专利名称：利用三环葵烷-9-基-二硫代碳酸酯钾盐诱导骨髓基质细胞向神经元分化的方法
技术领域：
本发明涉及一种诱导细胞分化的方法，尤其涉及一种利用三环[5.2.1.02，6]葵烷-9-基-二硫代碳酸酯钾盐(D609)诱导骨髓基质细胞向神经元分化的方法。
背景技术：
D609(tricyclodecane-9-yl-xanthogenate)是磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C(PC-PLC)的特异性抑制剂，它能专一高效地抑制PC-PLC的活性而不影响磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)、磷脂酶D(PLD)的活性，具有抗病毒，抗癌，抗炎和抗凋亡等一系列的生物学功能和活性，因而成为研究PC-PLC功能的良好工具。最近的研究表明D609作为黄酸盐的衍生物，是一种强的电介质，在溶液中很容易解离成为黄酸盐阳离子和碱阴离子，这种黄酸盐阳离子和质子化了的黄酸包括一个自由的硫醇基部分，这部分基团具有高度还原性，这一点暗示了D609可以作为潜在的抗氧化剂行使功能。实验也表明，D609是一种潜在的抗氧化剂，它可以抑制由离子辐射(IR)诱导产生的细胞氧压，并能使受IR诱导濒临致死的实验动物免于死亡。
但是，在现有的诸项对D609的研究报道中，多是把D609作为一种研究PC-PLC的工具或者作为一种抗氧化剂进行实用，而利用D609作为诱导剂诱导细胞分化，特别是诱导骨髓基质细胞专一定向分化成神经元的研究，经权威机构检索查新，目前国内外尚未见报道。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，创立一种利用D609作为诱导剂诱导细胞分化的新用途，提出一种利用D609诱导骨髓基质细胞向神经元分化的新方法。
本发明的利用D609诱导骨髓基质细胞向神经元分化的方法，由以下步骤组成1)选取处于对数生长期的骨髓基质细胞，接种于培养板各孔中的盖玻片上，置于饱和湿度、5％的CO2、37℃培养箱内，在含有20％小牛血清的M199培养液中培养，至细胞生长达到盖玻片面积的80％～90％；2)用无血清培养液将上述培养板各孔中的细胞清洗1～2次，然后对培养板各孔中的细胞进行分组，确定对照组和诱导实验组，每组不少于4孔；3)对照组的骨髓基质细胞培养液采用去除血清的M199培养基，诱导实验组的细胞培养液除使用对照组培养液外还添加了浓度为2mg/L～12mg/L的D609；4)分别调整上述对照组和诱导实验组骨髓基质细胞的pH值，使pH为7.2，置于饱和湿度、5％的CO2、37℃培养箱培养20～30分钟；5)将步骤4)中对照组和诱导实验组骨髓基质细胞pH调为7.4-7.8，置于饱和湿度、5％的CO2培养箱37℃培养，诱导2～8小时，检测诱导结果。
上述培养板为24孔培养板。
上述诱导实验组的培养液中，各孔添加D609的浓度依次为2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L、12mg/L。
上述诱导实验组的培养液中，各孔添加D609的浓度为4mg/L、6mg/L、8mg/L。
上述诱导实验组的培养液中，各孔添加D609的浓度为6mg/L。
上述步骤5)中对照组和诱导实验组骨髓基质细胞pH调为7.4-7.5，培养诱导时间为3～5小时。
上述步骤5)中对照组和诱导实验组经培养诱导完毕的细胞，还可再分别去除其培养液，用无血清的M199培养液冲洗1～2次，向对照组加入含有20μg/L碱性成纤维生长因子(bFGF)的无血清M199培养液，向诱导实验组加入含有20μg/L bFGF和2mg/L～12mg/L浓度D609的无血清M199培养液，pH调为7.4-7.5，置于饱和湿度、5％的CO2培养箱37℃培养，维持诱导3天，检测诱导结果。
其中，诱导实验组中加入的D609浓度为4mg/L～8mg/L。
其中，诱导实验组中加入的D609浓度为6mg/L。
为了更好地理解本发明的实质，下面以具体的诱导骨髓基质细胞分化实验，来说明D609作为诱导剂诱导细胞分化的新用途以及本发明实验方法的有效性。
