专利名称：一种同步扩增检测肝炎及艾滋病毒核酸的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于诊断试剂核酸诊断技术领域，具体涉及一种灵敏度高、特异性强、适合于常规血液核酸筛查的同步提取和同步实时检测肝炎(包括乙型肝炎和丙型肝炎)和艾滋病毒核酸的方法和试剂盒。
背景技术：
据世界卫生组织(WHO)统计，超过一半国家没有对献血者献出的血液进行彻底检验，导致艾滋病、肝炎、疟疾和梅毒等疾病在很多地方泛滥。全球每年增加的560万名艾滋病毒携带者中，有5％至10％的人是经由输血或血液制品而感染的。在非洲儿童和妇女中病毒携带者，这一比例高达20％-25％。20世纪80年代以来，法国、日本、罗马尼亚、美国、德国以及我国等都曾因血液筛查欠缺而导致过严重的后果。血液传染病一旦在一个地方发生，往往会造成爆炸性传播，因此输血安全对人民的安全和社会的稳定有着极其特殊的意义。临床血液检测也面临日益剧增的检测压力。据WHO估计，我国艾滋病感染人数到2010年将达到1000万，并持续高速增长。我国有60％以上的人曾受到乙肝病毒的感染，最终有1/10左右的人成为乙肝表面抗原阳性。另外，在所有肝炎中慢性化程度最高的丙肝，发病人数也达到4000万左右。
与血液安全的极端重要性相比，目前的检测手段还远远滞后于社会的需要。目前对输血安全性构成严重威胁的乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病(HIV)病毒主要采用酶免疫(EIA)法进行检测。虽然经过了几代的改良，在灵敏度、特异性、精密度以及稳定性等方面取得了长足的进步，但作为一种间接滞后的检测方法，它所检测的是病毒所引发的人体抗体而不是病毒本身。故它不能够消除对“窗口期”标本的漏检，所谓“窗口期”即在被感染早期，体内还未产生抗体或抗体在检测限以下，此时的血清学检测一般为阴性。而HBV、HCV、HIV病毒感染产生抗体的窗口期又特别长，其中丙型肝炎病毒(HCV)的窗口期约为66-82天，乙型肝炎病毒(HBV)和人类免疫缺陷综合症病毒(即艾滋病)(HIV)的窗口期分别是大约59天和22天。另外，由于病毒的突变等事件的发生，也造成了部分免疫学方法检测漏检的可能。所以免疫学诊断方法存在固有的缺陷，不能杜绝漏检。检验方法的滞后已给输血安全和临床检验带来严重威胁。
近年来，核酸技术的发展和逐渐成熟为人们直接检测病毒的存在提供了最有力的工具。核酸扩增技术(Nucleic acid AmplificationTechnology，NAT)就是这一类技术的统称。核酸检测的是病毒基因本身，是在最根本的层面上对病毒的检测。核酸检测大大缩短了病毒检出的窗口期，并具有极高的灵敏度、特异性、精密度和稳定性。事实证明NAT检测可将HBV，HCV和HIV感染的平均“窗口期”分别缩短25天、59天和11天，分别缩短“窗口期”45％、89％和50％。正因为如此，越来越多的国家认识到血液核酸检测的重要性，在西欧等国家作为强制性指标在临床输血及血制品中执行，同时，美国，日本，欧盟已将NAT检测纳入献血者的常规筛查项目。
国外已有多个单项核酸检测产品投放市场。美国、澳大利亚、加拿大等国家相继有产品问世。罗氏公司也开发了核酸诊断试剂盒。但这些试剂盒要么是开放型的PCR-ELISA检测模式，要么操作繁琐，易发生检测污染，并且都是单个指标单次检测，这些缺陷使之很难适应市场现状的需要。分析这些核酸诊断试剂的现状，存在着以下几个严重不足1)试剂是开放式的，污染的可能性大；自动化程度低，而自动化和全封闭性是核酸检测最关键的技术瓶颈。2)试剂为单项检测的，没有一个血筛试剂可以同步提取、同时实时检测多种病毒核酸(如HBV，HCV，HIV)，如FDA批准的罗氏血液筛查试剂均为单项操作，使用的扩增程序各不相同，检测过程也不尽相同；FDA批准的另一家GEN-PROBE公司所使用的TMA技术可以同时扩增HCV与HIV，但不能同时扩增HBV；另外检测要么是不同管操作，各测各的；要么是同管操作，但一旦测定结果为阳性时却不能分辨是HCV还是HIV。迄今为止，美国FAD只批准过上述两个产品可用于血液核酸筛查。3)操作繁琐，重复性差，通量低，不适于临床检验和大规模的血液筛查。4)兼容性差，大多提供核酸提取试剂的厂家往往不提供扩增检测试剂或者二者不能很好的匹配，需要用户调整甚至优化；有的能同时提供匹配的试剂，却又不一定适用于特定的核酸自动提取仪；即使上述条件得到满足，用户还要根据扩增检测试剂的要求选用指定的仪器如COBAS AMPLICOR等。5)试剂往往不是即用型的，例如使用前需要溶解干粉、在一些瓶瓶罐罐中加入指定量的乙醇或异丙醇等有机试剂，有的试剂使用前还有复杂的配制工作，稍有不慎就造成试验的彻底失败。不同人员的操作还引入试剂准备这一步骤的操作误差；并且某些试剂一旦开封后或复溶后即使低温保存有效期也只有几天，尤不适于标本量较少情况下的多批次反复使用。前述的种种状况严重阻碍了血液核酸筛查在血站以及检验检疫等机构的大规模使用，也不利于核酸检测在大中型医院检验科室的广泛应用，成为血液筛查和临床核酸检验方法发展的瓶颈之一。
因此，本领域迫切需要开发适合于常规血液核酸筛查的自动化、高通量、多项目的同步核酸提取和实时扩增检测技术平台及可应用于规模化生产的性能稳定、可操作性强、即用型试剂的试剂盒，并有相关的仪器、耗材与之匹配。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能同步提取HBV、HCV、HIV病毒的核酸、同步实时扩增检测HIV、HBV、HCV病毒核酸的试剂盒，以克服传统蛋白检测固有的缺陷和不足，同时弥补现有国内外同类产品的诸多不足乃至方法学上无法解决的致命缺陷。
