专利名称：：调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物在精子染色或分选方法中的用途的制作方法调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物在精子染色或分选方法中的用途发明领域本发明一般地涉及分选染色精子细胞的方法。更具体而言，本发明涉及分选精子细胞的方法，其中形成含有调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物的精子细胞悬浮液。发明背景通过人工授精(AI)使动物受精以及体外受精后的胚胎移植已经是一项成熟的技术。在家畜产业中，能够对繁殖结果施加影响而使其后代具有一种或多种期望特征，有明显的优势。例如，乳制品产业中如能预先选择后代有利于雌性而保证奶牛的产量，则会带来经济效益。将精子分离为富集的带有X和Y染色体的细胞群，即所谓的性别富集精液或性别富集精子，便是达到后代预选目的的方法之一。为得到性别富集精液，必须将精子细胞以染料染色，然后分选为带有X和Y染色体的细胞。染色和分选过程的每一步对于精子细胞而言都是应激，会导致精子细胞的存活力或运动性，特别是前向性运动性降低。对精子细胞尤其具有压力的是对之染色的过程，该过程中需要将细胞与染料接触一定时间，而且通常是在典型精子细胞环境所不常有的温度和pH条件下。发明概述本发明的多方面之一涉及精子悬浮液，所述精子悬浮液可用于如将精子分选为带X或Y染色体的富集精子群的方法。因此，简言之，本发明涉及这样的染色混合物，其含有活精子、调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物、以及DNA选择性染料，所述染色混合物中组合物若为丙酮酸盐，则其浓度大于50nM。本发明还涉及染色精子细胞的方法，所述方法包括形成这样的染色混合物，其含有完整活精子细胞、调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物、以及DNA选择性染料，所述染色混合物中组合物若为丙酮酸盐，则其浓度大于50nM。附图简述图1以图表显示了实施例1中进行研究的结果，其中测量了于41°CTCA緩沖液或含有10mM丙酮酸盐的TCA緩沖液中，用400Hoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。图2以图表显示了实施例2中进行研究的结果，其中测量了于41°CTCA緩冲液或含有10fiM维生素K的TCA緩冲液中，用400pMHoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。图3以图表显示了实施例3中进行研究的结果，其中测量了于41°CTCA緩冲液或含有100nM维生素K的TCA緩冲液中，用400jiMHoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。图4以图表显示了实施例4中进行研究的结果，其中测量了于41。CTCA緩沖液或含有1mM硫辛酸的TCA緩沖液中，用400Hoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。图5以图表显示了实施例5中进行研究的结果，其中测量了于28°CTCA緩冲液或含有10mM丙酮酸盐的TCA緩冲液中，用600Hoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。图6以图表显示了实施例6中进行研究的结果，其中测量了于28°CTCA緩冲液或含有100维生素K的TCA緩冲液中，用600Hoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。图7以图表显示了实施例7中进行研究的结果，其中测量了于28°CTCA緩冲液或含有1mM硫辛酸的TCA緩冲液中，用600jiMHoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。图8以图表显示了实施例8中进行研究的结果，其中测量了于28。