专利名称：表皮葡萄球菌色氨酰－tRNA合成酶及其在筛选药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，具体涉及表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)和色氨酸专职tRNA(tRNAtrp)。更具体地，本发明涉及TrpRS的基因克隆、基因表达、蛋白纯化和功能测定、蛋白结构的三维模建；以及利用TrpRS蛋白与tRNAtrp和ATP分子的相互作用筛选药物化合物。
背景技术：
葡萄球菌与医院内化脓性感染相关，尤以金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌最为密切，表皮葡萄球菌所致感染与一些高分子医疗器材在体内的留置有关，如静脉导管、起搏器、脑脊液引流装置、人工器官等。随着上述医疗材料的使用日益频繁，此类院内感染问题日益严峻，而且易发展成为慢性感染，对抗生素的抗性较高。
色氨酰-tRNA合成酶(Tryptophanyl-tRNA Synthetase，TrpRS)属于氨基酰-tRNA合成酶I类家族，参与细菌基因翻译全过程，是细菌维持生命活动所必须。该蛋白分子量约37KD，共329个氨基酸。其功能是催化色氨酸与tRNAtrp的CCA末端2’-OH之间的酰基化反应，进而参与肽链的合成。在此过程中，TrpRS蛋白必须首先与ATP结合，然后与tRNAtrp相互作用，是整个肽链合成过程中不可缺少的环节，抑制了这一环节即可抑制细菌的蛋白质合成，从而抑制细菌的生长。
发明内容
本发明的目的是提供表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶及其在筛选药物中的应用，尤其是在筛选抗菌药物中的应用。
本发明将表皮葡萄球菌的色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)作为抗菌靶点，利用该蛋白空间结构特点及其与tRNAtrp以及ATP分子的作用机理来筛选具有抗菌活性的小分子化合物。
本发明通过序列同源性比较以及功能域分析等生物信息学手段在表皮葡萄球菌ATCC12228株全基因组序列(GeneBank收录号AE01 5929)中选择了编码TrpRS蛋白的基因。利用PMODELING软件对TrpRS蛋白进行三维模建，分析证实其存在保守结构和位点可作为筛选药物的“靶点”。确定了TrpRS蛋白从N末端起第15-18个氨基酸(TIGN)以及第193-197个氨基酸(KMSKS)，在空间上形成口袋状，是ATP的结合区域；TrpRS蛋白与tRNAtrp结合的位点位于N末端起第107-122个氨基酸(QFKDKAQKRADGVPAG)以及第234-238个氨基酸(ENKPG)。本发明的三维模建结果可用于筛选活性化合物以阻断细菌的蛋白质合成，从而抑制细菌的生物学活性和/或生长。
本发明提供了制备表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶的方法，将其编码基因克隆至适合的表达载体，转化宿主菌，在适于的条件下培养该宿主细胞，以及从培养物中提取和纯化所需蛋白。
本发明将编码TrpRS蛋白的基因克隆至相关载体，DNA限制性内切酶酶切鉴定挑选阳性克隆，测序证实基因序列正确后，将目的基因与表达载体重组，形成重组表达质粒。
本发明不限于特定的表达质粒。在一优选实施方案中，本发明使用原核表达载体，例如pkk223-3等。
上述重组表达载体可按常规方法导入适宜宿主细菌。本发明不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。在一优选实施方案中，本发明使用大肠杆菌JM109等。
本发明对编码tRNAtrp的基因序列进行了改造，用于进行tRNAtrp编码基因的体外转录。设计扩增tRNAtrp基因的引物，在其5’端加入T7启动子序列，在3’端设计一个MvaI酶切位点(通过酶切可得到CCA末端)，所得PCR产物长度94bp与pGEM-T Easy载体连接，所获克隆酶切之后可以直接进行体外转录得到tRNAtrp，用于研究与色氨酰-tRNA合成酶蛋白的相互作用。
本发明利用TrpRS蛋白与ATP以及tRNAtrp相互作用筛选小分子化合物，得到能够阻断TrpRS蛋白与ATP以及tRNAtrp相互作用的活性化合物。
以上技术方案中所有基本分子生物学操作均参照<分子克隆实验指南>。
本发明涉及TrpRS蛋白氨基酸序列(SEQUENCE 1)，编码TrpRS蛋白的基因核苷酸序列(SEQUENCE 2)，以及经改造可转录tRNAtrp的核苷酸序列(SEQUENCE 3)。
图1是色氨酰-tRNA合成酶蛋白的三维模建图，其中标明了与tRNAtrp作用的两个区域(即234-238区域和108-122区域)以及在空间上结合ATP的两个区域(即15-18区域和193-197区域)。
图2是筛选出的小分子化合物之一与色氨酰-tRNA合成酶蛋白功能域结合。
具体实施例方式