本发明提出一种能同步提取并同步实时测定血清或血浆标本中HIV(艾滋病)、HBV(乙型肝炎)、HCV(丙型肝炎)病毒核酸是否存在的方法和试剂盒。按照本发明所述的方法包括以下四项相对独立又相互关联的内容，并且提供了可选的组合以供完整实现本发明所述的试剂盒。①本发明公开了一种基于杂交原理选用磁珠作为自动化介质，使用磁珠分离仪实现特异性同步捕获多种病毒核酸的方法及其改良方法以及试剂，其特征是选用了与后续扩增检测中一条引物序列相一致的生物素修饰的寡核苷酸作为核酸提取试剂的捕获探针，其优点是既避免了漏检又不干扰后续的PCR检测。②本发明还公开一种新型RNA外标(即阳性对照)和RNA内对照(竞争性内标)的快速加端PCR构建及纯化方法，尚未见于任何文献报道或实例应用，其特点是快速、高效，优点是RNA制品中没有模板DNA的污染或其污染低到无法检测，尤其适合作为质控全程监测核酸提取、RT反应、PCR扩增检测的有效性。③本发明还提出了设计绿色环保型试剂盒的基础---阳性对照和内对照的基因工程构建法或PCR构建法，使试剂盒内的阳性对照和内对照均无传染性。④最后也最为关键的是本发明公开了一种适合于血液筛查的一步法单管双酶多项联合检测的TaqMan PCR扩增法，该体系含有UNG-dUTP“built-in”的防污染成分，所检测的项目为HBV DNA、HCV RNA、HIVRNA三个病毒核酸，既有DNA，又有RNA，并且体系中带有检测假阴性发生与否的内对照组份，本项发明最突出的优点在于该检测试剂的优秀的灵敏度和特异性及各亚型的覆盖率，并且不同亚型扩增效率近似等效，使其能满足血液核酸筛查极其苛刻的要求；其显著的特点是使用廉价的双酶(即含逆转录酶和耐热DNA聚合酶)体系，区别于与Roche公司的r Tth或ZO5酶等单酶体系。显而易见的，摈弃单酶体系原料昂贵的价格因素之外，单酶体系的优化难度与双酶体系的优化难度是不可同日而语的。以往，使用相对廉价的双酶体系用到对灵敏度、特异性、抗污染、多项目有要求的常规血液筛查中被多数人认为是不可行的。
1、本发明提供了一种基于杂交钓取原理，特异性同步捕获提取HBV、HCV、HIV核酸的方法，其特征是选用了与后续扩增检测中一条引物序列相一致的生物素修饰的寡核苷酸作为核酸提取试剂的捕获探针，其优点是既避免了漏检又不干扰PCR检测理论上凡是PCR可以扩增的片段均不会在标本提取这一步由于捕获探针序列设计的缺陷而漏掉，不仅因为用于扩增的引物序列的保守性与特异性经受过严格的筛选及临床实践检验，更重要的是，凡是PCR可以扩增的阳性标本，一定可以为该探针所捕获；另一方面，基于杂交捕获法核酸纯化的最后一步是高温洗脱，难以避免生物素探针与链亲和素包裹的磁珠分离而进入洗脱液，有可能有μM级浓度的探针进入洗脱液，如果探针的序列不是引物部分，就有可能作为冗余的寡核苷酸干扰PCR扩增。反之，充其量不过是PCR反应中引物比例不是等比例而已，这种特定情况下的PCR基本和等比例下的PCR没有区别。另外，本项发明还提供了一种变通的通用捕集方法，即设计一段中间探针，无修饰的普通寡核苷酸(与后续的荧光PCR体系中的一条引物序列相一致)其3’端接有一连串的A如Oligo(d A)18-25，作为中间杂交的主干探针，使用生物素修饰的Oligo(d T)25作为通用杂交捕获探针；中间探针的5’端核酸序列作为特异性识别标本中的病毒核酸的“识别臂”，杂交并捕获病毒核酸，而其3’端的Oligo(d A)18-25作为生物素化的Oligo(d T)25的识别位点，为其所捕获，最后杂交形成的复合体为链亲和素包裹的磁珠所吸附，经过洗涤液A，B，C的依次清洗，除去非特异杂交物及PCR/RT-PCR抑制物诸如糖类，变性蛋白，脂肪，高盐或重金属等杂质，最后磁珠进入洗脱液经过加热，核酸模板从杂交复合体洗脱下来进入洗脱液.而仍吸附着生物素化Oligo(d T)25废磁珠经仪器自动移走，洗脱液即可作为荧光PCR检测的模板。该方法的优点是生物素标记的Oligo(d T)25是一致的，结合效率仅取决于设计的中间探针的杂交效率。本项发明还提供了另一种变通的方法，合成一条包含上述HBV、HCV、HIV特异探针序列的线形排列的寡核苷酸，作为一条三联共同探针，中间可间隔有连接臂如3-8个T或A，生物素的修饰仍位于共同探针的5’端，这样可以省去一些链亲和素包裹磁珠的量，相应可提高磁珠的量至过量，有利于检测灵敏度的进一步提高，尤其适合于磁珠使用量已经饱和的测试(如多项目的提取)，因为磁铁吸附磁珠是有一个饱和度的，多于一定量就无法吸附干净。本项发明并不排除上述方法的组合或复合组合，如合成一条包含上述HBV、HCV、HIV特异探针序列的线形排列的寡核苷酸，其3’端接有一连串的A如Oligo(d A)18-25，作为中间杂交的主干探针，使用生物素修饰的Oligo(d T)25作为通用杂交捕获探针等。
使用上述杂交原理特异性提取纯化的最显著优点在于提高了检测的特异性，避免了PCR的假阳性。虽然PCR作为一种特异性极高的检测方法，但是仍有一定比例的非污染因素造成的假阳性报道，排除了引物序列设计不合理的因素之后，被认为与提取到的模板中含有大量的其它杂核酸有关。而特异性提取方法仅提取所研究的核酸从而避免了干扰因素。另外，该方法基于杂交原理，用于提取富含PCR抑制物质如高血脂、高度溶血、黄疸、甚至肝素化血标本均无干扰；而传统的硅胶膜提取方法由于肝素与核酸相似均为富含负电荷的线形大分子，均易于吸附到硅胶膜上最后洗脱入洗脱液作为模板而抑制PCR/RT-PCR。常规血筛中由于日检测标本多、工作量大，即使PCR假阳性低到万分之一，富含抑制物的标本几率为万分之一，不到几天就会遇到一个，这样既浪费时间用于复测，又浪费血，还有可能由于PCR抑制物存在导致假阴性的发生。本项发明所公开的特异性同步提取方法结合下述的同步扩增检测试剂为血液筛查提供了杂交提取与TaqMan探针法PCR的双重特异性保障，并有效去除了极其罕见标本中可能含有的PCR抑制物，避免假阴性发生。
