专利名称：胶原纤维固载金属离子吸附材料对微生物、蛋白质和酶的吸附分离的制作方法
技术领域：
本发明涉及胶原纤维固载金属离子吸附材料对微生物，蛋白质和酶的吸附分离。属于胶原纤维固载金属离子吸附材料的应用领域。
背景技术：
(1)水体中有害细菌的清除水体中的病原菌对人类健康会造成极大危害(P.Payment，E.Franco，L Richardson，J.Siemiatycki.Gastrointestinal health effects associated with the consumption of drinkingwater produced by point-of-use domestic reverse osmosis filtration units.Appl Environ.Microbiol.，1991，57945-948；P.Payment，E.Franco，L.Richardson，J.Siemiatycki，R.Dewar，M.Edwards，E.France.A randomized trial to evaluate the risk of gadtrointestinaldisease due to the consumption of drinking water meeting currently acceptedmicrobiological standards.Am.J.Public Health，1991，81703-708)。许多国家相继爆发了由微生物污染水源所引起的疾病(A.C.Moore，B.L.Herwaldt，R.L.Caldereon，A.K.Highsmith，D.D.Juranek.Surveillance for waterborne disease outbreaks，United States，1991～1992.Morbid.Mortal.Week.Rep.，1993，421-22；U.Adrian，J.G.Michael.Transport of bacteria from manure and protection of water resources.Applied Soil Ecology，2004，251-18)。美国微生物研究所于1996年指出，地球的地表水和饮用水已经受到微生物污染，全球范围内由水源中的病原菌引起的疾病正在不断增加(G.F.Craun.Asummary of waterborne illness transmitted through contaminated groundwater.J.Environ.Health，1985；48122-7.)。
清除水体中细菌的方法主要有过滤法和吸附法两种(T.K.Stevika，G.Kari Aab，Auslanda，J.F.Jon Fredrik Hanssen.Retention and removal of pathogenic bacteria inwastewater percolating through porous mediaa review，Water Research，2004，381355-1367)。利用颗粒介质深层过滤除去微生物是最常用的方法，但必须在过滤介质表面形成生物膜或向水中加入絮凝剂才能有效除去微生物。由于细菌表面通常带有负电荷，而大多数过滤介质(如硅藻土、沙子等)本身也带有负电荷，因而过滤除菌效率不佳。众多研究者发现，增加过滤介质或多孔吸附介质表面的正电荷数量，是有效提高细菌清除率的途径之一(J.N.Chen，S.Truesdail，F.H.Lu，G.Q.Zhan，C.Belvin，B.Koopman，S.Farrah，D.Shah.Long-term evaluation of aluminum hydroxide-coated sandfor removal of bacteria from wastewater，Water Research，1998，32(7)2171-2179；M.Chaudhuri，S.A.Sattar.Enteric virus removal from water by coal-based sorbentsdevelopment of low-cost water filters.Water Sci.Technol.