专利名称：一种原核表达载体pASK－75－EX的制作方法
技术领域：
本发明涉及原核表达载体，具体地说是采用设计并合成的载体克隆表达区基因构建成一种新型原核表达载体pASK-75-EX。
背景技术：
载体pASK-75是一种在大肠杆菌中表达外源蛋白的高效表达载体，其严紧型控制的启动子tetA保证了在诱导物缺失的情况下对外源基因的表达抑制，适合表达对宿主菌有细胞毒性的外源蛋白，微量的四环素即可充分诱导tetA启动子的启动，使其具有较高的表达效率。另外，tetA启动子表达系统不受任何其它细胞调节机制的控制，因此对表达宿主菌的选择没有限制。但是pASK-75的多克隆位点缺乏常见的高活力的限制性内切酶位点，且其下游融合的Strep-tag纯化标签需要极高的纯化成本，限制了pASK-75的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种应用方便、廉价的原核表达载体pASK-75-EX。
为实现上述目的，本发明对pASK-75载体进行改造，保留了tetA启动子序列和OmpA信号肽序列，新添加了含常用限制性内切酶的多克隆位点，并以His-tag标签取代Strep-tag，构建成新型表达载体pASK-75-EX。与原载体相比，pASK-75-EX使外源基因的克隆和外源蛋白的纯化检测更方便廉价；本发明设计并合成载体克隆表达区基因，包括StuI、NcoI、ShpI、EcoRI、NotI、BglII、XhoI和PstI限制性内切酶位点，His-tag纯化鉴定标签，其具有序列表SEQ ID NO1中碱基序列；设计并合成的载体克隆表达区基因碱基序列如下CCTGGCCCAG CCGGCCCATG GCATGCGAAT TCGCGGCCGC 40AGATCTGCTC GAGCTGCAGC ATCATCATCA TCATCATA78利用限制性核酸内切酶StuI和Hind III的酶切连接技术，将合成的载体克隆表达区基因整合入表达载体pASK-75克隆表达区(替代原pASK-75表达载体201位至292位的碱基序列)，构建成新型表达载体pASK-75-EX。
本发明具有如下优点1.本发明构建的新型表达载体pASK-75-EX具有含多种常用限制性内切酶组成的多克隆位点，大大方便了外源基因的克隆。
2.本发明构建的新型表达载体pASK-75-EX以His-tag纯化鉴定标签替换原载体的Strep-tag纯化鉴定标签，简化了对表达的外源蛋白纯化和鉴定的操作，并显著降低了纯化和鉴定的成本。
3.本发明保留了原载体的tetA启动子序列和OmpA信号肽序列，保持了新构建的表达载体pASK-75-EX对外源基因的严紧型表达控制。
4.应用实施例制备的新型表达载体，方便廉价的实现了对单链抗体蛋白(scFv-ML)和融合免疫毒素蛋白(B-L-SEC2)的表达、纯化和生物学鉴定。
图1为pASK-75-EX多克隆位点的单酶切验证以1.0％琼脂糖凝胶电泳分析结果图，其中1.未经酶切的原始pASK75质粒，2.未经酶切的pASK75-EX质粒，3-7.分别经SphI，EcoRI，BglII，XhoI，PstI单酶切后的pASK75-EX质粒，4.DL2000DNA分子量标准图2为利用引入的His-tag将表达的单链抗体ML蛋白经Ni亲和层析柱纯化后的结果。
图3为利用引入的His-tag将表达的融合免疫毒素B-L-SEC2蛋白经Ni亲和层析柱纯化后的结果。
图4为利用引入的His-tag将表达的单链抗体ML蛋白经蛋白免疫印记法鉴定的结果。
图5为利用引入的His-tag将表达的融合免疫毒素B-L-SEC2蛋白经蛋白免疫印记法鉴定的结果。
具体实施例方式
实施例1载体克隆表达区基因的制备，其具有序列表SEQ ID NO1中所示的碱基序列ACCATCGAATGGCCAGATGATTAATTCCTAATTTTTGTTGACACTCTATCATTGATAGAGTTATTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAATGAATAGTTCGACAAAAATCTAGATAACGAGGGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCTGGCCCAGCCGGCCCATGGCATGCGAATTCGCGGCCGCAGATCTGCTCGAGCTGCAGCATCATCATCATCATCATAAGCTTGACCTGTGAAGTGAAAAATGGCGCACATTGTGCGACATTTTTTTTGTCTGCCGTTTACCGCTACTGCGTCACGGATCTCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACG
CCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTGATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGCTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAGGAATTAATGATGTCTCGTTTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAGCGCATTAGAGCTGCTTAATGAGGTCGGAATCGAAGGTTTAACAACCCGTAAACTCGCCCAGAAGCTAGGTGTAGAGCAGCCTACATTGTATTGGCATGTAAAAAATAAGCGGGCTTTGCTCGACGCCTTAGCCATTGAGATGTTAGATAGGCACCATACTCACTTTTGCCCTTTAGAAGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAACGCTAAAAGTTTTAGATGTGCTTTACTAAGTCATCGCGATGGAGCAAAAGTACATTTAGGTACACGGCCTACAGAAAAACAGTATGAAACTCTCGAAAATCAATTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTTTCACTAGAGAATGCATTATATGCACTCAGCGCAGTGGGGCATTTTACTTTAGGTTGCGTATTGGAAGATCAAGAGCATCAAGTCGCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTACTACTGATAGTATGCCGCCATTATTACGACAAGCTATCGAATTATTTGATCACCAAGGTGCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGCCTTGAATTGATCATATGCGGATTAGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGGTCTTAAAAGCAGCATAACCTTTTTCCGTGATGGTAACTTCACTAGTTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGACCCGAC以上载体的序列是利用限制性核酸内切酶StuI和Hind III的酶切连接技术，将合成的载体克隆表达区基因(以上序列中带下划线部分的碱基序列片段)整合入表达载体pASK-75克隆表达区(替代原pASK-75表达载体201位至292位的碱基序列，替换前序列片段为CCTGAGACCAGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCCTCGAGGTCGACCTGCAGGCAGCGCTTGGCGTCACCCGCAGTTCGGTGGTTAATA)，构建成新型表达载体pASK-75-EX。
(1)SEQ ID NO.1的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度3252碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型DNA
(c)假设否(d)反义否(e)最初来源载体pASK-75(2)载体克隆表达区基因的制备1)载体克隆表达区基因的设计合成根据构建新型表达载体的预期目的，设计并合成两条寡聚核苷酸链正向链p-F5’-CC TGG CCC AGC CGG CCC ATG GCA TGC GAATTC GCG GCC GCA GAT CTG CTC GAG CTG CAG CAT CAT CAT CATCAT CATA-3’；反向链p-R5’-A GCT ATG ATG ATG ATG ATG ATG GTC CAG CTCGAG CAG ATC TGC GGC CGC GAA TTC GCA TGC CAT GGG CCG GCTGGG CCA GG-3’2)寡聚核苷酸链的退火10×退火杂交缓冲液(SSC)成分1.5mol/L NaCl0.3M柠檬酸三钠·2H2O，以HCl调pH至7.0退火反应体系10×SSC buffer 1μl正反寡聚核苷酸链 各5pmol无菌超纯水 补齐体积至10μl退火反应条件94℃10min；0℃10min；72℃20min；实施例2新型表达载体pASK-75-EX的构建(1)pASK-75载体的双酶切将德国Biometra公司pASK-75载体质粒DNA经限制性核酸内切酶StuI和HindIII充分消化，消化产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，胶回收纯化3200bp大片段；(2)酶切产物的连接及转化将退火的寡聚核苷酸链和pASK-75载体大片段以5∶1的摩尔比例混合，并以T4DNA连接酶16℃连接过夜，构建成表达载体pASK-75-EX。连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞(转化操作按F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40)，以氨卞青霉素抗性筛选转化子。
