8 (3.5μηι，2.1 X 150mm，Waters)的色谱柱。具体操作步骤如下：经上述处理的iTRAQ标记好的 混合样品冻干后用buffer A(20mmol/L ammonium formate，pH 9.5)重新溶解，在高效液相 色谱系统进行反相色谱分离；以buffer A和buffer B(80%ACN/20%20mM NH4FA)为洗脱液 在200yL/min流速下梯度洗脱（10%至45%buffer B，30min)(Yang et al.，2011)，每隔 lmin收集一个洗脱组分，将所收到48个组分根据其在214nm下的吸收值合并为12份(Wang et al.，2011)。合并的样品经冻干后重新溶解在20yL buffer C(2%ACN/0.5%NH4FA)中， 最后上机进行nanoLC-MS/MS质谱分析。
[0058] 2 · 6 · 3nanoLC-MS/MS 分析
[0059] nanoLC-MS/MS质谱分析采用了电场轨道阱回旋共振组合质谱仪LTQ-〇rbitrap Velos(Thermo-Fisher Scientif ic，San Jose，CA)，该质谱配备了一个"corconnex"纳米离 子源质谱仪(CorSolutions LLC，Ithaca，NY)，含有一个PepMap C18反相纳米柱(3μηι，75μηι X 15cm，Dionex)连接到一个10μΜ分析物发射器(NewObjective，Woburn，MA)。该轨道讲中接 口与多维液相层析系统UltiMate 3000MDLC(Dionex，Sunnyvale，CA)串联。每个混合组分(5 yL)注入到PepMap C18捕获柱中以20yL/min的流速进行加载，然后利用一个梯度以300nL/ min的流速从5至38%ACN的0.1 %FA在PepMap C18反相纳米柱分离120min，接着进行5min坡 道95%ACN-0 · 1 %FA和5min保持在95%ACN-0 · 1 %FA。用2%ACN-0 · 1 %FA将柱子重新平衡 20min后再进行下一次运行。LTQ Orbitrap Velos在正离子模式下将电喷雾电压设定在1.5 千伏，并在275°C的源温度下进行洗脱肽段的检测。该仪器利用Ultramark 1621的FT质量分 析器外部校准。采用聚硅氧烷离子信号在M/Z 445.120025的背景作为校准物进行内部校 准。该仪器是在数据依赖采集(DDA)模式下进行操作。在所有的实验中，全MS扫描以获得M/Z 400-1，400的质量范围，Orbitrap质量分析器的检测分辨率设置为30，000。通过高能碰撞解 离(HCD)产生的片段离子光谱在Orbitrap质量分析器设置的分辨率为7,500,质量检测范围 为M/Z 100-2000。在每个DDA分析周期中，在接下来每个扫描过程中，10个最激烈的多电荷 离子高于5000阈值被选择为在45%碰撞能量归一化的碎片。动态排除参数设定在重复数为 1且持续重复20s，排除列表的大小为500，30s持续时间排除与±10ppm的排斥大众的宽度。 活化时间为〇. lms的HCD分析。使用Xcalibur 2.1软件(Thermo-Fisher Scientific)分析获 取所有的质谱数据。
[0060] 2.6.4质谱数据分析
[0061 ]利用Proteome Discoverer 1 · 2(PD 1 · 2，Thermo)软件将Orbitrap Velos米集的 原始数据文件转换为MGF文件。随后米用Mascot Daemon(version 2.3，Matrix Science， Boston，MA)数据库对蛋白质的鉴定和iTRAQ定量分析基于II5(Foc TR4)蛋白质数据库进行 搜索，其中115蛋白质数据库由16，446序列条目和7，300，852个氨基酸残基组成(Fusarium Comparative Sequencing Project,Broad Institute of MIT and Harvard,http:// www.broadinstitute .org/) Jascot默认的搜索设置如下：一个错失裂解位点的胰蛋白酶 允许与半胱氨酸固定的MMTS修饰，固定的4-plex iTRAQ修饰位于赖氨酸(Lys)和N-末端脱 酰胺化和可变修饰的甲硫氨酸氧化，天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gin)残基脱酰胺化，和4-plex iTRAQ的酪氨酸(Tyr)。肽段和碎片离子的质量分别为公差值为20ppm和0.1 Da。为了评 估错误发现率(FDA)以衡量鉴定确定性的范围，在每个重复设置中采用Elias和Gygi的目 标-诱t耳策略(Elias et al.，2007)。具体而言，一个自动的诱t耳数据库搜索是通过Mascot 的选择复选框中的一个诱饵随机序列的数据库生成和测试的原始光谱以及真正的数据库 中进行。为了减少错误肽段识别的概率，只有当肽段意义分值U 20)，且通过Mascot概率分 析(《^￥.111&1：1^18(^611〇6.(3〇111/116]^/8(3〇1'；[1^_116]^.111：1]止#?13]\0在大于99%的置信区间内才 认为被鉴定到。它要求在Mascot分析过程中每一个可靠的鉴定的蛋白质至少有两个独特的 肽段数。同一家族内发现的蛋白质组成了Mascot里的蛋白家族。此外，考虑到蛋白的定量， 一个蛋白至少要产生两个完整的iTRAQ报告离子系列。