，1986，1077-82)。Lukasik等人将Fe(OH)3和Al(OH)3覆盖在沙子表面制备吸附材料，可有效除去水体中的微生物(LukasikJ，Cheng Y F，Lu F H，Tamplin M，Farrah S R.Removal of microorganisms from water bycolumns containing sand coated with ferric and aluminum hydroxides.Water Research，1999，33(3)769-777)。但由于覆盖在介质表面的金属氢氧化物因结合能力弱而流失，从而降低处理效率，同时会形成化学或生物污垢。
研究表明将金属离子固载在不溶于水的基础材料上，通过增加材料表面正电荷而提高材料对细菌的吸附能力。因此，如何提高金属离子在基础材料上的固载坚牢度是需要解决的关键技术难题。
(2)蛋白质和酶的分离提取蛋白质和酶的分离提取是现代生物学、现代生物技术及药物化学的前沿研究课题。传统的分离提取方法有沉淀、离心、结晶、溶剂萃取等(P.A.Belter，E.L.Cussler，W.S.Hu，BioseparationDownstream Processing for Biotechnology，Wiley Press，New York，1988.)。但由于吸附分离法的高选择性，吸附分离法特别是亲和吸附法(IMA)得到了越来越广泛的应用(T.Kawai，K.Saito，W.Lee.Protein binding to polymer brush，based onion-exchange，hydrophobic and affinity interactions.J.Chromatogra.B.2003；790131-142.)。亲和吸附剂是将金属离子负载在基础材料上，利用不同金属离子与蛋白质具有不同的亲和能力而实现分离。亲和吸附法具有吸附容量高、易于制备、稳定性好等特点(S.Serap，K.Ahmed，A.Yakup，S.Ridvan，D.Adil.Comparison of adsorptionperformances of metal-chelated polyamide hollow fibre membranes in lysozyme separation.Colloid Surface B.2002；24265-275.)。但一般的亲和吸附材料与蛋白质的生物相容性差，容易导致蛋白质和酶失去生物活性。另一方面，金属离子的固载量和坚牢度也将影响亲和吸附剂的分离能力。
(3)酵母的分离和固定化在生物、食品、制药、发酵等领域广泛使用某些微生物，如酵母等(H.Jungwirth，K.Kuchler.Yeast ABC transporters-A tale of sex，stress，drugs and aging.FEBS Letters.2006，5801131-1138.；N.Ladygina，E.G.Dedyukhina，M.B.Vainshtein.A review onmicrobial synthesis of hydrocarbons.Process Biochemistry.2006，411001-1014)。这些微生物的提取分离一直是上述领域的重点研究内容。另一方面，将某些微生物固定在基础材料上将进一步简化生产工艺，或者更有利于后续工艺中对产物的分离提取(张菡，杜双奎.酿酒酵母细胞固定化研究.中国酿造.2006，(2)12-15.；张卫兵，贠建民，余群力.采用固定化酵母酿造食醋的工艺研究.中国酿造.2005，152(11)36)。可以采用吸附法实现微生物的固定化(张磊，张烨，侯红萍.固定化细胞技术的研究进展.四川食品与发酵.2006，42(1)5-7)胶原纤维固载金属离子吸附材料对F-、PO43-、AsO43-以及染料具有很高的吸附容量，通过改变金属离子的固载量和种类实现对吸附容量的调控。该吸附材料可用于化工、冶金、纺织印染等工业所产生废水和一般水中的F-、PO43-、AsO43-等阴离子以及染料的吸附与分离。(石碧，廖学品.胶原纤维固载金属离子吸附材料及其制备方法和用途.专利申请号200410040145.0)。由于该类吸附材料与微生物、蛋白质和酶具有较强的亲和力，因此在生物、食品、制药、发酵等领域将获得更加广泛的应用。
