专利名称：Hla－b51基因亚型检测芯片及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因分析检测产品，具体地说是基因检测芯片，更具体的说是适用于检测HLA-B51基因亚型的基因检测芯片及其应用。
背景技术：
白塞病是一种顽固性的多系统炎症综合症，主要表现为口疮溃疡、眼睛症状、皮肤损伤、生殖道溃疡等。目前其病因学和病理学均不清楚，治疗效果很不理想。同时由于该病的发病率并不高，发现其高危人群并进行有针对性的预防也十分重要。国内外的研究表明，HLA-B51基因与白塞病密切相关，参见Yabuki K等。沙特阿拉伯白塞病患者的HLAI类和II类分型。组织抗原。1999；54273-277(Yabuki K et al.HLA class Iand II typing of the patients with Behcet′s disease in Saudi Arabia.Tissue Antigens.1999；54273-277)。HLA-B51基因存在9种亚型(5101-5109)，对疾病的预防和治疗有不同影响，因此测定HLA-B51基因亚型对于白塞病的防治具有重大意义，见Gonzalez-Escnbano MF等。HLA-B51亚型与西班牙白塞病患者的相关性。组织抗原。1998；5278-80(Gonzalez-Escribano MF，et al.Association of HLA-B51 subtypes andBehcet′s disease in Spain.Tissue Antigens.1998；5278-80)。但目前测定HLA-B51基因亚型的方法主要采用聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)、手工或自动测序、序列特异性引物PCR等方法，不仅操作繁琐，检测周期长，而且影响检测结果的因素多，不易控制，难以满足临床检验的要求，使临床至今还无法开展有关白塞病易感基因的检测。
基因芯片是近几年在高科技领域内出现的最具时代特征的重大科技进展之一。它是将能反映样本中大量基因信息的基因探针(寡核苷酸探针、cDNA克隆、PCR产物等)，有序固定在固相支持物(如醛基、氨基、巯基、羧基等活性基团修饰的载玻片或硅片、尼龙膜、硝酸纤维素膜)上形成阵列，通过与实际样本(或扩增产物)进行杂交反应，只需一次实验，就可高通量获得所有待检基因的信息。这种平行检测、高信息通量的特点使其在基因表达、基因多态性检测等方面的应用受到广泛重视。用基因芯片检测HLA-B51基因亚型，发挥基因芯片检测操作简单、结果准确的特点，对于临床筛选白塞病高危人群，具有重要的现实意义。
发明内容本发明针对现有技术的不足，提供一种用于检测HLA-B51基因亚型的基因检测芯片，还提供一种利用该芯片检测HLA-B51基因亚型的方法。
本发明的HLA-B51基因亚型检测芯片，包括固相支持物和有序固定在所述固相支持物上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含以下序列中的包括HLA-B-Exon3-Loci1 C/I，HLA-B-Exon3-Loci2I/G，HLA-B-Exon3-Loci3 CIG/CGG/GAC，HLA-B-Exon3-Loci4CTTGG/TCATC/CCCTC，HLA-B-Exon2-Loci5T/C，HLA-B-Exon3-Loci6A/T在内的17-26个连续核苷酸，其中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2包含Loci1，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4包含Loci2，SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7包含Loci3，SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10包含Loci4，SEQ ID NO11和SEQ ID NO12包含Loci5，SEQ ID NO13和SEQ ID NO14包含Loci6SEQ ID NO1ggctccgcagaCacctggagaacgggSEQ ID NO2ggctccgcagaTacctggagaacgggSEQ ID NO3cctgtgcgtggagTggctccgcagaSEQ ID NO4cctgtgcgtggagGggctccgcagaSEQ ID NO5ggcggagcagCTGagagcctacctggaSEQ ID NO6ggcggagcagCGGagagcctacctggaSEQ ID NO7ggcggagcagGACagagcctacctggaSEQ ID NO8ccagggtctcacaCTTGGcagacgatgtatgSEQ ID NO9ccagggtctcacaTCATCcagacgatgtatgSEQ ID NO10ccagggtctcacaCCCTCcagacgatgtatgSEQ ID NO11ggaacacacagatctTcaagaccaacacacaSEQ ID NO12ggaacacacagatctCcaagaccaacacacaSEQ ID NO13gggaggcggcccgtgAggcggagcagSEQ ID NO14gggaggcggcccgtgTggcggagcag。