2、本发明还提供了一种新型RNA外标(即阳性对照)和RNA内对照(竞争性内标)的快速加端生物素修饰引物的PCR构建及纯化方法，尚未见于任何文献报道或实例应用。其特点是快速、高效，RNA制品中没有模板DNA的污染或其污染低到无法检测。用于构建RNA内对照的引物，其5’加端并修饰有生物素，其中一条引物5’加端为附加有T7 RNA聚合酶的转录启动子识别位点序列。可以快速制备RNA内对照，当PCR/RT-PCR获得含有靶序列的DNA后，将链亲和素包裹的磁珠直接加入，结合带有生物素化的PCR产物，弃去液体，用PCR缓冲液洗涤2次后，加入转录缓冲液及T7 RNA聚合酶在37℃反应50-60分钟后用PCR缓冲液稀释所得的转录出的RNA及原先的DNA模板复合物，热变性后于冰上骤冷，DNA模板上带有的生物素标记被牢固结合于链亲和素包裹的磁珠，而转录出的RNA不带有生物素标记而不能结合于磁珠，且由于变性使其与DNA模板完全分开，离心取上清或用磁铁分离磁珠，剩下纯净的RNA制品，可以进一步用乙醇沉淀浓缩纯化。本方法用于构建RNA外标及RNA内对照，只要一份阳性标本提取物，一次PCR/RT-PCR或两次PCR/RT-PCR，加上两个小时的纯化工作，即可制得纯净的RNA制品用作质控。传统的方法为PCR扩增得到片段，纯化后接入载体如T载体，挑阳性克隆提取质粒并将重组质粒酶切线性化，再纯化，进行体外转录，再用DNA酶消化，再纯化RNA。整个过程需要基因工程实验室的诸多设备，需要载体、感受态细胞、限制性内切酶，需要培养细菌，整个流程耗时长。相比之下本发明公开的方法要简捷快速得多，本方法最大的优点还在于提供的RNA制品要远远纯于传统方法。因为短片段的DNA模板消化总是不彻底的，经过多次消化及纯化甚至使用柱法纯化仍无济于事，无RT对照PCR试验仍然检测出数量可观的DNA。而含有DNA的RNA对照很难真实地作为RNA病毒检测的外对照或内对照，因其不能真实反应RT效率；如果以此为基础建立定量对照，则存在定量不准确的风险，因为RNA病毒检测的是其RNA，而定量对照中含有DNA/RNA，势必造成检测不同步趋于失真，而难以作为病毒载量的定量质控。
3、本发明还提出了设计绿色环保型试剂盒的基础---阳性对照和内对照的基因工程构建法或PCR构建法阳性对照的制备和内对照的制备，阳性对照和内对照的单独使用或者混合使用-----根据客户群的要求、仪器设备等硬件条件设计。本发明在生物安全性方面有显著优势。
本发明根据所检测病毒的核酸类型，体外制备无传染性的核酸片段作为试剂盒的阳性对照(RNA外标)及内对照(RNA内标)；阳性对照制备是将含有扩增靶序列的核酸片段(如HBV为含有HBV C区的质粒经HCV为含有HCV 5’NCR区的质粒，HIV为含有HIV GAG区的质粒)经酶切线性化DNA，再经体外转录成RNA，并用DNA酶消化后纯化得到RNA制品。当然可使用本发明所述的方法快速构建，这里只叙述一般的传统方法的使用以强调作为绿色试剂盒的基础不能在试剂盒中引入传染性的因素，尽管其操作人员必须按照规程视为传染性标本的来操作。上述的HBV、HCV、HIV阳性对照既可单独使用，又可混合使用，还可使用基因工程的方法将上述的三个片段组装到一个载体中再线性化，体外转录后根据需要使用其DNA或RNA，或二者混合使用。
内对照采用竞争性内标，也就是与阳性对照一样拥有相同的引物结合区，但引物间隔区的核酸序列或排列不同，使其不能与检测探针(阳性对照，可称为外标探针)结合，但能与内标探针结合。该内对照可通过阳性对照模板的定点突变构建，也可使用嵌段PCR的方法构建。同样，内对照根据检测病毒的核酸类型构建成相应的DNA或RNA，可单独使用，也可混合使用，还可通过基因工程的方法或加端PCR的方法将三个内对照片段组装到一个片段中。总之，根据需要选择最合适的方案，既讲究内对照对整个核酸提取过程、RT过程、PCR扩增检测过程的全程之有效监控，又要讲究它的引入不影响检测的灵敏度；同时还要讲究每个测试内对照的引入量过高则不能真实反应标本受抑制的情况，如轻微抑制看不出；过低则内对照的失败率高，重复性差；一般选择检测灵敏度高2-20倍的内对照量作为监控，具体到实践操作可以有变化。那么具体到应用方案，将适当量的内对照加入到裂解液中参与核酸提取步骤中，这是一种标准的实施方案，但是并不排斥有的用户直接在配置PCR反应液时将内对照加入，而在标本提取过程中并不引入内对照，这种作法也可实现标本提取物中是否含有PCR/RT-PCR抑制物的有效监测，因此也应受到肯定。另外一些用户由于荧光PCR仪为单通道检测波长，无法使用内标探针检测假阴性发生与否，虽然也可应用本发明所提供的试剂盒，但对结果的判定应当谨慎。
4、本发明还提出一种实时同步多项检测的基于TaqMan探针的RT-PCR扩增法，其特点是使用单管的一步法RT-PCR双酶体系试剂，多项检测的项目既含DNA，又含RNA，所选用的抗污染体系为经典的UNG-dUTP系统。所使用的一步法RT-PCR试剂为双酶体系，即含逆转录酶和耐热DNA聚合酶，逆转录酶不耐热，RT温度不能高于60℃，优选方案为45-55℃，尤其是50℃。而该温度下常规的基因工程制备的UNG(如目前市售的绝大多数的UNG)具有降解逆转录出来的含U的DNA(称为U-DNA)，因此不能使用该UNG，优选方案为不耐热的UNG如来自于嗜寒的海洋细菌BMTU3346(热不稳定的UNG/heat-labile UNGEC3.2.2.3Roche-来源于嗜寒菌BMTU3346、USB--源于Gadus morhau、Epicenter--源于Gadus morhau等，这些公司均有产品出售)。