中山豆根根 瘤的表面灭菌处理，具体为:挑选新鲜、饱满、个大的山豆根根瘤，在无菌的条件下，体积浓 度为95 %的乙醇侵泡Imin，无菌水冲洗3次，质量分数为0.1 %的氯化隶侵泡3min，无菌水冲 洗4次。
[0043]所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，所述根瘤菌菌液的用量 为一棵山豆根植株3mL。
[0044] <实施例3〉
[004引一种应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，包括W下步骤：
[0046]将根瘤菌菌液分布于山豆根植株的根系周围，之后将山豆根植株于日间30°C、夜 间25°C、光强35001x条件下培养190天，其中，在培养过程中添加化虹aeus无氮营养液。
[0047]所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，所述根瘤菌菌液的制作 过程如下：
[0048] 步骤一、破碎经表面灭菌处理的山豆根根瘤，取其汁液，用所述汁液在加有0.03g/ L刚果红的YMA固体培养基上划线，30°C恒溫培养至菌落出现，连续培养，获得根瘤菌菌株；
[0049]步骤二、将根瘤菌菌株接种到YMA液体培养基中，得根瘤菌菌液。
[0050]所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，所述山豆根植株经W下 步骤培育得到：
[0051 ] 选取体积比为1:1的水洗河沙和赔石为培育基质，125°C高压灭菌1.化；
[0052] 将山豆根种子于65°C水中浸泡至吸胀，自然冷却，用体积浓度为75 %的乙醇和质 量分数为0.1%的氯化隶进行表面消毒，在所述培育基质中30°c培养至发芽后，移栽，得待 接种的山豆根植株，其中，花盆经过W下处理：用质量分数为5%的高儘酸钟溶液浸泡化后 洗净。
[0053]所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，所述步骤一中山豆根根 瘤的表面灭菌处理，具体为:挑选新鲜、饱满、个大的山豆根根瘤，在无菌的条件下，体积浓 度为95 %的乙醇侵泡1.5min，无菌水冲洗4次，质量分数为0.1 %的氯化隶侵泡4min，无菌水 冲洗5次。
[0054]所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，所述根瘤菌菌液的用量 为一棵山豆根植株4mL。
[0055] 1.1根瘤菌的采集及分离纯化
[0056]分别在广西药用植物园、隆安县、靖西县栽培的山豆根根系上采集新鲜、饱满、个 大的根瘤，放入装有无水氯化巧的具塞试管内带回实验室进行分离纯化。自来水冲洗干净 采集的根瘤，在无菌的条件下，体积浓度为95%的乙醇侵泡Imin，无菌水冲洗3次，质量分数 为0.1 %的氯化隶侵泡3min，无菌水冲洗4次，然后置于灭菌的研鉢中，用无菌玻棒挤压、破 碎根瘤，取汁液在加有0. 〇25g/L刚果红的YMA固体培养基上划线，28°C恒溫培养至菌落出 现，挑选典型单菌落连续培养，获得根瘤菌菌株YY、LA1、LA2、JX2、JX3。
[0057] 表1山豆根根瘤采集地点及所得菌株
[005引
[0059] 1.2生长特性测定革兰氏染色参照《常见细菌系统鉴定手册》按常规方法进行。生 长曲线测定:将根瘤菌接种到用YMA液体培养基中，接种后每隔4h用紫外可见分光光度计在 600mn波长处测定各参试菌株培养液的光密度，W培养时间为横坐标，光密度值为纵坐标绘 制生长曲线。BTB反应:将菌种接种于含0.1 %漠廳香草酪蓝的YMA培养基上，在28°C培养6~ lOd，观察颜色变化。