实例1 表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶蛋白的三维模建应用PMODELING软件，在计算机工作站上对色氨酰-tRNA合成酶蛋白的三维结构进行了模拟，确定了与tRNAtrp作用的两个区域，即234-238区域(ENKPG)与108-122区域(QFKDKAQKRADGVPAG)。另外还确定了构成Rossmann折叠、可以在空间上结合ATP的两个区域，即15-18区域(TIGN)和193-197区域(KMSKS)，见图1。
实例2 色氨酰-tRNA合成酶基因的克隆和鉴定以及蛋白的表达与纯化(1)色氨酰-tRNA合成酶基因的克隆及原核表达质粒TrpRS-PKK223-3的构建通过PCR扩增出目的基因，然后通过限制性内切酶(SmaI和PstI)的酶切反应和T4DNA连接酶的连接反应，将色氨酰-tRNA合成酶基因克隆到pkk223-3载体上，转化JM109细菌，挑选氨苄抗性菌落，小量扩增提取质粒DNA，通过双酶切鉴定证实为阳性克隆。
色氨酰-tRNA合成酶基因获取方法如下
在正义链引物5′端设计SmaI酶切位点，反义链引物5′端设计PstI酶切位点sense5′tccccc gggatg gaa act tta ttc tca gga att ca 3′anti-sense5′ctt ctg cag tta tct ttt tcg acc taa gcc cat 3′其中加下滑线的序列是Sma I的酶切位点，斜体的序列是Pst I的酶切位点。
限制性内切酶购自Takara公司，大肠杆菌JM109、质粒pkk223-3购自AMERSHAM公司。
(2)色氨酰-tRNA合成酶蛋白的表达HostE.coli-JM109MediumLBIPTG工作浓度1mM1)挑单克隆菌落接种至5ml LB medium，37℃×250rpm至OD600＝1～2。
2)接种10ul至5ml LBK medium，加1M IPTG至终浓度1mM，诱导表达3h。
3)取500ul菌液离心，取沉淀，PBS重悬，加2×loading buffer，沸水煮5′使蛋白变性。
4)取20ul上样，进行12％SDS-PAGE蛋白电泳。
可以在约37kD处看到目的蛋白的表达。
(3)色氨酰-tRNA合成酶蛋白的大量表达和纯化按照上述诱导条件对大量细菌进行诱导，用PBS重悬后超声破碎，于4℃以12000转/分离心15分钟，取上清液。用Q-Sepharose FastFlow柱提纯蛋白。以12％SDS-PAGE蛋白电泳分析确定目的蛋白的分布。用Bradford法对蛋白质进行定量，计算样品浓度。
实例3 表皮葡萄球菌tRNAtrp基因的克隆、鉴定及体外转录由于所需得到的tRNAtrp基因是为了酶切之后用于体外转录，因此必须对tRNAtrp基因序列进行一定的改造。tRNAtrp基因获得方法如下设计引物通过PCR方法扩增出目的片段tRNAtrp基因，设计引物时在5’端设计一段T7启动子序列，在3’端设计一个MvaI酶切位点(通过酶切后可得到CCA末端)，所得PCR产物长度94bp。
sense5′taa tac gac tca cta taa ggg gca tag ttc aac ggt ag 3′antisense5′gcc tgg cag ggg cag tag ga 3′其中加下划线的序列为T7 promoter，斜体表示的序列为Mva I的酶切位点。通过PCR方法得到该基因后，在其两端加上dATP，再通过T4DNA连接酶将tRNAtrp基因连接到pGEM-T Easy载体上，转化DH5α细菌，挑选氨苄抗性的菌落，小量扩增提取质粒DNA，通过PCR鉴定以及双酶切鉴定证实为阳性克隆。
扩增该菌，大量抽提质粒，通过酶切得到目的基因后，通过RNA体外转录试剂盒直接得到tRNAtrp，用于研究与色氨酰-tRNA合成酶蛋白的相互作用。
限制性内切酶购于Takara公司，pGEM-T Easy载体购自Promega公司。
实例4 小分子化合物的筛选以模建的色氨酰-tRNA合成酶蛋白三维结构为模板，通过其保守区域结构到SPECS化合物库中使用构像筛选的方法筛选出能与其相互作用的小分子化合物。以DOCK标准初次筛选，筛选出小分子化合物按结合能低到高排序，选择前2000个小分子化合物，用AUTODOCK标准重新评分，选择最佳的86个小分子化合物，将其按结合能由低到高排序 见表1。
表1
以其中一种小分子为例演示其与色氨酰-tRNA合成酶蛋白的结合，见图2。
以这些小分子化合物进行抑菌实验，并在蛋白水平研究其对色氨酰-tRNA合成酶蛋白与tRNAtrp以及ATP之间结合的影响。通过对结合能以及酶学动力常数的测定，确证筛选出的小分子化合物可以抑制TrpRS蛋白与tRNAtrp以及ATP的结合。
无需进一步详细阐述，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
从以上描述，本领域技术人员可很容易地明了本发明的本质特征，而且在不偏离其主旨和范围的情况下，可对本发明进行各种变更和改进。