其特点是储存于一定基质中长期稳定而一旦在PCR缓冲液中温度为40℃时其半衰期仅两分钟，应用时不需做特定的程序设置，因为在RT-PCR试剂和RNA模板的准备工作中(混和时)该酶就起作用，迅速将上次RT-PCR污染如残留的U-DNA降解，最佳的反应为20--30℃5-20分钟。开始执行RT-PCR时，该UNG迅速失活而不影响RT或PCR。本发明的同步多项检测试剂最突出的优点在于该检测试剂的优秀的灵敏度和其特异性及各亚型的覆盖率并且不同亚型扩增效率近似等效。目前尚无一种报道使用双酶单管RT-PCR体系引入抗污染方案并且能成功地用于多项对灵敏度有要求的同步检测(即有DNA又有RNA)，经检索只有一篇日本罗氏公司关于自动化的多检Z05酶单酶RT-PCR TaqMan体系用于血筛的初步应用报道，而其使用的为单酶体系，其缺点是显而易见的，该体系价格昂贵且为该公司专利所有，难以推广应用；双酶体系由于使用两种廉价酶，由于两种酶各自互成独立体系，最优反应条件各不相同，而灵敏度高的双酶单管RT-PCR体系一直在业界被公认为具有一定难度的课题，同时其相对廉价的成本使得近年来相关学者研究的热点之一。多项同检同样被认为具有挑战性的难题。
本发明优秀的品质很大程度上取决于所选用的HBV引物，HBV TaqMan探针；HCV引物，HCV TaqMan探针；HIV引物，HIV TaqMan探针序列。因此，本发明所公布的引物、探针序列毫无疑问应当受到所申请要求的权利保护之内。
综上所述，本发明在于提出一种测定HIV(艾滋病)、HBV(乙型肝炎)、HCV(丙型肝炎)病毒核酸的试剂盒，包括同步提取HBV-HCV-HIV核酸的磁珠提取试剂及一次性耗材，其中含有去抑制剂、裂解液、磁珠悬液、洗涤液A、洗涤液B、洗涤液C、洗脱液等，和HBV-HCV-HIV核酸扩增试剂，其中含有RT-PCR反应液、探针、酶混合物、阳性对照、阴性对照，和内对照等。匹配仪器可使用上海科华试验仪器系统所制造的KHB DP-1000、KHB DP-2000等，但不局限于这些，可能还有ROCHE的MagNA pure LC仪器、TECAN的与之相当的仪器、ThermoLabsystem公司与之相当的仪器、Beckman-Coulter与之相当的仪器、ABI公司与之相当的仪器等。
上述所提到的裂解液为裂解血清、血浆等体液标本中病毒颗粒的硫氰酸胍溶液，具体为4-6M硫氰酸胍，20-50mM Tris，PH6.0-8.0，1-20％NP-40，1-20％TritonX-100，0.1-10％SDS，0.01-1μM生物素化探针(捕获探针)，1-10％聚合物等。其中捕获探针为5’BIOTIN-acc acc aaa tgc ccc tat-3’(对HBV)(SEQ.ID.NO.28)，5’BIOTIN-agtacc aca agg cct ttcg-3’(对HCV)(SEQ.ID.NO.29)，5’BIOTIN-cta tgt cac ttcccc ttg gtt ctc tc-3’(对HIV)(SEQ.ID.NO.30)，可以委托上海生工或大连宝生物合成，纯度为PAGE或HPLC；所述磁珠悬液为链亲和素包裹的磁珠，具体为含有TWEEN20的超顺磁材料的磁珠，表面包有均匀一层链亲和素，直径为0.1-10μM，含有BSA、NaN3等成分，如E.Merck公司、Roche公司、Invitrogen公司、Toyabo公司、Agowa公司、Chemogen公司、Promega公司、Seradyn公司生产的磁珠；所述洗涤液A、B、C均为含氯化锂的缓冲溶液，具体为洗涤液ALiCI，Tris PH7.0，十二烷基磺酸锂，防腐剂及Tween 20等分散剂，色素如品红或其它染料等，其中LiCI的浓度可以从0.15M-3M，Tris浓度可以是10-100mM，PH可以为6.0-8.0，十二烷基磺酸锂的浓度可以从1％，防腐剂可以是叠氮钠或PROCLIN300、PROCLIN150、硫柳汞、抗生素等，Tween 20的浓度可以从0.001-0.1％；洗涤液B成分与洗涤液A相仿但不含十二烷基磺酸锂，色素不同或不含色素；洗涤液C成分与洗涤液B相仿但LiCI的浓度降低(如为0.1-1M)且不含色素等；所述去抑制剂为含有蛋白酶的醇溶液，去抑制剂含有蛋白酶和甘油等；所述洗脱液为低盐缓冲液或水，洗脱液DEPC处理过的纯化水配制的Tris缓冲液，加有Tween 20等分散剂和EDTA、NaN3、DTT等。
本发明中，标本提取(裂解液中含有)所用的中间探针为5’-acc acc aaa tgc ccc tat ttt ttt agt acc aca agg cct ttc g aaaaaa cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc aaa aaa aaa aaa aaa aaaaaa aaa-3′(SEQ.ID.NO.15)和5’Biotin-Oligo(d T)25(SEQ.ID.NO.16)。
所述的引物乙肝病毒检测引物针对乙型肝炎病毒核心区(C区)的编码基因中的一段基因片段，BF5’-acc acc aaa tgc ccc tat-3’(SEQ.ID.NO.1)，BR5’-ttc tgc gacgcg gcg a-3’(SEQ.ID.NO.2)。丙肝病毒检测引物针对丙型肝炎病毒基因序列的5’非翻译区，两段引物序列为CF5’-cgg gag agc cat agt gg-3’(SEQ.ID.NO.4)，CR5’-agtacc aca agg cct ttc g-3’(SEQ.ID.NO.5)。艾滋病毒检测引物针对HIV gag区的基因序列，两段引物序列为IF5’-gac atc aag cag cca tgc aaa t--3’(SEQ.ID.NO.7)，IR5’-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’(SEQ.ID.NO.8)。