为了增强检测信号的强度，提高检测结果的准确率，所述Loci1C/T，Loci2T/G，Loci3CTG/CGG/GAC，Loci4CTTGG/TCATC/CCCTC，Loci5T/C，Loci6A/T最好位于所述探针的中部。
所述探针还可以在其5′端包含一段氨基修饰的16聚的聚脱氧胸苷酸(聚dT)。
所述固相支持物可采用各种基因芯片领域的常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基、异硫氰酸基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
本发明基因芯片的制备可按照生物芯片的常规制造方法进行。例如，如果固相支持物采用的是修饰玻片或硅片，探针的5′端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后用点样仪将其点在修饰玻片或硅片，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的基因芯片。如果寡核苷酸探针不含氨基修饰，则其制备方法也可参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；Derisi，JL，Iyer VR和Brown PO于1997年在《科学》278(5338)680-686发表的“探讨基因组内基因表达的代谢和遗传控制”(Derisi，JL，Iyer VR，Brown PO.Exploring the metablicand genetic control of gene expression on a genomic scale.Science.1997；278(5338)680-686)及马立人，蒋中华主编。生物芯片。北京化学工业出版社，2000，1-130。
HLA-B51基因亚型检测芯片的应用，一种非以诊断为目的检测HLA-B51基因亚型的方法。
HLA-B51基因亚型检测芯片的应用，包括以下步骤(1)制备染色体DNA；(2)用聚合酶链反应(PCR)方法扩增HLA-B基因中包含Loci1C/T，Loci2T/G，Loci3CTG/CGG/GAC，Loci4CTTGG/TCATC/CCCTC，Loci5T/C，Loci6A/T的基因片段；(3)将所得扩增产物变性后与含有检测探针的杂交缓冲液混合；(4)将上述混合液与基因芯片杂交；(5)检测基因芯片的杂交信号。
制备用于PCR扩增的染色体DNA的方法有很多，可以从全血中制备、也可以从发根中制备，还可以从口腔粘膜的脱落物中制备。具体方法可参阅文献(丁振诺，苏明权主编。《临床PCR基因诊断技术》，世界图书出版公司。1998年第一版)。
用PCR方法扩增染色体基因特定片段的方法已经是本领域公知技术。其中的关键在于引物设计，有关引物设计的方法、软件均可以从商业途径获得。本发明涉及的HLA-B基因的扩增引物和体系可根据以上方法及有关文献(KB穆里斯，F.费里，R.吉布斯等主编《PCR聚合酶链式反应》，科学出版社)方法由使用者独立完成。
在所述步骤(3)中所用的检测探针，是选自HLA-B-Exon3-Loci0A序列的包含所述Loci0A的18-20聚寡核苷酸，其5‘端带有标记基团HLA-B-Exon3-Loci0AtacgcctacgacggcaaAgattacatcgccct(SEQ ID NO15)为了增强检测信号的强度，提高检测结果的准确率，所述Loci0A最好位于所述探针的中部。检测探针在合成时，其5′端带标记基团，所述标记基团包括但不限于地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生物分子(FITC等)、其他荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等。这些标记及其标记方法以及各标记物的检测方法都已是本领域众所周知的常规技术，也可以参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯主编，《分子克隆实验指南》，科学出版社，1995年；马立人，蒋中华主编，《生物芯片》，北京化学工业出版社，2000，1-130。