[0062] 2.6.5蛋白质的功能分析
[0063] 为了充分挖掘定量蛋白质数据所包含的生物学信息，本实施例使用多种方法对 Foe TR4早期发育的蛋白质进行功能注释和功能分类。针对所有鉴定的蛋白，采用Blast2go (Bio informatics Department，CIPF，Valencia，Spain)进行 GO (Gene Ontho logy)功能注释 (Conesa et al.，2008;G6tz.et al.，2008)，并对差异蛋白进行GO富集分析。C0G(Cluster of Orthologous Groups of proteins，蛋白相邻类的聚簇)是对蛋白质进行直系同源分类 的数据库。构成每个C0G的蛋白都被假定为来自于同一个祖先蛋白，并且是orthologs或者 是paralogsArthologs是指来自于不同物种的由垂直家系(物种形成)进化而来的蛋白，并 且特异地保留与原始蛋白相同的功能。Paralogs是那些在一定物种中的来源于基因复制的 蛋白，可能会进化出新的与原来有关的功能。而K0G(eukaryotic orthologous groups，真 核生物直系同源族)是直系同源族特异识别真核细胞的蛋白质序列的分析数据库。将鉴定 到的蛋白质和K0G数据库进行比对，预测这些蛋白质可能的功能并对其做功能分类统计(Li et al·，2003)〇
[0064] 2.7Foc TR4早期发育相关蛋白的检测
[0065] 提取四个时间点收集的Foe TR4孢子/菌丝中总蛋白（图1和图2)，通过定量蛋白质 组学分析Foe TR4早期发育过程中3h，7h和llh相对于对照(Oh)的蛋白质变化规律。任何给 定蛋白在3h，7h和llh相对于对照(Oh)的相对浓度变化可以通过iTRAQ的4-plex报告离子比 率来获得。通过两次独立的生物学重复实验鉴定和定量蛋白质，共鉴定3659个蛋白，其中有 2966(81%)个蛋白在两次重复实验中都被检测到。两次重复实验中总共鉴定到有定量值的 蛋白3035个，其中在两次重复实验都被检测到有2431(80%)个。如图3所示，结合两次生物 学重复和定义差异蛋白的最大阈值2.0,共有260、260和201个差异蛋白分别在3、7和11小时 上调表达，同时也有265、480和429个差异蛋白下调表达。
[0066] 2.8Foc TR4孢子早期发育差异蛋白的鉴定与功能分析
[0067]为了获得尽可能多的功能注释信息，利用G0和K0G对三个时间点的所有差异表达 蛋白进行功能分类。针对鉴定的差异表达蛋白，采用生物信息学工具Blast2g〇进行G0功能 注释，并对差异表达蛋白在G0分类的3个主要类群生物学过程、分子功能、细胞组分进行G0 功能富集分析。本实施例中蛋白质的功能注释基于GO的第三水平，并覆盖20个功能类别。GO 术语分数计算在每个节点根据公式
其中seq是注释到不同序列的数目，而 dist为G0术语到子G0间的距离。上调和下调差异表达蛋白的G0预测结果见图4。研究发现大 部分上调图4A或下调图4B的差异表达蛋白属于细胞代谢过程（cellular metabolic pro cess)、氧化还原过程（oxidation-reduction process)、初级代谢过程（primary metabolic process)、小分子代谢过程中（small molecule metabolic process)、生物合 成过程（biosynthetic process)、大分子的代谢过程（macromolecule metabolic process)、氮化合物代谢过程(nitrogen compound metabolic process)等。
[0068] 基于K0G差异表达蛋白的功能分类发现:共有747 (74%)个差异表达蛋白属于K0G 的不同功能类别，还有262(26%)个差异表达蛋白不在K0G功能类别中（Tatusov et al.， 2003;Tatusov et al.，2001)。差异表达蛋白的K0G功能分类总结见图5,几乎包含所有的功 能类别和重要的生物过程(Leng et al.，2008)。这表明Foe TR4早期发育蛋白质组变化的 复杂性（图5)106的分析确定了Foe TR4孢子早期发育相关的差异表达蛋白大部分 (