所述探针为Taqman探针，包括内标(即内对照)探针和三种病毒的检测探针，分别由不同的荧光基团标记或相同的荧光基团标记，但是至少内标探针的荧光基团不同于检测探针的荧光基团，而优选的TaqMan探针为TaqMan-MGB探针或非荧光淬灭基团的TaqMan探针，如BHQ-1或BHQ-2等。由于常规的TAMRA淬灭基团为荧光淬灭基团，自身带有荧光，在多重反应中这种荧光干扰会相互叠加，而且其本身为一荧光基团占据了仪器的一个通道，使多重检测少去一重检测；本发明中采用的探针序列为HBV探针为5′FAM(Ned)-cgacga ggc agg acc cct aga aga a-NFQ3′(SEQ.ID.NO.3)；HCV探针为5’FAM(Vic)-ctg cggaac cgg tga gta cac-NFQ-3’(SEQ.ID.NO.6)；HIV探针为5’FAM(Fam)-cca tca atg aggaag ctg cag aat ggg ata-NFQ3’(SEQ.ID.NO.9)；内标探针为ICP5′Vic(Rox)-aac cttgga acc ttg gaa ctg gag aga gaa-NFQ3’(SEQ.ID.NO.14)。
所述RT-PCR反应液为含有d ATP、d CTP、d GTP、d UTP、缓冲液、KCI、防腐剂和稳定剂、上述引物等；所述酶混合物为多酶组份体系，具体含有逆转录酶、DNA聚合酶、RNasin、热不稳定的UNG、RT-PCR促进剂(如热休克蛋白、gp32蛋白等)和酶稳定剂(如各种糖类分子和表面活性剂，DTT，蛋白酶抑制剂)等；具体为RT-PCR反应液buffer中含1.8Mm d NTPs(含d UTP)，3.6mM DTT，3.5mM MgCl2，各0.4μM各引物(BF、BR、CF、CR、IF、IR)等；酶混合物0.6U/μl AMV逆转录酶，0.6U/μl热启动Taq DNA聚合酶，1U/μl RNasin；0.1U/μl UNG(heat-labile)等；探针10μM探针HBV Probe，HCV Probe，HIV Probe，5μM内标探针，稳定剂及缓冲液。
所述阳性对照为含有部分HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA片段的混合物，均为扩增目的基因外侧的一段基因DNA或RNA，其中HBV阳性对照仅由一段DNA不含HBV RNA，HCV阳性片段仅有一段RNA不含HCV DNA，HIV阳性片段仅有一段RNA不含HIV DNA，三者混合物适当稀释后保存于核酸稳定液中作为试剂盒的阳性对照；所述的内对照为竞争性内标RNA，包含有检测项目相同的引物结合区，但与检测项目的探针结合区不同，不能结合检测探针，却能结合内标探针。例如内对照可以是含有一段HIV引物结合区的体外转录RNA，但是探针区域经过突变(PCR突变法或其它基因工程手段)不能识别HIV探针，而可以识别试剂盒中的内标探针，该内对照为RNA，不含DNA；所述的内标探针为一段人工合成的与检测项目毫无关系的寡核苷酸，其5’的TaqMan修饰荧光基团不同任一阳性对照的检测探针的荧光基团，便于区分同一份标本的检测结果和内对照结果，并且要求标本检测结果为阴性时内对照的结果必须为阳性。所述阴性对照为正常献血员的血浆。
本发明试剂盒的标本处理所采用的是磁珠提取法。该技术使用链亲和素磁珠(基于核酸杂交原理)，由于DNA和RNA均有相同的杂交性能，所以一般认为该方法对DNA及RNA有相同或近似的得率，通过多次洗涤后去除杂质，最后将核酸在低盐或水中洗脱下来作为核酸扩增检测的模板。可使用KHB DP-1000或2000仪器，同时也不排除其它自动化仪器上的使用。将该技术应用于本诊断试剂盒后，一方面避免了传统方法中使用酚、氯仿、异戊醇等有毒试剂，另一方面引入机械化操作，高通量自动化操作或半自动化操作，减少了人为操作因素对结果的影响。本领域技术人员通过短时间的培训可以很快掌握其操作流程并领会其技术要领，还可以根据本发明提供的内容，加以少许的修改变通形成新的技术流程及试剂盒，但这些均落入本发明所声称的权利保护范围以内。
本发明的试剂盒中扩增检测所使用的为单管的一步法RT-PCR TaqMan双酶体系，该技术采用逆转录酶如AMV或MMLV或SuperscriptI/SuperscriptII/SuperscriptIII或Ominiscript，耐热DNA聚合酶采用Taq酶或金牌Taq酶或所谓的热启动Taq酶(如带有其单克隆抗体的或化学修饰的或配基寡核苷酸预先失活的Taq酶)，还可选用其它耐热聚合酶如Tfl酶等。选用的PCR buffer为TRIS-HCI或TRIS-H2SO4或TRIS-HOAc或Good’s缓冲液Bicine、Tricine，含有氯化钾，还可含有硫酸铵、二甲亚砜、甲酰胺、甘油、TMAC、尿素、gp32蛋白、甜菜碱、牛血清白蛋白、非离子表面活性剂、TWEEN-20、TRITON X-100、NP-40、Brij-35、聚乙二醇、PVP、DTT、Aptamer、鱼精蛋白、HSA、SSB、Alpha Casine、拓扑异构酶1和2、蔗糖、甘露糖、山梨醇、海藻糖、阿拉伯糖、聚蔗糖、糖原、明胶、鲑精DNA、小牛胸腺DNA、rRNA、tRNA、PolyA RNA、OLIGO(dT)、自行合成剂MP等附加剂。