在所述步骤(5)中检测杂交信号的方法选自碱性磷酸酶催化的四氮唑蓝显色反应，辣根过氧化物酶催化的5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺盐显色反应或辣根过氧化物酶催化的四甲基联苯胺显色反应。
扩增产物的变性可采用常规变性方法如加热至94～98℃，并保温2～10min，然后迅速置冰上。
取适量变性的扩增产物与适量的检测探针溶液一同加入杂交缓冲液中与基因芯片杂交。与基因芯片杂交时，可以先将基因芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。
本发明扩增产物与基因芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样品浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯主编，《分子克隆实验指南》，科学出版社，1995年。
然后根据标记信号在基因芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。本发明所述检测基因芯片杂交信号的方法是基于与抗生物素抗体或亲合素或链亲合素或抗地高辛抗体或抗荧光素抗体复合在一起的碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶催化的四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺盐(BCIP)或四甲基联苯胺(TMB)的显色反应。具体方法可参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》。若扩增产物用荧光基团标记，也可以直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray3000等)获取待测信息。
本发明还提供一种用于检测HLA-B51基因亚型的试剂盒，该试剂盒包含本发明所说的基因芯片和应用方法。
本发明提供基因芯片及其试剂盒，可用于检测白塞病的易感基因，这为临床筛选出白塞病高危人群，并提供有针对性的治疗提供了一种简便易行的解决方案。
图1是本发明基因芯片上的一种点样列阵；图2是用本发明基因芯片检测HLA-B51基因亚型所得结果的照片。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的更详细的说明，而不是对本发明范围的限定。
实施例1、基因芯片的制备(1)醛基修饰的载玻片(产品编号BSM03011，上海百傲科技有限公司)。人工合成(上海生工生物工程技术服务有限公司)以下探针，用水溶解成(100pmol/ul)浓度，然后用2×点样buffer(产品编号BST02010，上海百傲科技有限公司)等比混合。接着，用Affymetrix公司的GSM417点样仪按说明书所述方法点制如图1的阵列。然后室温放置过夜。
其中各探针序列为Loci1CNH2-5’-tttttttttttttttt ctccgcagaCacctggagaa-3’(20聚)(SEQ ID NO16)Loci1TNH2-5’-tttttttttttttttt ctccgcagaTacctggagaac-3’(21聚)(SEQ ID NO17)Loci2TNH2-5’-tttttttttttttttt gcgtggagTggctccgca-3’(18聚)(SEQ ID NO18)Loci2GNH2-5’-tttttttttttttttt cgtggagGggctccgca-3’(17聚)(SEQ ID NO19)Loci3CTGNH2-5’-tttttttttttttttt cggagcagCTGagagcctacct-3’(22聚)(SEQ ID NO20)Loci3CGGNH2-5’-tttttttttttttttt cggagcagCGGagagcctacc-3’(21聚)(SEQ ID NO21)
Loci3GACNH2-5’-tttttttttttttttt cggagcagGACagagcctacc-3’(21聚)(SEQ ID NO22)Loci4CTTGGNH2-5’-tttttttttttttttt ctcacaCTTGGcagacgatgtatg-3’(24聚)(SEQ ID NO23)Loci4TCATCNH2-5’-tttttttttttttttt ggtctcacaTCATCcagaggatgt-3’(24聚)(SEQ ID NO24)Loci4CCCTCNH2-5’-tttttttttttttttt ctcacaCCCTCcagaggatgtacg-3’(24聚)(SEQ ID NO25)Loci5TNH2-5’-tttttttttttttttt acacacagatctTcaagaccaacaca-3’(26聚)(SEQ ID NO26)Loci5CNH2-5’-tttttttttttttttt acacacagatctCcaagaccaacac-3’(25聚)(SEQ ID NO27)Loci6ANH2-5’-tttttttttttttttt ggcccgtgAggcggagc-3’(17聚)(SEQ ID NO28)Loci6TNH2-5’-tttttttttttttttt ggcccgtgTggcggagc-3’(17聚)(SEQ ID NO29)实施例2、染色体DNA的制备取待检者全血500μl，用一次性无菌注射针头抽取，收集于含50ul的2％EDTA溶液的无菌1.5ml离心管中，将管盖盖上，上下颠倒数次，使混匀。