一种诱导不定芽进行姜科植物种苗快速繁殖的方法与流程

本发明属于植物组织培养快速繁殖技术领域，具体地说，涉及一种诱导不定芽进行姜科植物种苗快速繁殖的方法。

背景技术：

姜科植物广布世界热带、亚热带地区，我国有姜科植物22属209种，主要分布再南部和西南部各省，其中广东、广西、云南最丰富。姜科植物是植物资源的宝库，我国对姜科植物的认识和利用已有悠久的历史。姜科植物作用很多，在生活中不可或缺。例如姜被称之为食品王国的“四辣”之一，含有多种成份，营养丰富，既是一种重要的调味蔬菜，又用作调味香料，姜味辛，性微温，有发汗解表、温中散寒等作用，具有很高的药用价值，同时也可做酱菜、姜汤、糕点、饮料等，姜在我国栽培地域很广，姜及其制品在国内外市场越来越受欢迎，已经成为我国重要的出口商品，每年为我国带来巨大的经济效益；姜黄具有行气活血、通经止痛的药用价值，所含的姜黄素具有抗肿瘤、降血脂、抗辐射等多种作用，也是做咖喱粉的主要原料，并可以做黄色染料，具有十分重要的经济价值；砂仁可用于温脾健胃、行气调中、治疗痢疾等，并可制成蜜饯、砂仁糖等；襄荷和阳荷从古代就被作为蔬菜食用。除了上述的食用、药用等作用外，姜科部分植物具有极佳的观赏特性，多为湿生或水生植物，具有特有的耐阴性和芳香性，在特色专类植物园中具有很大的开发前景，如白姜花、花叶艳山姜已被广泛应用于华南地区园林绿化。此外，部分姜科植物如白姜花、墨尔本姜花、峨眉姜花等对污水环境具有极强的适应性，并能对污水起到净化效果，适合运用于污染水体的修复工程。

姜科部分植物在自然生长状态下会出现结实少或不结实的情况，在生产中主要依靠块茎进行无性繁殖，这种方法不仅繁殖系数低、费用高，易遭受自然灾害和病虫害，难以满足生产上的需求，更为严重的是长期无性繁殖极易造成种性退化和病害发生，造成品质和产量急剧下降，对姜科植物的生产造成严重威胁。如烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒、青枯腐烂病(又称姜瘟)、根腐病、姜炭疽病、姜腐霉菌腐烂病是对姜危害最为严重的病害；砂仁叶枯病、砂仁炭疽病、叶斑病、果腐病等对砂仁危害严重。这些病害给姜科植物的生产造成重大经济损失，已成为限制该科植物发展的主要因素之一。因此，利用植物组织培养技术进行快速繁殖是短期内大规模获得健康种苗的关键措施和重要保证。

目前姜科植物的组织培养外植体常采用芽、茎尖、叶片、种子等，多以芽为主。如生产上通常采用催芽的方式诱导姜块萌芽，切取茎尖后通过表面消毒建立无菌体系，这种方式的缺点在于：①耗时，催芽常需等待1-2周时间，从催芽到外植体建立常需要6-8个月；②费用高，冬季进行催芽时往往需要提供20℃以上的环境，生产上需通过烧锅炉、烧电等方式提高室温；③污染率高，姜块凹凸不平，表面消毒不易彻底，造成污染率很高。除姜块催芽进行茎尖剥取之外，也有研究通过组培苗剥取茎尖，但姜的茎尖呈半透明、水渍状，剥取难度大、成活率低。因此，采用茎尖进行大规模繁殖和脱毒难度很大。通过叶片进行诱导愈伤组织再诱导不定芽是目前姜科植物常用的方法，如姜的基生叶放置在含有0.9-10mg.l^-12，4-d的培养基上可产生致密的愈伤组织，再转入0.9mg.l^-12，4-d的培养基上可诱导形成不定芽。但这种方法存在的问题是：①随着继代次数增多，愈伤组织的再生能力显著退化；②经愈伤组织阶段，变异率高。种子进行无菌播种是快速繁殖中常用的技术手段，但这种方法不适合姜科自然状态不结实的植物，如姜。因此可见，目前姜科植物的生产中极缺一种安全、简便、快速的繁殖方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明针对姜科植物常用快繁技术中耗时长、易污染、愈伤组织阶段易引起变异等弊端，以简单、有效的薄层和薄片组织诱导不定芽为技术核心，提供了一种快速繁殖姜科植物种苗的方法。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种诱导不定芽进行姜科植物种苗快速繁殖的方法，包括：