发明内容
本发明的目的在于证明胶原纤维固载金属离子的新用途，即用于微生物，蛋白质和酶的吸附分离。
本发明实验证实固载在皮胶原纤维上金属离子可作为亲和吸附材料通过静电作用或配位作用与细菌、蛋白质和酶结合，从而产生吸附作用。研究发现，胶原纤维固载铁对大肠杆菌的吸附量达61.4±1.73×107cfu/g，对金黄色葡萄球菌的吸附容量达到82.6±1.32×107cfu/g；胶原纤维固载锆对血色素的吸附容量达到40-60mg/g，对白蛋白的吸附容量达到60-75mg/L；胶原纤维固载铁对溶菌酶具有较强的选择吸附能力，它能够把蛋清中的溶菌酶分离纯化，提取率达到90％以上，纯度＞95％。
本发明具有以下有益结果1、本发明对胶原纤维固载金属离子吸附材料发掘了新的用途，开拓了新的应用领域。
2、本发明对水体中有害细菌的脱除提供了一种新的方法，同时该吸附材料用于蛋白质和酶的吸附分离，以及酵母的吸附分离和固定化。
图1(a)菌龄对吸附量的影响大肠杆菌(E.Coli)，qe，和ce分别为平衡吸附量(cfu/g)和平衡吸附浓度(cfu/ml)。
图1(b)菌龄对吸附量的影响金黄色葡萄球菌(S.aureus)，qe，和ce分别为平衡吸附量(cfu/g)和平衡吸附浓度(cfu/ml)。
图2pH对吸附量的影响图3胶原纤维固载铁对E.coli a和S.aureus的吸附动力学图4.pH对吸附量的影响图5盐浓度对溶菌酶吸附的影响图6胶原纤维固载铁对溶菌酶的吸附等温线图7胶原纤维固载铁对溶菌酶的吸附动力学图8pH对酵母吸附量的影响q为吸附量图9酵母的吸附平衡线图10酵母的吸附动力学具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
实施例1、胶原纤维固载铁(III)吸附材料的制备及其对细菌的吸附1、材料和方法1.1、胶原纤维固载铁吸附材料的制备按专利方法制备胶原纤维固载铁吸附材料(专利申请号200410040145.0，发明名称胶原纤维固载金属离子吸附材料及其制备方法和用途)。
1.2、菌种的培养E.coli和S.aureus由四川大学食品微生物实验室提供。E.coli采用胆盐乳糖增菌培养基于37℃条件下培养；S.aureus采用肉汤培养基于37℃条件下培养。
1.3、菌悬液的制备菌种经过增菌培养后离心(4℃，10000rpm)12min，用无菌水收集细胞于250mL锥形瓶中，加玻璃珠振荡以使细胞分散。
1.4、细菌计数采用十倍梯度稀释法将菌液稀释到一定浓度，用孔径为0.45μm的膜过滤，滤膜覆盖于固体培养基上。E.coli采用伊红美兰琼脂培养基于37℃条件下培养8～10h后计数，S.aureus采用营养琼脂培养基于37℃条件下培养20～22h后计数。
1.5、胶原纤维及胶原纤维固载铁吸附材料对细菌吸附的比较分别将0.500g胶原纤维或胶原纤维固载铁吸附材料置于无菌水中浸泡12h，滤除水分后将其分别加入到100mL浓度为106cfu/ml的菌悬液(15h培养物配制)中，在设定温度下振荡吸附1h，以相同浓度不加吸附剂的菌悬液作为空白对照组。根据吸附残液中菌体的浓度变化计算平衡吸附量。
1.6、吸附平衡将0.500g胶原纤维固载铁吸附材料置于无菌水中浸泡12h，滤除水分后将其分别加入到100mL浓度分别为102、103、104、105和106cfu/ml的菌悬液(15h培养物配制)中，在设定温度下振荡吸附1h，以相同浓度不加吸附剂的菌悬液作为空白对照组。根据吸附残液中菌体的浓度变化计算平衡吸附量。