本发明设计的用于实时同步多项检测、基于TaqMan探针的RT-PCR扩增法，其特点是设计引物和探针序列特征为艾滋病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒所特有。其中，乙肝病毒的两段引物序列为BF5’-acc acc aaa tgc ccc tat-3’(SEQ.ID.NO.1)，BR5’-ttctgc gac gcg gcg a-3’(SEQ.ID.NO.2)，探针采用Taqman探针类型，即在探针碱基两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团，HBV探针序列为5′FAM(Ned)-cga cga ggc agg acccct aga aga a-NFQ3′(SEQ.ID.NO.3)。
丙型肝炎病毒的两段引物序列为CF5’-cgg gag agc cat agt gg-3’(SEQ.ID.NO.4)，CR5’-agt acc aca agg cct ttc g-3’(SEQ.ID.NO.5)，探针采用Taqman探针类型，即在探针碱基两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团，HCV探针序列为5’FAM(Vic)-ctg cgg aac cgg tga gta cac-NFQ-3’(SEQ.ID.NO.6)。
艾滋病毒的两段引物序列为IF5’-gac atc aag cag cca tgc aaat--3’(SEQ.ID.NO.7)，IR5’-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’(SEQ.ID.NO.8)。探针采用Taqman探针，即在探针碱基两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团。Taqman探针序列为5’FAM(Fam)-cca tca atg agg aag ctg cag aat ggg ata-NFQ3’(SEQ.ID.NO.9)。内标探针为ICP5′Vic(Rox)-aac ctt gga acc ttg gaa ctg gag agagaa-NFQ3’(SEQ.ID.NO.14)。
在PCR扩增时，荧光PCR仪对每个反应管产生的荧光信号进行检测，信号强度超过检测器阀值的报告为阳性，此时的PCR扩增循环次数(称为CT)与标本中模板含量有负对数的关系，为仪器所自动纪录。实时荧光PCR仪可实现标本模板扩增整个过程的荧光信号变化图，可以十分形象地判断标本的阴、阳性并能区分其强弱。
由于核酸检测操作复杂，整个流程易受多种因素影响而可能使扩增失败，使试剂盒操用人员可能由此得出检测标本为阴性的错误结论。为避免此种情形的发生，必须在每个检测管中设立对照即内对照，这样即使由于极罕见的错误如某一标本管忘加模板了，内对照即可监测出，或者PCR仪某一孔温度效率有问题，内对照也可监测出来。
本发明的试剂盒最优组成中使用内对照质控系统，即在裂解液中加入特定序列的内对照RNA，与标本共同经过裂解、纯化、逆转录、扩增、TaqMan检测各步骤。该内对照序列含一与待测标本无关的核酸片断(如完全人工设计的随即序列片断或检测项目探针序列的重排或一段质粒如PUC18序列等)，两端含试剂盒中所用的引物序列，故可与待测标本共用同一对引物扩增。所用内对照探针为特异性针对该段无关序列的Taqman探针。如果试验结果为标本、内对照均为阴性，则表明试验失败，试验结果无效；试验结果的其它情形则可以发生而且试验结果有效。不含内对照的试剂盒尽管缺少了一道质控标准，但不影响正常使用。
本发明的试剂盒作为一种定性检测的试剂，但并不排除可以作为定量检测的试剂。由于本发明所采用的方法为TaqMan PCR，只需引入外标准品即可成为定量分析的试剂盒，虽然血液核酸筛查的意义在于定性分析，侧重于试剂的灵敏度和特异性；临床检测及药物疗效监控则侧重于定量，载量试验考究定量的准确性。
本发明的试剂盒需配合核酸磁珠提取仪及荧光PCR仪使用。
本发明具有以下几方面的优势(1)封闭性检测，自动化程度高，减少了人工操作，避免了可能的污染和人为的误差；(2)多种核酸病毒的同步提取，同步实时检测；(3)灵敏度高，特异性好，精密度高，稳定性好，便于操作；(4)适用于大规模高通量的血液筛查，如血液中心和血液制品生产企业开展核酸筛查，也可适用于大容量高效率的临床核酸检验。(5)整个流程时间短，能效比高。96个测试仅几个小时就快速完成并报告可信度极高的结果。
图1为Streptavidin磁珠捕获核酸原理图。
其中(A)为结合了生物索探针的磁珠结构图；(B)为杂交复合物为Streptavidin磁珠所捕获，杂交复合物-磁珠被磁铁所富集的示意图；(C)为整个杂交捕获磁珠的原理图。
图2为快速的DNA/RNA对照品构建的示意3为快速的内对照DNA/RNA质控品构建的示意图
具体实施例方式
实施例1 生物素修饰引物加端PCR法快速制备内对照及阳性对照(绿色环保型试剂盒的基础)，1、HIV内对照及阳性对照的制备如下1.1阳性对照的快速构建委托上海生工合成以下引物，序列为5’BIOTIN-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG gac atc aag cag cca tgc aaa t-3’(5’端斜体部分为T7 RNA pol启动子区，3’端为HIV GAG区的上游引物)(SEQ.ID.NO.10)5’BIOTIN-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’(HIV GAG区的下游引物)(SEQ.ID.NO.11)取临床上HIV核酸强阳性的标本一份(或含HIV GAG基因的质粒一份)，用QIAamp ViralRNA Mini Kit(QIAGEN公司)提取病毒核酸，严格按其使用说明书要求操作。抽提产物经本发明建立的一步法RT-PCR试剂，用上述两条引物扩增，按下述循环参数操作50℃30分钟---94℃4分钟---94℃20秒、55℃20秒、循环30-40次，最后72℃5分钟末延伸。