骨髓基质细胞的制备无菌条件下，用12号骨髓穿刺针自健康成人髋骨粗隆部穿刺得骨髓2mL，混合于加有肝素钠的5ml生理盐水中，反复抽吸吹打制成单细胞悬液后，防止骨髓凝固，取骨髓液3～4ml缓慢注入预先加入4ml淋巴细胞分离液的试管内，进行密度离心，2500r/min离心30min，去除上层脂肪及部分上清，吸取中间的单核细胞界面层，用无血清的M199(Hyclone)洗涤、1000r/min离心5min，去上清，重复洗涤1次。加入4mL含有20％小牛血清(Hyclone)的M199(Hyclone)培养液中，种于塑料培养皿中，调整细胞数为105个/mL，置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养。3天后开始换液，清除未贴壁的细胞，继续培养每隔3-4天更换一次培养液。待细胞铺满培养皿底面后， 用含有0.02％EDTA和0.05％的胰酶的消化液进行消化、传代培养。选取生长状态良好的、且处于对数生长期的骨髓基质细胞备用。
选取上述处于对数生长期的骨髓基质细胞，接种于24孔培养板各孔中的盖玻片上，置于饱和湿度、5％的CO2、37℃培养箱内，在含有20％小牛血清的M199培养液中培养，至细胞生长达到盖玻片面积的80％～90％；用无血清培养液将上述培养板各孔中的细胞清洗1次，然后对培养板各孔中的细胞进行分组，确定对照组和诱导实验组，每组不少于4孔；对照组的骨髓基质细胞培养液采用去除血清的M199培养基，诱导实验组的细胞培养液除使用对照组培养液外，各孔还依次添加了浓度为2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L、12mg/L的D609；分别调整上述对照组和诱导实验组骨髓基质细胞的pH值，使pH为7.2，置于饱和湿度、5％的CO2、37℃培养箱培养20～30分钟；之后，将对照组和诱导实验组骨髓基质细胞pH调为7.4，置于饱和湿度、5％的CO2培养箱37℃培养，诱导2～8小时，检测诱导结果。
对于上述对照组和诱导实验组经培养诱导完毕的细胞，还可再分别去除其培养液，用无血清的M199培养液冲洗2次，向对照组加入含有20μg/L bFGF的无血清M199培养液，向诱导实验组加入含有20μg/L bFGF和各孔依次浓度为4mg/L、6mg/L、8mg/L的D609的无血清M199培养液，pH调为7.4，置于饱和湿度、5％的CO2培养箱37℃培养，维持诱导3天，检测诱导结果。
上述同样实验重复进行3次，综合分析、统计和汇总结果。
倒置相差显微镜观察细胞形态学变化对照组骨髓基质细胞在形态学上并没有发生改变，基本保持原来的形态；而D609处理组在改用含D609的诱导液培养后2小时即可见细胞形态开始发生变化；3小时，细胞胞体变圆，变透亮，并有突起长出，随后一些细胞突起变多、变长，突起数目由开始的2个双极状，发展到3～5个不等的多级状，有些细胞间突起互相连接，形成神经网络样结构，表现出神经细胞样的形态。(见图1)免疫细胞化学染色采用间接免疫荧光法，取对照组和诱导实验组细胞，经纯丙酮固定后，使用SABC-AP法鉴定细胞成分(一抗分别为兔抗人神经元特异性烯醇化酶NSE、兔抗人胶质纤维酸性蛋白GFAP)，二抗为生物素化羊抗兔IgG，具体操作方法按试剂盒内说明书进行)，以确定D609诱导分化的细胞是否为神经元和神经胶质细胞，5-溴-4-氟-3-吲哚磷酸/氮蓝四唑(BCIP/NBT)显色法显色，着棕色的细胞判断为阳性。阳性对照为星形细胞瘤和神经元肿瘤(公司提供)，阴性对照孔是将-抗换用磷酸缓冲液(PBS)。结果发现，对照组细胞NSE和GFAP表达为阴性，而在D609处理组中，NSE有大量表达，而GFAP表达结果呈阴性(见图2)。NSE是神经元的特异性标志物，GFAP是神经胶质细胞的特异性标志物。说明骨髓基质细胞可以被D609诱导分化成神经元，而不是神经胶质细胞。
统计处理相差显微镜下观察照相，每孔采用双人双盲法随机记数至少100个细胞，计算阳性细胞百分比例。结果我们发现约有85％的细胞NSE染色呈阳性，说明有大约85％的骨髓基质细胞分化为神经元细胞，分化率很高。