1.7、菌龄对吸附平衡的影响将0.500g胶原纤维固载铁吸附材料置于无菌水中浸泡12h，滤除水分后将其分别加入到100mL浓度分别为102、103、104、105和106cfu/ml的菌悬液(15h、25h和60h培养物配制)中，在设定温度下振荡吸附1h，以相同浓度不加吸附剂的菌悬液作为空白对照组。根据吸附残液中菌体的浓度变化计算平衡吸附量。
1.8、pH对吸附平衡的影响将0.500g胶原纤维固载铁吸附材料置于无菌水中浸泡12h，滤除水分后将其分别加入到100mL浓度为106cfu/ml、pH分别为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0的菌悬液(15h培养物配制)中，在设定温度下振荡吸附1h，以相同浓度不加吸附剂的菌悬液作为空白对照组。根据吸附残液中菌体的浓度变化计算平衡吸附量。
1.9、吸附动力学将0.500g胶原纤维固载铁吸附材料置于无菌水中浸泡12h，滤除水分后将其分别加入到100mL浓度为106cfu/ml的菌悬液(15h培养物配制)中，30℃下振荡吸附，以相同浓度不加吸附剂的菌悬液作为空白对照组。定时取样分析吸附残液中菌体的浓度，计算不同时刻的吸附量，根据吸附残液中菌体的浓度变化计算平衡吸附量。
2、结果2.1、胶原纤维固载铁吸附材料对细菌的吸附容量胶原纤维固载铁(FICB)对细菌的吸附容量如表1所示。从表1看出，胶原纤维固载铁对大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)具有较高的吸附容量。
2.2、菌龄对吸附量的影响实验结果表明，细菌的培养时间对平衡吸附量有一定的影响，如图1所示。从图1看出，在一定范围内培养时间与平衡吸附量呈负相关。这可能是由于不同培养时间的细菌所处的生长阶段不同，其细胞活性也不同。当其培养时间为15h时，菌体处于对数生长期，其细胞表面的负电荷数量最多，所以胶原纤维固载铁对其平衡吸附量最大。随着培养时间的延长，菌体活性逐渐降低，导致平衡吸附量降低。
2.4、pH对吸附量的影响pH对吸附量的影响如图2所示。从图2看出，在pH为4.0～10.0范围内胶原纤维固载铁对细菌均有较高的平衡吸附量，在酸性pH条件下，平衡吸附量稍微高一些。但是过低的pH一方面会导致细菌自然死亡(pH＝2.0时)，另一方面会使部分Fe(III)从胶原纤维上脱落(pH＜3.5时＝。因此，适宜的pH范围为4.0～10.0。
2.5、吸附动力学吸附动力学如图3所示。从图3看出，胶原纤维固载铁对细菌的吸附非常迅速，当E.coli和S.aureus的起始浓度分别为1.02×107cfu/ml和9.60×106cfu/ml时，经10min吸附后，胶原纤维固载铁对它们的吸附量分别达到2.23×109cfu/ml和2.72×109cfu/ml。吸附90min后吸附基本达到平衡，其吸附量分别为2.93×109cfu/ml和3.11×109cfu/ml。比表面/空隙率分析仪(TriStar 3000)测得该吸附材料的比表面积为2.50～3.80cfu/ml，而且基本上不存在微孔，因此该材料对细菌的吸附过程主要是在材料的表面进行，因此，其吸附速度很快。
实施例2、胶原纤维固载金属离子吸附材料对蛋白质和酶的吸附分离分别研究了胶原纤维固载金属离子对5种蛋白质和5种酶的吸附，这里仅以胶原纤维固载铁及其对溶菌酶的吸附为例表明胶原纤维固载金属离子吸附材料对蛋白质和酶的吸附分离作用。
1、材料和方法1.1、溶菌酶和试剂溶菌酶(EC 3.2.1.7)购自Seikagaku Kogyo Company，Ltd.(Tokyo，Japan)，牛血清蛋白购自Sigma公司，Micrococcus lysodeikticus购自中科院微生物所，考马斯亮兰购自Pierce(Rockford，1L，USA)。
1.2、分析方法溶菌酶的浓度用Bradford法测定(M.M.Bradford，Anal.Biochem.1976，72248)，以牛血清蛋白作为标准。酶活的测定按Shugar所建立的方法进行(D.Shugar，Biochem.Biophs.Acta 1952，8302.)。