CTCA緩冲液、含有2.5mM丙酮酸盐的TCA緩冲液、含有10mM丙酮酸盐的TCA緩冲液、含有25mM丙酮酸盐的TCA緩冲液以及含有50mM丙酮酸盐的TCA緩沖液中，用600nMHoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。图9以图表显示了实施例9中进行研究的结果，其中测量了于28°CTCA緩冲液或含有10mM丙酮酸盐的TCA緩冲液中，用20SYBR-14染料染色的精子的前向性运动百分比。图10以图表显示了实施例10中进行研究的结果，其中测量了于28。CTCA緩沖液或含有10mM丙酮酸盐的TCA緩沖液中，用100jiMBBC染料染色的精子的前向性运动百分比。图11以图表显示了实施例11中进行研究的结果，其中测量了于28。CTCA緩冲液或含有10mM丙酮酸盐的TCA緩沖液中，用200BBC染料染色的精子的前向性运动百分比。图12以图表显示了实施例12中进行研究的结果，其中测量了于28。C含有10mM丙酮酸盐的TCA或含有10mM丙酮酸盐的二氧化碳气层包裹的TCA中，用600Hoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。图13以图表显示了实施例12中进行研究的结果，其中测量了于28。C含有10mM丙酮酸盐的TCA或pH7.3基于碳酸盐的抑制性緩沖液中，用600nMHoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。图14以图表显示了实施例12中进行研究的结果，其中测量了于28。C含有10mM丙酮酸盐的TCA或pH6.2基于碳酸盐的抑制剂緩沖液中，用600nMHoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。图15以图表显示了实施例13中进行研究的结果，其中测量了于28。C含有10mM丙酮酸盐的TCA且随后用含有10mM丙酮酸盐的TCA或pH6.2基于碳酸盐的抑制剂1比3稀释的情况下，用1000jiMHoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。图16以图表显示了实施例13中进行研究的结果，其中测量了于28。C(1)含有10mM丙酮酸盐的TCA且用相同溶液1比3稀释的情况下或(2)pH7.3基于碳酸盐的緩沖液且用pH6.2基于碳酸盐的抑制剂1比3稀释的情况下，用1000nMHoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。图17以图表显示了实施例13中进行研究的结果，其中测量了于28°C含有10mM丙酮酸盐的TCA或pH6.2基于碳酸盐的抑制剂中，用1000jiMHoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。图18以图表显示了实施例14中进行研究的结果，其中测量了于4rc含有10mM丙酮酸盐的TCA且随后用含有10mM丙酮酸盐的TCA或pH6.2基于碳酸盐的抑制剂1比3稀释的情况下，用300pMHoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。图19以图表显示了实施例14中进行研究的结果，其中测量了于41。C(1)含有10mM丙酮酸盐的TCA且用相同溶液1比3稀释的情况下或(2)pH7.3基于碳酸盐的緩冲液且用pH6.2基于碳酸盐的抑制剂1比3稀释的情况下，用300nMHoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。图20以图表显示了实施例14中进行研究的结果，其中测量了于41°C含有10mM丙酮酸盐的TCA或pH6.2基于碳酸盐的抑制剂中，用300jiMHoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。发明详述令人惊讶的是，与调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物接触的精子往往更能耐受多个与分选精子细胞为带有X或Y染色体的精子富集群通常相关的步骤。