D609处理细胞随时间NSE表达的阳性细胞率时间/h 分化率/％0 03 4.8±2.06 85.6±1.29 86.3±2.172 83.8±1.4蛋白质印迹法(Western Blot)收集各组细胞，用冷的磷酸缓冲液(PBS)清洗3次，在细胞裂解液[50mmol/L 乙二胺四乙酸，2％十二烷基硫酸钠(SDS)，5mmol/L二硫苏糖醇，0.5mmol/L苯甲基磺酰氟化物]100μl中裂解15min后，沸水浴变性5～10min，15000r/min离心20min，收集上清蛋白质样本，测定蛋白质含量。取50～100μg蛋白在15％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后将蛋白质在电转移电泳槽中转至硝酸纤维素膜。取出膜后用正常山羊血清室温下封闭3小时，然后置于杂交袋中，加入一抗(GFAP、NSE、神经巢蛋白nestin)，4℃孵育过夜，羊抗小鼠-碱性磷酸酶(1∶1000)，37℃孵育60～120分钟，BCIP/NBT显色，记录结果。诱导前NSE、nestin均无表达，而诱导后6小时nestin有表达，诱导3天后，nestin表达消失，NSE表达增强；GFAP诱导前后无表达。说明在整个诱导分化过程中，各种标记物表达顺序与神经细胞发育分化过程相同，即先表达神经干细胞标记物nestin；然后出现早期的神经标记物NSE，而在我们的实验中，GFAP始终没有表达，说明D609能够专一性的诱导骨髓基质细胞分化为神经元，并不向神经胶质细胞分化。
逆转录PCR(RT-PCR)使用Trizol试剂(GIBCOCRL公司)进行诱导实验组细胞总RNA抽提，RT-PCR扩增反应条件参照试剂盒操作说明，反应体系为50μl，逆转录与PCR一步完成，扩增产物用15％琼脂糖凝胶电泳后，使用紫外透射仪进行观察。人nestin引物其上游序列为5’-CAGGCTTCTCTTGGCTTTCTGG-3’，下游序列为5’-TGGTGAGGGTTGAGGTTTGT-3’。结果发现D609诱导组诱导6小时，nestin出现表达，诱导3天时，表达消失。这一结果与上述实验结果相一致，说明由骨髓基质细胞分化的细胞先表达神经干细胞标记物nestin，具有神经细胞的特征。
在其分化后的第三天，我们应用膜片钳技术初步检测了分化的神经元的电生理特征，这一结论得到了进一步的证明。
膜片钳技术应用全细胞膜片钳技术记录单细胞离子电流。所用微电极用两步法拉制而成，制成的微电极充灌电极液后电阻在2～3MΩ之间。为将准备好的微电极连于膜片钳仪的探头上。将含有分化的神经元的盖玻片置于浴槽中，选择那些具有锥体状胞体及明显轴突和树突、细胞体积较大的细胞进行记录。经免疫组化证实这些细胞均为NSE阳性的神经元。用正常台氏液以3ml/min恒速灌流冲洗细胞表面，形成高阻封接(＞10GΩ)后，用脉冲式抽吸打破细胞膜，形成全细胞构型，用电压钳和电流钳模式进行刺激，电极液和细胞外液之间的液接电位10～11mV，实验室温19～22℃，信号输入经过1kHz的滤波，数据存于计算机，实验过程由计算机软件pCLAMP6.04控制，数—模转换器完成刺激信号的产生、反馈信号的采集以及数据分析。
我们发现骨髓基质细胞分化的神经元的电生理特征得到了初步证实，可诱发出动作电位，并可记录到外向的钾电流。这些说明骨髓基质细胞分化的神经元具有初步的电生理特征，进一步证明了诱导后的分化细胞是神经细胞。
通过上述实验方法和综合分析、统计结果表明，NSE蛋白的表达暗示了由D609诱导的分化细胞具有神经元的特征。而且，本实验方法还发现D609诱导的细胞基本不表达GFAP等胶质细胞标记物，说明D609诱导具有定向性，主要朝神经元方向分化，而不是向神经胶质细胞分化。并且我们获得了很高的分化率，NSE阳性率可以达到85％，这是别的诱导实验所不能达到的。
本发明使用的这种诱导方法，在诱导细胞分化方面具有重要意义，本发明创立的利用D609作为诱导剂诱导细胞分化的新用途，为干细胞定向诱导分化和其临床应用提供了新的理论和实验依据。
图1是相差显微镜下所示骨髓基质细胞的形态学变化。
其中A为去除血清的对照组，B为用含有6mg/L浓度的D609处理的骨髓基质细胞组。
图2是用D609处理的骨髓基质细胞的NSE和GFAP的表达其中A为骨髓基质细胞的NSE表达阳性，B为骨髓基质细胞的GFAP表达阴性。