1.3、pH对吸附量的影响将0.100g胶原纤维固载铁吸附材料用蒸馏水浸泡12h，滤除水分后将其分别加入到25mL浓度为500mg/L、pH分别为4.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的溶菌酶溶液中，在278K下振荡吸附1h。吸附后过滤，根据吸附残液中溶菌酶的浓度变化计算吸附量。对其它蛋白质和酶的吸附试验条件相同。
1.4、盐浓度对吸附量的影响将0.100g胶原纤维固载铁吸附材料用蒸馏水浸泡12h，滤除水分后将其分别加入到25mL浓度为500mg/L、pH为8.0、NaCl溶液的浓度分别为0、0.1、0.25、0.5和1.0M的溶菌酶溶液中，在278K下振荡吸附1h。吸附后过滤，根据吸附残液中溶菌酶的浓度变化计算吸附量。
1.5、吸附等温线将0.100g胶原纤维固载铁吸附材料用蒸馏水浸泡12h，滤除水分后将其分别加入到25mL、pH为8.0、浓度分别为500，1000，1500，2000和2500mg/L的溶菌酶溶液中，在设定温度下振荡吸附124h。吸附后过滤，根据吸附残液中溶菌酶的浓度变化计算吸附量。
1.6、吸附动力学将0.100g胶原纤维固载铁吸附材料用蒸馏水浸泡12h，滤除水分后将其分别加入到25mL、pH为8.0、浓度分别为500和1000mg/L的溶菌酶溶液中，在303K下振荡吸附，吸附过程定时取样分析溶菌酶的浓度，根据溶菌酶的浓度变化计算吸附量。
2、结果2.1pH对吸附量的影响pH对吸附量的影响如图4所示。从图4看出，在实验条件下，当pH为8.0时吸附量最大。
2.2、盐浓度对吸附量的影响在有NaCl存在的情况下，胶原纤维固载铁对溶菌酶的吸附特性如图5所示。从图5看出，盐浓度的变化对溶菌酶的吸附影响较大，随着盐浓度的增加，吸附量迅速降低并逐渐趋于稳定。
2.3、吸附等温线胶原纤维固载铁对溶菌酶的吸附等温线如图6所示。从图6看出，随着温度的升高，吸附量增加，当温度为303K时，吸附量可达400mg/g；吸附等温线符合Langmuir方程。
2.4、吸附动力学胶原纤维固载铁对溶菌酶的吸附动力学如图7所示。从图7看出，初始浓度越大，吸附量也越大，其吸附动力学可用拟二级速度方程来描述。
2.5、胶原纤维固载铁对其它蛋白质和酶的吸附容量实验条件下，胶原纤维固载铁对其它蛋白质和酶的吸附容量如表2所示。从表2看出，不同的蛋白质和酶在不同的pH条件下其吸附量差别很大。可以利用这一特性实现蛋白质或酶的分离。
实施例3、胶原纤维固载金属离子吸附材料对酵母的吸附分离这里以胶原纤维固载锆对酵母的吸附特性为例。该方法不仅可以用于酵母的吸附分离，而且可用于酵母的固定化。
1、材料和方法1.1、胶原纤维固载铁吸附材料的制备按专利方法制备胶原纤维固载铁吸附材料(专利申请号200410040145，发明名称胶原纤维固载金属离子吸附材料及其制备方法和用途)。
1.2、培养基的制备1.2.1、液体麦芽汁培养基的制备(1)用水将小麦洗净，用水浸泡6～12h，置于15℃阴凉处发芽，上盖纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，40℃烘干，研磨成麦芽粉，贮备备用。
(2)取一份麦芽粉加四份水，在65℃水浴锅中保温3～4h，使其自行糖化，直至糖化完全(检查方法时取0.5ml的糖化液，加2滴碘液，若无蓝色出现，即表示糖化完全)。
(3)糖化液用4～6层纱布过滤，滤液如果混浊，可用蛋清澄清(用一个鸡蛋清，加入20ml水，调匀后倒入糖化液中，搅拌煮沸，再过滤)。
(4)用波美比重计检测糖化液中糖浓度，用水将滤液稀释到10～15波林，调节pH至6.4。
(5)分装，加塞，包扎。
(6)高压蒸汽灭菌，115～121℃灭菌25min。
1.2.2、固体麦芽汁培养基的制备麦芽汁的制备方法与1.2.1相同，用水将滤液稀释到10～15波林后，加入2％琼脂，加热融化，补充失水后，分装灭菌。
1.3、菌种的培养S.cerevisiae由四川大学食品微生物实验室提供，采用液体麦芽汁培养基于30℃条件下进行增菌培养。