72℃30秒、可以取部分反应产物电泳检测观察为一条160bp大小的条带。扩增产物中加入十倍体积的1XPCR Buffer，加入100-500μg的链亲和素包裹的磁珠，混匀后室温10分钟，低速离心去上清，加入1XPCR Buffer 400μl洗涤磁珠2次，收集磁珠，使用RiboMAXTM Large ScaleRAN Production Systems-T7试剂盒(Promega公司)中的转录试剂如NTPs、Rnasin、DTT、转录缓冲液、T7 RNA Pol按照说明书加样后，37℃转录1小时，取出后同样以1XPCRBuffer稀释，但不洗涤而需要变性处理，可采用90℃热变性或NaOH变性还可选用硫氰酸胍变性，最后离心将结合在磁珠上的模板DNA去除，取其上清于一新的洁净离心管中，加入无水乙醇沉淀RNA，将转录基质如NTPs等去除干净，溶于RNA保护剂中。当然还可使用DNA酶进一步消化。所得到的RNA即为HIV RNA阳性对照母液，将其梯度稀释于一定的液体中即可参与核酸提取、RT反应、PCR TaqMan扩增检测全过程，作为试剂盒的生物安全的绿色的阳性对照。
1.2内对照的构建以上述构建的阳性对照DNA为基础(也可以一份临床上HIV核酸强阳性的标本为基础)，委托上海生工合成以下引物，序列为5’-AAC CTT GGA ACC TTG GAA CTG GAG AGA GAA gagtgcatccagtgcatgcag-3’(SEQ.ID.NO.12其5’端为HIV检测探针序列重排而来，与检测探针有相同的GC％，相似的Tm值；3’端为HIV阳性对照上毗邻检测探针3’端位置的核酸序列)5’-TTC TCT CTC CAG TTC CAA GGT TCC AAG GTT tct ctt taa tta aca ttt gc-3’(SEQ.ID.NO.13其5’端与SEQ.ID.NO.12的5’端互补；3’端与HIV阳性对照上毗邻检测探针5’端位置的核酸序列互补)以阳性对照DNA为PCR模板，分别以SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.13为一对引物和SEQ.ID.NO.11、SEQ.ID.NO.12为另一对引物去扩增，使用的循环参数为94℃2分钟---94℃10秒、45℃15秒、循环20次，最后72℃5分钟末延伸。
72℃10秒、将上述两种扩增产物纯化后混和并梯度稀释，分别作为下一轮PCR的模板。该轮PCR使用SEQ.ID.NO.10和SEQ.ID.NO.11作为引物对扩增，程序同上，循环数增加到30-40个。此轮扩增产物即为内对照DNA，可以取部分产物电泳检测观察为一条160bp(含有的HIVDNA134BP，另含T7RNA启动子序列27BP)大小的条带。同样其磁珠纯化、转录、保存均同上述的阳性对照(RNA)，最后制备得HIV内对照RNA纯品。可参考的HIV序列如下，可参考的原理图如附图3。
gaca tcaagcagcc atgcaaatgt taattaaagagac catcaatgag gaagctgcag aatgggatagagtgcatcca gtgcatgcag ggcctattgc accaggccag atgagagaac caaggggaag tgacatag(SEQ.ID.NO.25)2、HCV内对照及阳性对照的制备如下2.1阳性对照的快速构建委托上海生工合成以下引物，序列为5’BIOTIN-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG cgg gag agc cat agt gg-3’(5’端斜体部分为T7 RNA pol启动子区，3’端为HCV NCR区的上游引物)(SEQ.ID.NO.17)5’BIOTIN-agt acc aca agg cct ttc g-3’(HCV NCR区的下游引物)(SEQ.ID.NO.18)取临床上HCV核酸强阳性的标本一份(或含HCV 5’NCR的质粒一份)，用QIAamp ViralRNA Mini Kit(QIAGEN公司)提取病毒核酸，严格按其使用说明书要求操作。抽提产物经本一步法RT-PCR试剂，用上述两条引物扩增，按下述循环参数操作50℃30分钟---94℃4分钟---94℃20秒、50℃20秒、循环30-40次，最后72℃5分钟末延伸。
72℃30秒、可以取部分反应产物电泳检测观察为一条187bp亮带。同1.1操作制备得到生物安全的绿色的阳性对照。
2.2内对照的构建以上述构建的阳性对照DNA为基础，委托上海生工合成以下引物，序列为5’-AAC CTT GGA ACC TGG ACC GGG CGGAATTGCCAGGACGACCGGG-3’(SEQ.ID.NO.19其5’端为HCV检测探针序列重排而来，与检测探针有相同的GC％，相似的Tm值；3’端为HCV阳性对照上毗邻检测探针3’端位置的核酸序列)5’-CCC GGT CCA GGT TCC AAG GTT accactatggctctcc-3’(SEQ.ID.NO.20其5’端与SEQ.ID.NO.19的5’端互补；3’端与HCV阳性对照上毗邻检测探针5’端位置的核酸序列互补)以阳性对照DNA为PCR模板，分别以SEQ.ID.NO.17、SEQ.ID.NO.20为一对引物和SEQ.ID.NO.18、SEQ.ID.NO.19为另一对引物去扩增，使用的循环参数为94℃2分钟---94℃10秒、45℃15秒、循环20次，最后72℃5分钟末延伸。