SEQUENCE LISTINGOrganization Applicant----------------------Street医学院路138号City上海Country中国PostalCode200032PhoneNumber8621-54237524FaxNumber8621-54237524<110>复旦大学<120>表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶及其在筛选药物中的应用<160>3<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>329<212>PRT<213>表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)<400>1Met Glu Thr Leu Phe Ser Gly Ile Gln Pro Ser Gly Ile Pro Thr Ile1 5 10 15Gly Asn Tyr Ile Gly Ala Leu Lys Gln Phe Val Asp Val Gln Asp Asp20 25 30Tyr Glu Cys Phe Phe Cys Ile Val Asp Gln His Ala Ile Thr Val Pro35 40 45Gln Asp Arg Leu Lys Leu Arg Lys Gln Ile Arg Gln Leu Ala Ala Ile50 55 60
Tyr Leu Ala Thr Gly Ile Asp Pro Asp Lys Ser Thr Leu Phe Ile Gln65 70 75 80Ser Glu Val Pro Ala His Val Gln Ala Gly Trp Met Leu Thr Thr Ile85 90 95Ala Ser Ile Gly Glu Leu Glu Arg Met Thr Gln Phe Lys Asp Lys Ala100 105 110Gln Lys Arg Ala Asp Gly Val Pro Ala Gly Leu Leu Thr Tyr Pro Pro115 120 125Leu Met Ala Ala Asp Ile Val Ile Tyr Asn Thr Asn Ile Val Pro Val130 135 140Gly Asp Asp Gln Lys Gln His Met Glu Leu Thr Arg Asn Leu Val Asp145 150 155 160Arg Phe Asn Ser Arg Tyr Asn Asp Val Leu Val Lys Pro Glu Val Arg165 170 175Met Pro Lys Val Gly Gly Arg Val Met Ser Leu Gln Asp Pro Thr Lys180 185 190Lys Met Ser Lys Ser Asp Asp Asn Gln Lys Asn Phe Ile Ser Leu Leu195 200 205Asp Glu Pro His Val Ala Ala Lys Lys Ile Lys Ser Ala Val Thr Asp210 215 220Ser Asp Gly Ile Ile Lys Phe Asp Arg Glu Asn Lys Pro Gly Ile Ser225 230 235 240
Asn Leu Leu Ser Ile Tyr Ser Gly Leu Thr Asn Glu Ser Ile Lys Asn245 250 255Ile Glu Ser Lys Tyr Glu Gly Glu Gly Tyr Gly Lys Phe Lys Gly Asp260 265 270Leu Ser Glu Ile Val Lys Asp Phe Leu Ile Asn Phe Gln Glu Lys Tyr275 280 285Ala Ser Phe Tyr Asn Ser Asp Asp Leu Asp Asp Ile Leu Asp Lys Gly290 295 300Lys Glu Lys Ala Gln Lys Ala Ser Phe Lys Thr Leu Lys Lys Met Glu305 310 315 320Lys Ala Met Gly Leu Gly Arg Lys Arg325<210>2<211>990<212>DNA<213>表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)<400>2atggaaactt tattctcagg aattcagcca agtggtattc caacaattgg taactacatt60ggtgcattaa aacaatttgt agatgttcaa gatgactatg aatgtttttt ctgtatcgta 120gaccaacatg caataacggt accacaagac cgcttaaaat tacgcaaaca aatacgtcaa 180ctcgcagcaa tttatttggc aacaggtatt gatccagata aatcgacttt atttattcaa 240tctgaagtcc ctgcacacgt gcaagctggt tggatgctta caacaatagc ttctattggt 300gaattggaac gtatgactca gtttaaagac aaagctcaga aacgcgcaga tggagtgcct 360gctggtctac tcacttatcc accattgatg gcggctgata tcgtgattta caacactaac 420