具体实施方式
实施例1无菌条件下，用12号骨髓穿刺针自健康成人髋骨粗隆部穿刺得骨髓2mL，混合于加有肝素钠的5ml生理盐水中，反复抽吸吹打制成单细胞悬液后，防止骨髓凝固，取骨髓液3～4ml缓慢注入预先加入4ml淋巴细胞分离液的试管内，进行密度离心，2500r/min离心30min，去除上层脂肪及部分上清，吸取中间的单核细胞界面层，用无血清的M199(Hyclone)洗涤、1000r/min离心5min，去上清，重复洗涤1次。加入4mL含有20％小牛血清(Hyclone)的M199(Hyclone)培养液中，种于塑料培养皿中，待细胞铺满培养皿底面后，进行传代培养。选取生长状态良好的、且处于对数生长期的骨髓基质细胞备用。将骨髓基质细胞种于24孔培养板各孔中的盖玻片上，待细胞生长达到盖玻片面积的80％～90％后，进行诱导实验。细胞经无血清培养液清洗一次后进行分组，分为对照组、4mg/L(培养液)D609组、每组6孔；对照组培养液使用去除血清的M199培养基，D609处理组细胞加入了含4mg/LD609的无血清M199培养液，分别调整上述对照组和诱导实验组骨髓基质细胞的pH值，使pH为7.2，置于饱和湿度、5％的CO2、37℃培养箱培养30分钟；之后，将对照组和诱导实验组骨髓基质细胞pH调为7.4，置于饱和湿度、5％的CO2培养箱37℃培养，诱导4.5小时，每隔1.5小时，在倒置显微镜下观察一次细胞的变化，然后用移液管分别吸去对照组和D609处理组的培养液，用无血清的M199培养液清洗一次，对照组加入含有20μg/L bFGF的无血清的M199培养液，D609处理组加入20μg/L bFGF和4mg/L D609的无血清M199培养液，维持诱导3天。采用免疫细胞化学染色的方法检测神经元的特异性标记物NSE和神经胶质细胞的特异性标记物GFAP的表达情况，结果表明NSE的表达呈阳性，而GFAP的表达呈阴性。并计算分化为神经元的百分率为80％。说明4mg/L D609可以诱导骨髓基质细胞分化为神经元，而且，本研究发现D609诱导的细胞基本不表达GFAP等胶质细胞标记物，说明D609诱导具有定向性，主要朝神经元方向分化，而不是胶质细胞。
实施例2将骨髓基质细胞种于24孔的细胞培养板，待细胞生长达到80％～90％融合后，进行诱导实验。细胞经无血清培养液清洗2次后进行分组，分为对照组、6mg/L(培养液)D609组、每组6孔；对照组培养液使用去除血清的M199培养基，D609处理组细胞加入了含6mg/L D609的无血清M199培养液，分别调整上述对照组和诱导实验组骨髓基质细胞的pH值，使pH为7.2，置于饱和湿度、5％的CO2、37℃培养箱培养20分钟；之后，将对照组和诱导实验组骨髓基质细胞pH调为7.4，置于饱和湿度、5％的CO2培养箱37℃培养，诱导6小时，在倒置显微镜下每2小时观察一次细胞的变化，然后用移液管分别吸去对照组和D609处理组的培养液，用无血清的M199培养液清洗一次，对照组加入含有20μg/L bFGF的无血清M199培养液，D609处理组加入20μg/L bFGF和6mg/L D609的无血清M199培养液，维持诱导3天。然后使用蛋白质印迹法检测了GFAP，NSE，nestin的表达，结果并没有发现GFAP有表达，而NSE、nestin都有表达。使用逆转录PCR的方法检测了nestin的mRNA的表达，实验结果发现nestin mRNA出现表达。说明通过该种实验方法，D609能诱导骨髓基质细胞向神经元分化，并且其分化率很高可以达到85％，并维持3天的状态。
实施例3将骨髓基质细胞种于24孔的细胞培养板各孔中的盖玻片上，待细胞生长达到盖玻片面积的80％～90％后，进行诱导实验。细胞经无血清培养液清洗一次后进行分组，分为对照组、8mg/L(培养液)D609组、每组6孔；对照组培养液使用去除血清的M199培养基，D609处理组细胞加入了含8mg/L D609的无血清M199培养液，分别调整上述对照组和诱导实验组骨髓基质细胞的pH值，使pH为7.2，置于饱和湿度、5％的CO2、37℃培养箱培养25分钟；之后，将对照组和诱导实验组骨髓基质细胞pH调为7.4，置于饱和湿度、5％的CO2培养箱37℃培养，诱导8小时，在倒置显微镜下每2小时观察一次细胞的变化。