1)选取健壮的姜科组培苗，在超净工作台条件下去除外围根；

2)材料准备：去除主茎，保留根及膨大茎，叶片保留基部叶鞘部位；

3)将膨大茎和叶鞘部位横切，接种于诱导培养基上，光照培养；

4)将不定芽转接于增殖培养基上，光照培养。

所述的步骤(1)具体为：选取5-6周苗龄的健壮生姜组培苗，保留1.0-2.0cm的主根，去除其余外围根。

所述的步骤2具体为：保留主根及以上1.0-1.5cm的膨大茎，去除其余茎和叶，叶片切下后保留基部叶鞘部位1.0-1.5cm。

所述的步骤3具体为：将膨大茎进行横切，每个薄层的厚度为2.0-3.0mm、叶鞘每段切成5.0-7.0mm，接种于ms+tdz1.0-4.0mg/l+naa0-2.0mg/l的诱导培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养10-15天。

所述的步骤4具体为：将诱导出的不定芽转接于6-ba2.0-3.0mg/l+naa0.2-0.5mg/l的增殖培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养4-5周。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明方法建立一种新型的姜科植物种苗的快速繁殖方法，直接成苗，不通过愈伤组织阶段，没有变异的风险。

2)周期短，通过薄层和薄片组织直接诱导出不定芽，再进行增殖和生根阶段，总周期为43-50天。

3)增殖效率高，以1棵生姜种苗为例，有1个茎和4片叶鞘，茎可切5-6个薄层，每个薄层可诱导1-2个不定芽，叶鞘为切成8段薄片，每个薄片诱导1-2个不定芽，即共有不定芽13-26棵，增殖系数为4-6，因此，以1棵姜苗来计算，第一代繁殖的种苗数量为：52-156棵，第二代及以后代数增殖的种苗数量成几何级增加。

附图说明

图1以薄层和薄片组织诱导不定芽技术为核心的姜科植物种苗快速繁殖过程(以生姜为例)；其中，a为准备实验的一棵生姜种苗；b为准备薄层和薄片组织的示意图，其中b1为薄片组织，b2为薄层组织；c为薄层组织在不适合的诱导培养基进行生长的情况，出现褐化，没有不定芽的生长；d为薄层组织在较适合的诱导培养基进行生长的情况，不定芽开始生长，但比较孱弱；e为薄层组织在最适合的诱导培养基进行生长的情况，不定芽开始生长，非常健壮；f为薄片在适合的诱导培养基上生长，不定芽开始生长；g为薄层和薄片组织诱导的不定芽；h为不定芽在不适合的增殖培养基上生长的状态，植株黄化，增殖系数极低；i为不定芽在适合的增殖培养基上生长的状态，植株绿色健壮，增殖系数为4-6。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本发明公开了通过薄层和薄片组织诱导不定芽进行姜科植物种苗快速繁殖的方法，包括以下步骤：

步骤1、选取5周苗龄健壮的姜科组培苗，在超净工作台条件下保留1.0-2.0cm的主根，去除其余外围根；

步骤2、保留主根及以上1.0-1.5cm的膨大茎，去除其余茎和叶，叶片切下后保留基部叶鞘部位1.0-1.5cm；

步骤3、将膨大茎进行横切，每个薄层的厚度为2.0-3.0mm、叶鞘每段切成5.0-7.0mm，接种于ms+tdz1.0-4.0mg/l+naa0-2.0mg/l的诱导培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养10-15天。

步骤4、将诱导出的不定芽转接于6-ba2.0-3.0mg/l+naa0.2-0.5mg/l的增殖培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养4-5周。

本方法关键点在于薄层和薄片材料的准备、激素种类和浓度配比。薄层材料的准备：保留主根及以上1.0-1.5cm的膨大茎，将膨大茎进行横切，每个薄层的厚度为2.0-3.0mm。薄片材料的准备：叶片切下后保留基部叶鞘部位1.0-1.5cm，叶鞘每段切成5.0-7.0mm。不定芽的诱导激素为tdz和naa，浓度范围是tdz1.0-4.0mg/l，naa0-2.0mg/l；不定芽的增殖激素为6ba和naa，浓度范围是6ba2.0-3.0mg/l，naa0.2-0.5mg/l。在实验中，数据显示激素的种类和浓度对不定芽的诱导和增殖具有显著的影响(图1)。