(3)表达载体pASK-75-EX的验证将挑选的阳性转化子扩培，提取质粒DNA(质粒DNA提取方法按J.萨姆布鲁克，E.F.费里奇，T.曼尼阿蒂斯《分子克隆实验指南》美国纽约冷泉港出版社2001年第三版P27-30)，分别经仅存在于设计的载体克隆表达区的限制性内切酶SphI，EcoRI，BglII，XhoI，PstI单酶切鉴定(附图1)，并以Sanger双脱氧末端终止法测序证实。
实施例3新型表达载体pASK-75-EX的实际应用及效果评价(1)将外源基因片段连接入新型表达载体pASK-75-EX将pASK-75-EX质粒DNA和含有单链抗体ML基因的pET-28a-ml质粒DNA分别用Nco I、Not I双酶切，经1.0％琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒回收770bp的ml片段及pASK-75-EX质粒3200bp片段，以T4 DNA连接酶16℃连接过夜，构建单链抗体蛋白表达载体pASK-75-EX-ml。连接产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞。以氨卞青霉素抗性筛选转化子，挑选重组克隆扩培，提取质粒DNA，经Nco I、Not I双酶切鉴定正确重组克隆。
同样方法以NcoI、XhoI双酶切pASK-75-EX质粒和含有融合免疫毒素基因的pET-28a-b-l-sec2质粒DNA，构建融合免疫毒素蛋白表达载体pASK-75-EX-b-l-sec2。
(2)外源蛋白的表达分别接种转化了重组质粒pASK-75-EX-ml和pASK75-EX-b-l-sec2的BL21(DE3)单菌落于含100μg/ml氨卞青霉素的液体LB中37℃过夜，次日按1∶50转接，37℃培养至OD6000.8，加入终浓度为0.2ug/ml的四环素37℃诱导6h。
(3)利用新引入的His-tag标签纯化外源蛋白离心收集诱导表达后的菌体，每100ml原培养物的菌体重悬于10ml 20mmol/L Tris-HCl pH7.5的缓冲液，加0.025％溶菌酶于37℃裂解细胞，于0℃超声破碎直至菌液变的清亮，12000g离心20min收集上清，上样于平衡缓冲液平衡好的Ni亲和层析柱(购自美国Novagen公司)，以平衡结合缓冲液(5mmol/L咪唑，0.5MNaCl，20mmol/L Tris-HCl pH7.5)平衡至基线，用含100mmol/L咪唑的平衡结合缓冲液洗脱目的蛋白，并以SDS-PAGE分析纯度(附图2，3)。(SDS-PAGE具体操作方法按郭尧君《蛋白质电泳实验技术》科学出版社1999年第一版P132)。单链抗体ML蛋白和融合免疫毒素蛋白B-L-SEC2的分子量分别为35kD和60kD。
(4)利用新引入的His-tag标签以蛋白免疫印记法鉴定外源蛋白将纯化后的单链抗体ML蛋白和融合免疫毒素蛋白B-L-SEC2以SDS-PAGE分离，半干转膜仪转至硝酸纤维膜，2％脱脂牛奶封闭，以兔抗His-tag抗体、碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体依次处理，NBT/BCIP显色试剂盒显色(附图4，5)。(所用缓冲液和具体操作方法按汪家政，范明《蛋白质技术手册》科学出版社2002第一版P166)
SEQUENCE LISTING<110>中国科学院沈阳应用生态研究所<120>一种原核表达载体pASK-75-EX<130>
<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3252<212>DNA<213>载体pASK-75<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3252)<223>
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1.一种原核表达载体pASK-75-EX，其特征在于具有序列表SEQ IDNO1中碱基序列。
全文摘要
本发明涉及原核表达载体，采用设计并合成的载体克隆表达区基因构建成一种新型原核表达载体pASK－75－EX，其具有序列表SEQ ID NO1中碱基序列；其具有常见的限制性核酸内切酶组成的多克隆位点和纯化检测标签。结果表明pASK－75－EX可高效表达外源蛋白scFv－ML与B－L－SEC2，且其表达产物由于载体中新添加的纯化检测标签而可被方便廉价的纯化和检测。
文档编号C12N15/74GK1840666SQ200510046140
公开日2006年10月4日 申请日期2005年3月30日 优先权日2005年3月30日
发明者徐明恺, 张惠文, 张成刚 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所