attgtccctg ttggtgatga tcaaaaacag catatggaac tgacacgtaa tttagtagat480cgtttcaata gtagatataa cgatgtatta gtaaaaccag aggtacgaat gcctaaagtt540ggtgggcgtg tgatgagttt acaagatcct actaaaaaaa tgagtaaaag tgatgataat600cagaagaatt tcatttcttt attggatgaa cctcatgtag ctgccaaaaa aattaaaagc660gctgtaacag actctgacgg tataataaaa tttgatcgtg agaataaacc aggcatttca720aatttacttt caatatattc tggtctaact aatgaatcta ttaagaatat tgaatctaaa780tatgaaggtg aaggttacgg taaatttaaa ggtgatttat cggaaatcgt taaagatttt840cttattaatt tccaagaaaa atatgcaagc ttttataatt ctgatgacct agatgatatt900ctagataaag gtaaagaaaa agctcaaaaa gcttcattta aaacattgaa aaaaatggaa960aaagcaatgg gcttaggtcg aaaaagataa 990<210>3<211>94<212>DNA<213>表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)<400>3taatacgact cactataagg ggcatagttc aacggtagaa tagaggtctc caaaaccttt 60gatgtgggtt cgattcctac tgcccctgcc aggc 9权利要求
1.表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶，其特征是其保守区包括从N末端起第15-18个氨基酸(TIGN)以及第193-197个氨基酸(KMSKS)的两个区域，还包括TrpRS蛋白与tRNAtrp结合的位点N末端起第107-122个氨基酸(QFKDKAQKRADGVPAG)以及第234-238个氨基酸(ENKPG)，所述合成酶通过序列同源性比较及功能域分析等生物信息学手段在表皮葡萄球菌ATCC12228株全基因组序列(GeneBank收录号AE015929)中选择色氨酰-tRNA合成酶的基因SEQUENCE 2和蛋白SEQUENCE 1以及tRNAtrp基因SEQUENCE 3。
2.根据权利要求1的表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶，所述SEQUENCE 1的氨基酸序列存在连续40个以上相同的氨基酸，或至少70％以上序列同源的多肽，能选择性地与SEQUENCE 2的核苷酸杂交、存在连续60个以上相同的核苷酸或至少70％同源于SEQUENCE 2的DNA片断，能选择性地与SEQUENCE 3的核苷酸杂交、存在连续30个以上相同的核苷酸或至少70％同源的DNA片断。
3.根据权利要求1的表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶，其中所述的多肽包括其氨基酸序列的部分序列，或其氨基酸的部分被性质相似的氨基酸取代的多肽，或其氨基酸的部分中加入或插入其他氨基酸的多肽，或DNA的核苷酸序列改变，但不影响氨基酸序列的多肽。
4.根据权利要求1的表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶，其中所述的氨基酸序列的部分序列包括只含生物学活性的功能域的基本序列。
5.根据权利要求1的表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶，其空间结构经模建，确定存在保守结构和位点可作为筛选药物的“靶点”。成手段产生反义RNA。反义RNA可用于控制细菌细胞内多肽水平。
6.根据权利要求1的表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶，其特征在于所述色氨酰-tRNA合成酶与ATP以及tRNAtrp相互作用形成筛选活性化合物的功能域。
7.根据权利要求6的表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶，其特征在于所述tRNAtrp基因序列通过引物设计，在其5’端加入T7启动子序列，在3’端设计一个MvaI酶切位点，酶切后得CCA末端，获得转录tRNAtrp的克隆。
全文摘要
本发明属生物技术领域，具体涉及表皮葡萄球菌色氨酰－tRNA合成酶(TrpRS)和色氨酸专职tRNA(tRNA
文档编号C12N9/00GK1528888SQ0315121
公开日2004年9月15日 申请日期2003年9月26日 优先权日2003年9月26日
发明者瞿涤, 闻玉梅, 吴旸, 秦志强, 瞿 涤 申请人:复旦大学