因此在优选实施方案中，可以制备性别富集精子群用于人工授精，所述精子群在染色后或分选后的组合物中，活细胞或可运动精子(特别是前向性运动精子)的数目增多。一般而言，调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物中含有可以将电子从一种底物传递到另一种底物的组分。此类组合物可包含获取或提取电子的组分(氧化剂或电子受体)，或提供电子的组分(还原剂或电子供体)。对于生物系统而言，将调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物视为可以对化合物添加或移去氧或氢的组合物更易理解。因此，一般而言，此类组合物可含有如丙酮酸盐、维生素K、硫辛酸、谷胱甘肽、黄素、醌类、超氧化物歧化酶(SOD)以及SOD模拟物。精子悬浮液中可含有此类组合物，其浓度足以实现保护性作用而不会对精子健康产生有害作用。根据诸如所用的具体组合物或悬浮液中的精子浓度等因素，例示性的浓度范围包括从约10fiM至约50mM。例如，若组合物中含有丙酮酸盐，则其在精子悬浮液中的浓度为约0.5nM至约50mM，优选为约1mM至约40mM，更优选为约2.5mM至约25mM,还更优选为约10mM至约20mM，甚至还更优选为约15mM，最优选为约10mM。若组合物中含有维生素K，则其在精子悬浮液中的浓度为约1至约100HM，优选为约10nM至约100nM，更优选为约50nM至约100nM，最优选为约100nM。若组合物中含有硫辛酸，则其在精子悬浮液中的浓度为约0.1mM至约1mM，优选为约0.5mM至约1mM，更优选为约0.5mM，最优选为约lmM。精子悬浮液中可含有任一种上述所列的组合物实施方案，或上述所列浓度的任意组合。例如，精子悬浮液中可含有调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物，所述组合物中包含浓度为约10mM的丙酮酸盐以及浓度为约100jiM的维生素K。或者，精子悬浮液中还可含有包含浓度为约10mM的丙酮酸盐及浓度为约1mM的硫辛酸的组合物。又一精子悬浮液的实例中含有包含浓度为约10mM的丙酮酸盐、浓度为约100nM的维生素K以及浓度为约1mM的硫辛酸的组合物。一般而言，调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物可以提供保护性作用，例如在含有该组合物的精子悬浮液中增加活细胞的数目或增加可运动细胞的数目，特别是增加前向性运动细胞的数目。此类组合物对精子细胞分选方法中形成的任何悬浮液都具有保护性作用的同时，在染色步骤中其益处具有特别的价值，其中此类组合物可有助于在染色温度升高、染料浓度增加、染色时间增长或其任意组合的情况下保持精子存活力。一般而言，细胞分选方法包括一系列分离步骤，即细胞样本的收集、细胞染色、细胞分选、分选细胞的收集、任选地和分选细胞的冷冻伸展(cryoextension)。形成的精子悬浮液中最好含有调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物，或在一个或多个这些步骤中采用所述组合物。勿應^^品W仅漠可以收集牛、猪、马或其它哺乳动物完整的活精子细胞并将之与运动抑制剂接触。已知多种收集活精子的方法，例如，包括如手握法、使用人工阴道以及电刺激射精。例如，可以将一般每毫升含有5亿至100亿精子细胞的牛精子样品，直接由来源哺乳动物收集于含有调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物的容器中，以形成精子悬浮液。或者，也可以将精子样品收集于空容器中，随后在收集的数小时内将之与此类组合物接触以形成精子悬浮液。精子样品也可混合于緩冲物(以固体或溶液形式)中，以形成緩冲精子悬浮液。其中緩冲物通过緩冲pH或渗透压的显著变化，可以增强精子存活力。一般而言，緩冲物对细胞无毒，且与用于细胞染色的染料相容。例示性的緩沖物包括如磷酸盐、二磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、乳酸盐以及它们的组合。