶愈伤组织接种在配比为ms+1.0mg/l6ba+0.5mg/lnaa的丛生芽诱导培养基上进行培养，培养条件为：20～25℃条件下全暗培养7～14天，然后置于培养温度为20～25℃，每天光照10～12小时，光照强度为2000～3000lx的条件下培养直至形成丛生芽。
步骤4）所述柳茶的生根培养方法如下：
将步骤3)培养获得的丛生芽分切成单芽后接种到配比为1/2ms+0.5mg/lnaa的生根培养基上进行生根培养培养至生根；培养条件为：温度20～25℃，每天光照10～12小时，光照强度为3000～4000lx。
步骤5）所述柳茶组培苗的移栽驯化方法如下：
将上述获得的生根柳茶组培苗先去掉瓶盖置于自然光照下炼苗5天后，先将组培苗从培养瓶中取出，用蒸馏水洗掉根部的培养基，栽入优选腐殖土+蛙石(两者比例为7:3)、湿度为80%左右的基质上进行为期3-4周的移栽驯化并记录。
所述培养基的制备方法为：按照上述ms基础培养基配方表配成100倍的母液，分别为大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机母液，各配成1l。各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。
培养基的分装：趁热将溶化的培养基分别倒到培养瓶中，注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。每1l培养基，可分装25～30瓶。装好之后用夹有封口膜的三层牛皮纸封盖瓶口。
培养基的灭菌：将分装封口好的培养瓶放入手提式压力蒸汽灭菌器中，关好压力盖，当锅内压力开始上升时马上打开阀门，放掉里面的冷空气，连续放2-3次，再次盖好盖子，当灭菌灯亮时开始计时，25分钟。灭好的培养基应立即拿出来，室温冷却至凝固。
本发明藏药柳茶采自甘肃省甘南州。
实施例2
一种利用组织培养快速繁殖藏药柳茶的方法，采用以下组分的组织培养ms培养基：硝酸钾1900mg/l、硝酸铵1650mg/l、硫酸镁170mg/l、二水氯化钙370mg/l、碘化钾440mg/l、硼酸0.83mg/l、硫酸锰6.2mg/l、硫酸锌22.3mg/l、钼酸钠8.6mg/l、硫酸铜0.25mg/l、氯化钴0.025mg/l、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/l、硫酸亚铁27.8mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸2mg/l、盐酸硫胺素0.1mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、烟酸0.5mg/l、蔗糖30000mg/l、琼脂7000mg/l。
实施例2所述方法其余与实施例1相同。
实施例3
一种利用组织培养快速繁殖藏药柳茶的方法，采用以下组分的组织培养ms培养基：硝酸钾2100mg/l、硝酸铵1850mg/l、硫酸镁190mg/l、二水氯化钙390mg/l、碘化钾460mg/l、硼酸0.85mg/l、硫酸锰6.4mg/l、硫酸锌24mg/l、钼酸钠8.8mg/l、硫酸铜0.27mg/l、氯化钴0.027mg/l、乙二胺四乙酸二钠39mg/l、硫酸亚铁30mg/l、肌醇105mg/l、甘氨酸2.2mg/l、盐酸硫胺素0.12mg/l、盐酸吡哆醇0.52mg/l、烟酸0.52mg/l、蔗糖32000mg/l、琼脂7200mg/l。
实施例3所述方法其余与实施例1相同。
本发明通过探究影响藏药柳茶快繁技术、愈伤组织再生技术的因素，阐明柳茶组培苗的繁殖过程，优化柳茶组织培养条件，建立柳茶的快速繁殖体系和愈伤组织再生技术体系，实施野生药用植物柳茶资源的半野生人工抚育和引种驯化及规模化人工种植栽培，实现药用植物遗传资源保护，减少野生资源采挖量，保护原产地生态环境。
实验例
采用实施例2的ms培养基利用组织培养快速繁殖藏药柳茶的方法数据如下：
表一利用组织培养快速繁殖藏药柳茶的方法培养数据
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。