1.4、菌悬液的制备菌种经过增菌培养48h后离心(4℃，10000rpm)12min，用无菌水清洗细胞两次，收集细胞于250mL锥形瓶中，加玻璃珠振荡以使细胞分散。
1.5、酵母细胞计数
1.5.1、紫外测定酵母细胞数量将离心后制备的菌悬液稀释为一系列不同浓度的菌悬液，于420nm处测定其吸光值，同时采用膜过滤法测定其酵母细胞数。以吸光值为横坐标，酵母细胞数为纵坐标，绘制标准曲线。
1.5.2、膜过滤法测定酵母细胞数量根据紫外法测定的酵母细胞数量结果，采用十倍梯度稀释法将菌液稀释到合适的浓度(每张膜上的菌落数为30～200个)，用孔径为0.45μm的膜过滤，滤膜覆盖于固体麦芽汁培养基上，30℃下培养48h后计数。
1.6、pH对酵母吸附量的影响将0.500g胶原纤维固化锆吸附材料置于无菌水中浸泡12h，滤除水分后将其分别加入到100mL浓度为105cfu/ml、pH分别为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0的菌悬液中，在设定温度下振荡吸附5h，以相同浓度不加吸附剂的菌悬液作为空白对照组。根据吸附残液中菌体的浓度变化计算平衡吸附量。
1.7、离子强度对酵母吸附量的影响将0.500g胶原纤维固化锆吸附材料置于无菌水中浸泡12h，滤除水分后将其分别加入到100mL浓度为105cfu/ml、pH6.0、NaCl浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.2和0.5M的菌悬液中，在设定温度下振荡吸附5h，以相同浓度不加吸附剂的菌悬液作为空白对照组。根据吸附残液中菌体的浓度变化计算平衡吸附量。
1.8、酵母的吸附平衡将0.500g胶原纤维固化锆吸附材料置于无菌水中浸泡12h，滤除水分后将其分别加入到100mL浓度分别为10、102、103、104和105cfu/ml的菌悬液中，在设定温度下振荡吸附5h，以相同浓度不加吸附剂的菌悬液作为空白对照组。根据吸附残液中菌体的浓度变化计算平衡吸附量。
1.9、酵母的吸附动力学将0.500g胶原纤维固化锆吸附材料置于无菌水中浸泡12h，滤除水分后将其分别加入到100mL浓度为105cfu/ml的菌悬液中，30℃下振荡吸附，以相同浓度不加吸附剂的菌悬液作为空白对照组。定时取样分析吸附残液中菌体的浓度，根据吸附前后浓度的变化计算吸附量。
2、结果
2.1、pH对酵母吸附量的影响pH对酵母吸附量的影响如图8所示。从图8看出，胶原纤维固载锆对酵母的吸附量在pH为6.0时达到最大。
2.2、对酵母的吸附平衡酵母的吸附平衡线如图9所示。从图9看出，温度对酵母的吸附量影响不大。
2.3、离子强度对酵母吸附量的影响离子强度对酵母吸附量的影响如表3所示。从表3看出，当NaCl浓度小于0.1mol/L时对酵母的存活以及吸附容量的影响影响不明显。但随着NaCl浓度的进一步升高，其影响将明显增加。
2.4、酵母吸附的动力学酵母的吸附动力学如图10所示。从图10看出，当酵母的初始浓度为5.26×105cfu/mL(pH6.0)时，1h后吸附为1.4×107cfu/g。5h后吸附量为8.2×107cfu/g，基本达到吸附平衡。
表1胶原纤维固载铁对大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的吸附容量
表2胶原纤维固载铁吸附材料对蛋白和酶的吸附容量
表3离子强度对酵母吸附量的影响
权利要求
1.胶原纤维固载金属离子吸附材料在微生物、蛋白质和酶的吸附分离中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种胶原纤维固载金属离子吸附材料对微生物、蛋白质和酶的吸附分离，实验证明胶原纤维固载金属离子吸附材料可作为亲和吸附材料通过静电作用或配位作用与细菌、蛋白质和酶结合，从而产生吸附作用。胶原纤维固载铁对大肠杆菌的吸附量达61.4±1.73×10
文档编号C12N11/04GK1884512SQ20061002127
公开日2006年12月27日 申请日期2006年6月27日 优先权日2006年6月27日
发明者石碧, 廖学品, 陆爱霞 申请人:四川大学