目前优选的緩沖物包括TCA、TEST、柠檬酸钠、HEPES、TL、TES、柠檬酸一水合物、HEPEST(Gradipore，St.Louis，MO)、PBS(Johnson等人，GameteResearch,17:203-212(1987))、以及Dulbecco，sPBS(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA)。可以混合一种或多种緩沖物或者与下文讨论的添加剂一同组成緩冲溶液，并将緩冲溶液与精子样品一同混合成緩冲精子悬浮液。緩冲液中也可含有如下文更详细论及的一种或多种添加剂，或调节细胞内和/或细月包外氧化/还原反应的组合物。緩沖溶液的实例见表I。优选的緩冲溶液包4舌含有3%TRIS碱、2%柠檬酸一水合物，以及1%果糖(w/v)的pH为约7.0的水溶液；表I中命名为TCA#1的溶液；以及表I中命名为TCA#2的溶液。表I.緩冲溶液<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>青霉素-G0.15g水l升l升l升l升l升l升目标pH7.357.357.357,357.357.35目标渗透压(毫摩尔渗透压/千克~314300316298~296水)所用緩沖物的量一般取决于几点考虑，例如具体的緩沖物和緩冲精子悬浮液中且的精子浓度(精子数/ml)。因此，将使用足量緩冲物从而达到期望浓度的精子勿ml。可以加入緩冲物以实现精子悬浮液中含有约lxl03精子/ml至约5xl(^精子/ml。例如，在一个实施方案中，可加入緩冲物以获得"相对低，，浓度精子的精子悬浮液，即加入緩冲物以实现精子悬浮液中含有少于约lxl0"精子/ml，优选少于约lxl()S精子/ml，更优选约^103精子/ml至约5xl06精子/ml，还更优选约lxl()3精子/ml至约lxl()6精子/ml，甚至更优选lxlO"精子/ml至约lxl()5精子/ml，最优选约lxl()S精子/ml。在可选的实施方案中，可加入緩冲物以获得"中间，，浓度精子的精子悬浮液，即加入緩冲物以实现精子悬浮液中含有约lxl(T至约lxl()S精子/ml。又在另一实施方案中，可加入緩冲物以获得"相对高，，浓度精子的精子悬浮液，即加入緩冲物以实现精子悬浮液中含有多于约lxl()8精子/ml,优选约lxl08精子/ml至约5xl(^精子/ml，更优选约1.5xl0S精子/ml至约2xl0"精子/ml，甚至更优选1.5xl()S精子/ml至约2xl()S精子/ml，还更加优选约1.5xl()S精子/ml。确定所用緩冲物量(即该緩冲精子悬浮液是否将具有"相对低"、"中间"或"相对高"浓度的精子)的另一点考虑，包括随后分选或富集精子细胞所用的方法。例如，可以利用如下文更为详述的流式细胞术分选精子细胞。在这种情况下，緩沖精子悬浮液一般为"中间"或"相对高"浓度的精子/ml。其它分选或富集技术可能在精子细胞浓度较低时更利于使用，例如标有标记(如此处所述的染料和标记)的"相对低"浓度的精子细胞。可选地，也可以将精子与抑制性緩冲物混合，以形成受抑的精子悬浮液。抑制性緩沖物通过模拟哺乳动物附睾或附睾管内的液体环境，使精子细胞仿效哺乳动物(如公牛)附睾中的精子细胞。此类緩冲液会降低或抑制精子的运动或代谢活性。例示性的该类緩沖物包括基于碳酸盐的緩沖物，如Salisbury&Graves,丄/^/7/w/./^W/,，6:351-359(1963)中公开的那些。此类中的优选緩冲物为每25ml纯水中含有0.204gNaHC03、0.433gKHC03和0.473gC6H807H20(NaHC030.097mol/L、KHC030.173mol/L、C6H807.H200.090mol/L的水溶液)。此外，受抑精子悬浮液中还可含有调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物。除了緩冲物之外，精子悬浮液中也可含有一系列添加剂以增强精子存活力或运动性，或提供其它益处。例示性的添加剂包括能源、蛋白质源以及抗生素。可以在緩沖精子悬浮液形成前，向緩沖物或緩沖溶液中加入一种或多种此类添加剂；或者也可分别将其加入精子悬浮液中。可以加入一种或多种能源，以最大程度降低或抑制精子细胞中胞内磷脂及其它细胞组分的氧化。