表1不同激素种类及浓度配比对薄层和薄片组织诱导不定芽的影响

表2不同激素配比对不定芽增殖的影响

实施例1

选取5周苗龄的健壮生姜品种‘四川犍为黄口姜’组培苗，在超净工作台条件下保留1.0-2.0cm的主根，去除其余外围根；保留主根及以上1-1.5cm的膨大茎，去除其余茎和叶，叶片切下后保留基部叶鞘部位1.0-2.0cm；将膨大茎进行横切，每个薄层的厚度为2.0-3.0mm、叶鞘每段切成5.0-7.0mm，接种于ms+tdz2.0mg/l+naa1.0mg/l的诱导培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养15天；将所得到的不定芽转接于6-ba2.0mg/l+naa0.5mg/l的ms培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养4周，不定芽的增殖率为6。

实施例2

选取5周苗龄的健壮生姜品种‘乐山西坝姜’组培苗，在超净工作台条件下保留1.0-2.0cm的主根，去除其余外围根；保留主根及以上1-1.5cm的膨大茎，去除其余茎和叶，叶片切下后保留基部叶鞘部位1.0--2.0cm；将膨大茎进行横切，每个薄层的厚度为2.0-3.0mm、叶鞘每段切成5.0-7.0mm，接种于ms+tdz2.0mg/l+naa1.0mg/l的诱导培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养15天；将所得到的不定芽转接于6-ba2.0-3.0mg/l+naa0.2-0.5mg/l的ms培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养4周，不定芽的增殖率为4-6。

实施例3

选取5周苗龄的健壮生姜品种‘四川竹根姜’组培苗，在超净工作台条件下保留1.0-2.0cm的主根，去除其余外围根；保留主根及以上1-1.5cm的膨大茎，去除其余茎和叶，叶片切下后保留基部叶鞘部位1.0--2.0cm；将膨大茎进行横切，每个薄层的厚度为2.0-3.0mm、叶鞘每段切成5.0-7.0mm，接种于ms+tdz3.0mg/l+naa0.5mg/l的诱导培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养15天；将所得到的不定芽转接于6-ba2.0mg/l+naa0.5mg/l的ms培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养4周，不定芽的增殖率为4。

实施例4

选取5周苗龄的健壮生姜品种‘厚坝姜’组培苗，在超净工作台条件下保留1.0-2.0cm的主根，去除其余外围根；保留主根及以上1-1.5cm的膨大茎，去除其余茎和叶，叶片切下后保留基部叶鞘部位1.0--2.0cm；将膨大茎进行横切，每个薄层的厚度为2.0-3.0mm、叶鞘每段切成5.0-7.0mm，接种于ms+tdz1.0mg/l+naa0.5mg/l的诱导培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养15天；将所得到的不定芽转接于6-ba2.0mg/l+naa0.2mg/l的ms培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养4周，不定芽的增殖率为5。

实施例5

选取6周苗龄的蘘荷(别称洋火姜)健壮组培苗，在超净工作台条件下保留1.0-2.0cm的主根，去除其余外围根；保留主根及以上1.0-1.5cm的膨大茎，去除其余茎和叶，叶片切下后保留基部叶鞘部位1.0-1.5cm；将膨大茎进行横切，每个薄层的厚度为2.0-3.0mm、叶鞘每段切成5.0-7.0mm，接种于ms+tdz3.0mg/l的诱导培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养10天；将所得到的不定芽转接于6-ba3.0mg/l+naa0.5mg/l的ms培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养4周，不定芽的增殖率为5。

实施例6

选取6周苗龄的姜黄健壮组培苗，在超净工作台条件下保留1.0-2.0cm的主根，去除其余外围根；保留主根及以上1.0-1.5cm的膨大茎，去除其余茎和叶，叶片切下后保留基部叶鞘部位1.0-1.5cm；将膨大茎进行横切，每个薄层的厚度为2.0-3.0mm、叶鞘每段切成5.0-7.0mm，接种于ms+tdz2.0mg/l的诱导培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养10天；将所得到的不定芽转接于6-ba2.0mg/l+naa0.2mg/l的ms培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养4周，不定芽的增殖率为4。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。