然后，取出24孔培养板各孔中长满细胞的盖玻片，用纯丙酮固定，0.01MPBS彻底冲洗后，采用免疫细胞化学染色的方法检测神经元的特异性标记物NSE和神经胶质细胞的特异性标记物GFAP的表达情况，结果表明NSE的表达呈阳性，而GFAP的表达呈阴性。说明D609可以诱导骨髓基质细胞向神经元分化。同时，应用全细胞膜片钳技术记录单细胞离子电流，初步检测了分化的神经元的电生理特征，选择那些具有锥体状胞体及明显轴突和树突、细胞体积较大的细胞进行记录，发现骨髓基质细胞分化的神经元细胞，可被诱发出动作电位，并可记录到外向的钾电流。这些说明骨髓基质细胞分化的神经元具有初步的电生理特征，并且，可进一步证明诱导后的分化细胞是神经细胞。
权利要求
1.一种利用D609诱导骨髓基质细胞向神经元分化的方法，由以下步骤组成1)选取处于对数生长期的骨髓基质细胞，接种于培养板各孔中的盖玻片上，置于饱和湿度、5％的CO2、37℃培养箱内，在含有20％小牛血清的M199培养液中培养，至细胞生长达到盖玻片面积的80％～90％；2)用无血清培养液将上述培养板各孔中的细胞清洗1～2次，然后对培养板各孔中的细胞进行分组，确定对照组和诱导实验组，每组不少于4孔；3)对照组的骨髓基质细胞培养液采用去除血清的M199培养基，诱导实验组的细胞培养液除使用对照组培养液外还添加了浓度为2mg/L～12mg/L的D609；4)分别调整上述对照组和诱导实验组骨髓基质细胞的pH值，使pH为7.2，置于饱和湿度、5％的CO2、37℃培养箱培养20～30分钟；5)将步骤4)中对照组和诱导实验组骨髓基质细胞pH调为7.4-7.8，置于饱和湿度、5％的CO2培养箱37℃培养，诱导2～8小时，检测诱导结果。
2.如权利要求1所述的利用D609诱导骨髓基质细胞向神经元分化的方法，其特征在于，所述培养板为24孔培养板。
3.如权利要求1所述的利用D609诱导骨髓基质细胞向神经元分化的方法，其特征在于，所述诱导实验组的培养液中，各孔添加D609的浓度依次为2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L、12mg/L。
4.如权利要求3所述的利用D609诱导骨髓基质细胞向神经元分化的方法，其特征在于，所述诱导实验组的培养液中，各孔添加D609的浓度为4mg/L、6mg/L、8mg/L。
5.如权利要求4所述的利用D609诱导骨髓基质细胞向神经元分化的方法，其特征在于，所述诱导实验组的培养液中，各孔添加D609的浓度为6mg/L。
6.如权利要求1所述的利用D609诱导骨髓基质细胞向神经元分化的方法，其特征在于，所述步骤5)中，对照组和诱导实验组骨髓基质细胞pH调为7.4-7.5，培养诱导时间为3～5小时。
7.如权利要求1所述的利用D609诱导骨髓基质细胞向神经元分化的方法，其特征在于，所述步骤5)中，对照组和诱导实验组经培养诱导完毕的细胞，还可再分别去除其培养液，用无血清的M199培养液冲洗1～2次，向对照组加入含有20μg/L bFGF的无血清M199培养液，向诱导实验组加入含有20μg/L bFGF和2mg/L～12mg/L浓度D609的无血清M199培养液，pH调为7.4-7.5，置于饱和湿度、5％的CO2培养箱37℃培养，维持诱导3天，检测诱导结果。
8.如权利要求7所述的利用D609诱导骨髓基质细胞向神经元分化的方法，其特征在于，所述诱导实验组中加入的D609浓度为4mg/L～8mg/L。
9.如权利要求8所述的利用D609诱导骨髓基质细胞向神经元分化的方法，其特征在于，所述诱导实验组中加入的D609浓度为6mg/L。
全文摘要
本发明公开了一种利用D609诱导骨髓基质细胞向神经元分化的方法，该方法由骨髓基质细胞接种培养；无血清培养液清洗；对照组和诱导实验组骨髓基质细胞在pH为7.2条件下预诱导；在浓度为2mg/L～12mg/L的D609，pH 7.4－7.8，饱和湿度、5％的CO
文档编号C12N5/08GK1560237SQ20041002349
公开日2005年1月5日 申请日期2004年2月25日 优先权日2004年2月25日
发明者苗俊英, 张尚立, 王楠 申请人:山东大学