能源的实例包括单糖(如果糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖)和双糖(如蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖)，以及其它多糖。例如，产生的精子悬浮液中可含有约1%(w/v)至约4%(Wv)的能源。若含有能源，则能源优选果糖，且精子悬浮液中含有量约2.5%(w/v)。緩冲物、緩沖溶液、精子悬浮液或緩沖精子悬浮液中也可含有蛋白质源，以最大程度减小稀释震荡、为细胞提供支持或在整个悬浮液中分散细胞。例示性的蛋白质源包括卵黄、卵黄提取物、乳(包括热匀浆和脱脂乳乳)、乳提取物、大豆蛋白、大豆蛋白提取物、血清白蛋白、牛血清白蛋白、人血清替代物增补剂以及它们的组合。白蛋白特别是牛血清白蛋白(BSA),是优选的蛋白质源。例如，若含有BSA，则精子悬浮液中的BSA含量可少于约5.0%(w/v)，优选少于约2%(w/v)，更优选少于约1%(w/v),而最优选其量为约0.1%(w/v)。单独使用蛋白质源(如BSA),可能会起始悬浮液中百分之一精子细胞的获能过程。该过程优选发生于雌性生殖道内。因此，为了抑制稀释过程以及随后的染色和分选期间获能的起始，精子悬浮液中可含有备选蛋白质源或蛋白质替代物。所述的备选蛋白质源或蛋白质替代物除了能够抑制精子悬浮液中更大百分比的细胞起始获能，还具有典型蛋白质源(如BSA)的优点。备选蛋白质源的实例包括人血清替代物增补剂(SSS)(IrvineScientific,SantaAna，CA)以及胆固醇强化的BSA，而蛋白质替代物的实例包括聚乙烯醇，例如一般分子量为约30,000至约60,000的低至中粘度聚乙烯醇。一般而言，若含有这些组合物，其含量与上述BSA的量相同；緩冲物或緩冲溶液中总白蛋白含量一般不超过约5.0%(w/v)。可以向精子悬浮液或緩沖精子悬浮液中加入抗生素，以抑制细菌的生长。例示性的抗生素包括如，泰乐菌素、庆大霉素、林可霉素、壮观霉素、利高霉素Linco-Spectii^(林可霉素羟氯化物-壮观霉素)、青霉素、链霉素、替卡西林(ticarcillin)或其任意组合物。抗生素的浓度可为每ml精子中约50网至约800jig(不论精子是否为纯净的、緩冲性的或含有其它物质，例如此处提及的任一种添加剂)。CertifiedSemenServices(CSS)和美国国家动物育种协会(NAAB)已经颁布了有关抗生素在精子收集和使用中应用的纲要。法。一般而言，精子细胞染色方法中可包括形成染色混合物(有时称为标记混合物)，其中含有完整的活精子细胞、调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物，以及染料(有时称为标记)。在本发明的这一方面，可以将组合物与精子细胞接触以形成精子悬浮液，然后将精子悬浮液与DNA选择性染料相接触。在该实施方案中，精子来源可为纯精子，或者为通过离心或使用其它手段分离精子级分而得到的含有精子的精子衍生物。一经获得，则可以以纯精子的形式、或者以由之获得的悬浮液形式(例如上文"细胞样品收集"中讨论的精子悬浮液或緩冲精子悬浮液)将精子细胞引入染色混合物中。染料可以为纯固体或液体组合物的形式。也可将染料溶解或分歉于非緩冲液体中以形成染料溶液，或者，染料还可以为染料悬浮液的形式，其中含有染料以及与精子细胞生物相容的緩冲物或緩沖溶液。上文"样品收集，，中业已讨论了多种緩冲物和緩冲溶液的实例。例如，可用的緩沖物包括含有3%TRIS碱、2%柠檬酸一水合物和1。/。果糖(w/v)的pH为约7.0的水溶液；或者每25ml纯水中含有0.204gNaHC03、0.433gKHCO;j和0.473gC6H807.H20(NaHC030.097mol/L、KHC030.173mol/L、C6H807.H200.090mol/L的水溶液)基于碳酸盐的緩冲溶液。因此，例如，可以通过将成染色混合物。或者，也可以通过将纯精子与緩冲物或緩沖溶液、染料以及调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物混合，形成染色混合物。此外，还可将精子悬浮液与染料混合形成染色混合物。如以前在美国专利号5，135，759和WO02/41906中所述，可4吏用一种或多种可经UV或可见光激发的选择性DNA染料可以形成染色混合物。