取无菌的1.5ml离心管，向其中加入混匀的待检全血100μl和纯水300μl，充分混匀，室温静置8分钟；将离心管置离心机中，6000g离心1分钟；取出离心管，倾去上清液，离心管底部可见少量白色沉淀；向离心管中加入抽提液(产品编号BST01010，上海百傲科技有限公司)60μl，充分振荡使沉淀溶解；沸水浴中15分钟；取出离心管，置离心机中，12,000g离心15分钟。离心后上清液可直接用于PCR扩增。
实施例3、用PCR方法扩增HLA-B基因片段合成以下引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)上游引物5’-ccggagtattgggaccgcaac-3’(SEQ ID NO30)下游引物5’-gcgcgctgcagcgtctcc-3’ (SEQ ID NO31)然后用水溶解并稀释至10pmol/μl。将购置的Taq酶(产品编号Lot，CE1101-1，TaKaRa)、10×缓冲液(产品编号Lot，A2401-2，TaKaRa)、dNTP(产品编号D0056，上海生工生物工程技术服务有限公司)、纯水以及实施例2获得的PCR扩增模板按以下配方配制PCR扩增体系反应体系 体积(μl)10×缓冲液2.5dNTP(各2.5mM) 2.5引物1(10pmol/ul) 1引物2(10pmol/ul) 1
Taq酶(2.5U/ul)0.8H2O 14.2模板 3总体积25μl用PCR扩增仪Tc-25/H(杭州大和热磁电子有限公司)按以下程序扩增94℃，5min，然后按94℃25sec，59℃25sec，72℃45sec做35个循环，最后72℃5min。实施例4、HLA-B51基因亚型检测芯片的应用，PCR产物与基因芯片的杂交。
合成以下检测探针(上海生工生物工程技术服务有限公司)生物素-5’-cgacggcaaagattacatcgc-3’(SEQ ID NO32)然后用水溶解并稀释至10pmol/μl。
采用上海百傲科技有限公司的芯片杂交试剂盒与芯片显色试剂盒进行此杂交试验。所述芯片杂交试剂盒(产品编号BST05010，上海百傲科技有限公司)包含预杂交液，杂交缓冲液，洗液1，反应舱。所述芯片显色试剂盒(产品编号BST06010，上海百傲科技有限公司)包含抗体液，洗液2，洗液3，显色液。
(1)将实施例1的基因芯片用预杂交液预杂交5min，然后除去预杂交液。A芯片和B芯片的预杂交温度为45℃，C芯片用杂交缓冲液进行预杂交，预杂交温度为58℃。
(2)将实施例3获得的PCR扩增产物混合后先98℃变性5min，然后取10μl和检测探针溶液1μl一同加至200μl杂交缓冲液中混匀，与预杂交完毕的基因芯片进行30分钟杂交反应，杂交温度为45℃。
(3)将杂交完毕的基因芯片用已预热至杂交温度的洗液1洗两次，每次10分钟；(4)然后用洗液2室温洗2分钟；(5)将基因芯片与抗体液室温反应20分钟；(6)然后将基因芯片用洗液2室温洗5分钟，再重复此步骤一次；再用洗液3室温洗2分钟。
(7)在基因芯片上加显色液200μl，45℃放置40分钟。然后用水冲洗干净，晾干。
实施例5、基因芯片杂交信号的检测将杂交并洗涤完毕的基因芯片置于Baio BE3.0生物芯片识读仪(BSE01021，上海百傲科技有限公司)上扫描后得到如图2所示的检测结果。结果表明受检者的HLA-B51基因属于B5101亚型，是白塞病易感的高危人群。检测结果经测序结果验证完全符合。
权利要求
1.一种HLA-B51基因亚型检测芯片，包括固相支持物和固定在所述固相支持物上的寡核苷酸探针，其特征在于所述寡核苷酸探针包含以下序列中的包括HLA-B-Exon3-Loci1C/T，HLA-B-Exon3-Loci2T/G，HLA-B-Exon3-Loci3 CTG/CGG/GAC，HLA-B-Exon3-Loci4CTTGG/TCATC/CCCTC，HLA-B-Exon2-Loci5T/C，HLA-B-Exon3-Loci6A/T在内的17-26个连续核苷酸，其中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2包含Loci1，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4包含Loci2，SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ IDNO7包含Loci3，SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10包含Loci4，SEQ IDNO11和SEQ ID NO12包含Loci5，SEQ ID NO13和SEQ ID NO14包含Loci6SEQ ID NO1ggctccgcagaCacctggagaacgggSEQ ID NO2ggctccgcagaTacctggagaacgggSEQ ID NO3cctgtgcgtggagTggctccgcagaSEQ ID NO4cctgtgcgtggagGggctccgcagaSEQ ID NO5ggcggagcagCTGagagcctacctggaSEQ ID NO6ggcggagcagCGGagagcctacctggaSEQ ID NO7ggcggagcagGACagagcctacctggaSEQ ID NO8ccagggtctcacaCTTGGcagacgatgtatgSEQ ID NO9ccagggtctcacaTCATCcagacgatgtatgSEQ ID NO10ccagggtctcacaCCCTCcagacgatgtatgSEQ ID NO11ggaacacacagatctTcaagaccaacacacaSEQ ID NO12ggaacacacagatctCcaagaccaacacacaSEQ ID NO13gggaggcggcccgtgAggcggagcagSEQ ID NO14gggaggcggcccgtgTggcggagcag。
2.如权利要求1所述的基因芯片，所述Loci1C/T，Loci2T/G，Loci3CTG/CGG/GAC，Loci4CTTGG/TCATC/CCCTC，Loci5T/C，Loci6A/T位于所述探针的中部。
3.如权利要求1所述的基因芯片，所述探针的5′端还包含一段氨基修饰的16聚的聚脱氧胸苷酸。
4.HLA-B51基因亚型检测芯片的应用，其特征在于非以诊断为目的检测HLA-B51基因亚型。
5.如权利要求4所述的HLA-B51基因亚型检测芯片的应用，其特征在于检测HLA-B51基因亚型包括以下步骤(1)制备染色体DNA；(2)用聚合酶链反应(PCR)方法扩增HLA-B基因中包含Loci1C/T，Loci2T/G，Loci3CTG/CGG/GAC，Loci4CTTGG/TCATC/CCCTC，Loci5T/C，Loci6A/T的基因片段；(3)将所得扩增产物变性后与含有检测探针的杂交缓冲液混合；(4)将上述混合液与基因芯片杂交；(5)检测基因芯片的杂交信号。
6.如权利要求5所述的HLA-B51基因亚型检测芯片的应用，其特征在于步骤(3)中所用的检测探针，是选自如下序列的包含所述Loci0A的18-20聚5‘端带有标记基团的寡核苷酸SEQ ID NO15tacgcctacgacggcaaAgattacatcgccct。
7.如权利要求6所述的HLA-B51基因亚型检测芯片的应用，其特征在于，所述Loci0A位于所述检测探针的中部。
8.如权利要求5所述的HLA-B51基因亚型检测芯片的应用，其特征在于，步骤(5)中检测杂交信号的方法选自碱性磷酸酶催化的四氮唑蓝显色反应，辣根过氧化物酶催化的5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺盐显色反应或辣根过氧化物酶催化的四甲基联苯胺显色反应。
9.一种用于检测HLA-B51基因型的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的基因芯片和应用方法。
全文摘要
一种HLA－B51基因亚型的基因芯片及其应用，包含该基因芯片的试剂盒和使用该芯片或试剂盒检测HLA－B51基因亚型的方法。HLA－B51基因亚型检测芯片，包括固相支持物和固定在所述固相支持物上的寡核苷酸探针，寡核苷酸探针包含HLA－B－Exon3－Loci1C/T，HLA－B－Exon3－Loci2T/G，HLA－B－Exon3－Loci3 CTG/CGG/GAC，HLA－B－Exon3－Loci4CTTGG/TCATC/CCCTC，HLA－B－Exon2－Loci5T/C，HLA－B－Exon3－Loci6A/T在内的17－26个连续核苷酸。本发明的基因芯片和应用方法可用于检测白塞病的易感基因，为预测白塞病发生危险提供必要信息。
文档编号C12Q1/68GK1563423SQ200410023799
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月8日 优先权日2004年4月8日
发明者汪运山, 朱彬, 孙悦 申请人:济南市中心医院