[0060]1.3生理生化特性测定WYMA液体培养基为基本培养基。溫度试验设置共设8个单 一溫度和一个耐高溫处理，单一溫度分别为4，10，15，20，25，30，35，40°C，耐高溫处理先放 在60°C处理10分钟，再置28°C摇床中培养;酸碱度影响试验设置pH值为4，5,6,7,8,9，10， 11，12共9个梯度;耐盐性试验设置NaCl终浓度为0.!%，0.5% ,1.0% ,2.0% ,3.0%共5个梯 度;抗生素抗性试验，添加不同种类不同浓度的抗生素至YMA液体培养基中；碳源和氮源利 用实验，W去掉碳源的White培养基为基础培养基，分别加入各种碳源或氮源，使终浓度为 1 % (W/Y)，调节pH至7.0。灭菌后接入供试菌株，WYMA液体培养基为阳性对照，不加任何碳 源为阴性对照，28°C摇床中、200r·mirfi培养5d后，显微镜下检测根瘤菌的生长状况。
[0061]W上试验均设置3次重复。
[0062] 1.4回接试验培养基质为1:1体积混合的水洗河沙和赔石，121°C高压灭菌化。山 豆根种子来源于广西药用植物园科研基地。山豆根种子60°C左右热水中侵泡，并让其自然 冷却，吸胀后分别用体积浓度为75 %的乙醇和质量分数为0.1 %的氯化隶进行表面消毒，在 无菌的水洗河沙中28°C培养至发芽后选取长势一致的植株移栽至花盆中。花盆用5%浓度 的高儘酸钟侵泡5~化后清洗干净。
[0063] 供试菌株分别接种到山豆根幼苗根系上作为接种处理，W不接种根瘤菌为对照处 理(CK)，共6个处理，每个处理种植3盆，每盆15株。接种方法:移栽山豆根幼苗后，用移液枪 吸取相应的根瘤菌菌液2mL注于幼苗根系周围，CK处理用等量的无菌水代替。将植株置于日 间28°C、夜间22°C、光强30001X的无菌光照培养室内培养。用化hraeus无氮营养液补充营养 元素和水分。培养180d后取出植株清洗，统计山豆根幼苗根瘤数量。
[0064] 1.5苦参碱与氧化苦参碱的含量测定
[0065]测定方法参照2010年《中国药典》。采用苦参碱和氧化苦参碱对照品作为实验对 照。按照药典山豆根测定的方法制备供试液。称取山豆根药材〇.5g，精密加入20ml混合溶液 (Ξ氯甲烧-甲醇-浓氨水40:10:1)密塞，称重，放置30111111，超声处理(功率250胖，频率40曲2) 3〇min，再次称重用混合溶液补重，摇匀，过滤，精密量取取续滤液10ml，40°C减压回收(使用 旋转蒸发仪)至溶剂全部挥尽，残渣加入适量甲醇(色谱纯)溶解，转移至容量瓶中甲醇定容 至10ml，摇匀，用0.22um微孔滤膜过滤。另取苦参碱对照品和氧化苦参碱对照品适量，加入 液相流动相（乙腊-异丙醇-3 %憐酸溶液80:5:15)，使得苦参碱含量为20ug/ml，氧化苦参碱 含量为150ug/ml。仪器：高效液相色谱仪VarianJC2X058;色谱柱：PhenomenexLuna5u NH2lOOA，150*4.6mm;柱溫：25°C;流动相：乙腊-异丙醇-3 %憐酸溶液80 : 5:15;检测波长 21Onm;液相时间16min。
[0066]采用SPSS16.0进行数据统计与分析。
[0067] 2结果与分析
[006引 2.1山豆根根瘤菌的生长特性
[0069]山豆根根瘤菌在YMA固体培养基上经28°C培养3~5d能形成良好的典型菌落。其菌 落圆形，透明粘稠，表面光滑，有光泽，边缘整齐，中屯、稍有突起。按菌落大小可分为巧中类 型，其中YY、LA2、JX3菌落直径为0.6~0.8cm，LA1和JX2菌落直接0.2~0.4cnuBTB反应试验 表明，参试的山豆根菌株代谢产酸;革兰氏染色均反应为阴性。生长曲线如图1所示，测定结 果表明：各菌株在培养0~地为迟缓期，4~2地为对数生长期，2地后进入稳定生长期。由此 可见，我们分离到的根瘤菌具有快生型根瘤菌的一般特征W，初步判定其为快生型根瘤菌。
[0070] 2.2山豆根根瘤菌的生理生化特性
[0071] 2.2.1溫度对山豆根根瘤菌生长的影响山豆根根瘤菌对不同溫度的反应较为一 致，对低溫的忍耐能力较差，在30°C左右生长良好。各菌株对异常溫度的耐受性有一定的 差异，来自同一产地的不同根瘤菌株对高溫的耐受性也存在着差异，其中YY、LA巧日JX2能耐 受短时60°C的高溫(见表2)。
[0072] 表2不同溫度对山豆根根瘤菌生长的影响
[0073]
[0074] 注：V'表示生长，表示不生长。下同。
[007