经紫外光(UV)激发的选择性染料实例包括Hoechst33342和Hoechst33258，二者均可由Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)购得。经可见光激发的例示性染料包括可购于MoleqilarProbe,Inc.(Eugene,OR)的SYBR-14，以及WO02/41906中所描述的双苯甲亚胺-BODIPY⑧缀合物6國([3-((2Z)-2-([l-(二氟硼烷基)-3，5-二甲基-lH-吡咯-2-基〗亚曱基)-27y-吡咯-5隱基)丙酰基1氨基}-1\-[3-(甲基{3-[({4-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1仏3，^-2，5，-双苯并咪唑-2，-基苯氧基}乙酰基)氨基]丙基}氨基)丙基]己酰胺("BBC")。这些染料中的每一种都可以单独使用或者联合使用；或者，也可以将其它具有细胞渗透性的UV和可见光激发的染料单独或与前述染料联合使用，只不可接受的不良影响。或者，还可利用荧光聚酰胺形成染色混合物，更具体而言是利用缀合有荧光标记或报告子的聚酰胺。此类标记在结合于核酸时会发出荧光。连接有荧光标记或报告子的聚酰胺实例包括，如Best等人，尸roc.Vfl".5W.t/5^，100(21):12063-12068(2003);Gygi等人，A^/c/"c^"Vfe及仏，30(13):2790-2799(2002);美国专利号5,998,140;美国专利号6，143，卯1以及美国专利号6,090,947中所公开的那些，其中每一篇内容均在此处引用作为参考。萸光核苷酸序列也可用于标记精子细胞。此类核苷酸序列在与含有靶序列或互补序列的核酸杂交时会发出焚光，但在非杂交状态时则不会发出荧光。此类核苷酸公开见于如美国专利申请^^开号2003/0113765(此处引用作为参考)。性别特异性抗体也可用于标记染色混合物中的精子细胞。例如在该实施方案中，性别特异性抗体可缀合于荧光部分(或等价报告分子)。由于抗体结合的抗原只存在于带有X染色体或Y染色体的细胞上，根据其荧光(相对于无荧光的未标记细胞)能够选择性地鉴定此类细胞。此外，可以同时使用分别与不同荧光部分相连的一种以上的性别特异性抗体。从而能根据带有X染色体或Y染色体的细胞间的不同荧光，对之进行区分。也可使用发光的色彩选择性纳米晶体标记染色混合物中的精子细胞。这些颗粒也称为量子点，正如美国专利号6,322,901和美国专利号6,576,291所述为本领域所公知(均在此处引用作为参考)。这些纳米晶体已被缀合于多种生物学材料，包括如肽、抗体、核酸、链霉亲和素及多糖(见如美国专利号6，207，3926,423,551、5，9卯，479和6,326,144,均在此处引用作为参考)，且已用于检测生物学靶标(见如美国专利号6,207,392和6,247,323，两者均在此处引用作为参考)。染色混合物中DNA选择性染料的浓度优选为一系列变量的函数，所述变量包括细胞对于所选染料的渗透性、染色混合物的温度、完成染色所需要的时间量、以及随后的分选步骤中所期望的富集程度。一般而言，优选的染料浓度足以在适度短的时间内达到所期望的染色程度，而不会对精子存活力产生实质的不良影响。例如，Hoechst33342、Hoechst33258、SYBR-14或BBC在染色混合物中的浓度一般在约0.1pM至约1.0M之间，优选为约0.1nM至约700jiM，更优选为约100nM至约200jiM。在特别优选的实施方案中，Hoechst33342、Hoechst33258、SYBR-14或BBC在染色混合物中的浓度一般在约400jiM至约500nM，最优选为约450HM。因此，在一种染色条件^殳置下，Hoechst33342的浓度优选为约100jiM。在另一种染色条件设置下Hoechst33342的浓度为约150jiM。又在另一种染色条件设置下，浓度优选为约200pM。而在另一种染色条件设置下，Hoechst33342的浓度最优选为约450nM。又例如，荧光聚酰胺的浓度(例如美国申请发明者C·L·路德维格,J·A·格雷厄姆,K·S·克劳利,M·安扎尔申请人:英格朗公司