72℃10秒、将上述两种扩增产物纯化后混和并梯度稀释，分别作为下一轮PCR的模板。该轮PCR使用SEQ.ID.NO.17和SEQ.ID.NO.18作为引物对扩增，程序同上，循环数增加到30-40个。此轮扩增产物即为内对照DNA，可以取部分产物电泳检测观察为一条187bp大小的条带。同样其磁珠纯化、转录、保存均同上述的阳性对照(RNA)，最后制备得HCV内对照RNA纯品。可参考的HCV序列如下，可参考的原理图如附图3。
C GGGAGAGCCA TAGTGGTCTG CGGAACCGGT GAGTACACCG GAATTGCCAGGACGACCGGG TCCTTTCTTG GATCAACCCG CTCAATGCCT GGAGATTTGG GCGTGCCCCCGCGAGACTGC TAGCCGAGTA GTGTTGGGTC GCGAAAGGCC TTGTGGTACT(SEQ.ID.NO.26)3、HBV内对照及阳性对照的制备如下3.1阳性对照的快速构建委托上海生工合成以下引物，序列为5’AGG GAG acc acc aaa tgc ccc tat-3’(SEQ.ID.NO.21)(5’端斜体部分为无关序列，防止DNA降解从5’开始致使阳性对照的引物结合区降解，3’端为HBV的上游引物)5’AGG GAG ttc tgc gac gcg gcg a-3’(SEQ.ID.NO.22)(5’端斜体部分为无关序列，3’端为HBV的下游引物)
取临床上HBV核酸强阳性的标本一份(或含HBV DNA的质粒一份)，用QIAamp ViralMini Kit(QIAGEN公司)提取病毒核酸，严格按其使用说明书要求操作。抽提产物经本试验室建立的PCR试剂，用上述两条引物扩增，按下述循环参数操作94℃2分钟---94℃20秒、50℃20秒、循环30-40次，最后72℃5分钟末延伸。
72℃30秒、可以取部分反应产物电泳检测观察为一条131bp亮带。使用胶回收纯化试剂盒将电泳条带回收纯化即为HBV阳性对照母液，以DNA/RNA保存液梯度稀释制备得到生物安全的绿色稳定、合适浓度的阳性对照。
3.2内对照的构建以上述构建的阳性对照DNA为基础，委托上海生工合成以下引物，序列为5’-TACGACGACGACGACGACGACGAGA gaactccc tcgcctcgc-3’(SEQ.ID.NO.23其5’端为HBV检测探针序列重排而来，与检测探针有相同的GC％，相似的Tm值；3’端为HBV阳性对照上毗邻检测探针3’端位置的核酸序列)5’-TCTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTA tctaacaacagtagtttc-3’(SEQ.ID.NO.24其5’端与SEQ.ID.NO.23的5’端互补；3’端与HBV阳性对照上毗邻检测探针5’端位置的核酸序列互补)以阳性对照DNA为PCR模板，分别以SEQ.ID.NO.21、SEQ.ID.NO.24为一对引物和SEQ.ID.NO.23、SEQ.ID.NO.22为另一对引物去扩增，使用的循环参数为94℃2分钟---94℃10秒、45℃15秒、循环20次，最后72℃5分钟末延伸。
72℃10秒、将上述两种扩增产物纯化后混和并梯度稀释，分别作为下一轮PCR的模板。该轮PCR使用SEQ.ID.NO.21和SEQ.ID.NO.22作为引物对扩增，程序同上，循环数增加到30-40个。此轮扩增产物即为内对照DNA，可以取部分产物电泳检测观察为一条131bp大小的条带。使用胶回收纯化试剂盒将电泳条带回收纯化即为HBV内对照DNA母液，以本公司的DNA/RNA保存液梯度稀释制备得到生物安全的绿色稳定、合适浓度的HBV内对照DNA。可参考的HBV序列如下，可参考的原理图如附图3。
tatagaccac caaatgcccc tatcttatca acacttccgg aaactactgttgttagacga cgaggcagga cccctagaag aagaactccc tcgcctcgca gacgaaggtctcaatcgccg cgtcgcagaa gatctcaatc
(SEQ.ID.NO.27)实施例2 标本处理单元核酸提取的磁珠法及试剂配制基于杂交原理的标本处理单元试剂组成包括裂解液4.8M硫氰酸胍，50mM Tris，PH7.0，NP-40，Triton X-100，SDS，生物素化探针，聚合物等。其中捕获探针为5’BIOTIN-acc acc aaa tgc ccc tat-3’(HBV)5’BIOTIN-agt acc aca agg cct ttc g-3’(HCV)5’BIOTIN-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’(HIV)磁珠悬液1mg/ml链亲和素包裹的磁珠，含有防腐剂及Tween 20等分散剂洗涤液ALiCI，Tris PH7.0，十二烷基磺酸锂，防腐剂及Tween 20等分散剂，色素等洗涤液BLiCI，Tris PH7.0，防腐剂及Tween 20等分散剂，色素等洗涤液CLiCI，Tris PH7.0，防腐剂及Tween 20等分散剂，色素等去抑制剂含有蛋白酶和甘油等洗脱液DEPC处理过的纯化水配制的Tris缓冲液，加有Tween 20等分散剂和EDTA、NaN3、DTT等内参照约含有40000拷贝/ml内参照RNA的溶液，使用时将其以1∶20的比例加入到裂解液中，在裂解液中的内对照的浓度约为2000拷贝/ml，每个测试加入0.1ml的裂解液也就是200拷贝内对照参与提取。扩增由于仅取1/5的模板量参与RT-PCRTaqMan检测，所以每个检测管中内对照RNA的参入量低于40拷贝。
操作流程取六块专用96孔板(试剂盒提供)，编号为①②③④⑤⑥。
在板①中用排枪或普通移液器加入20μl去抑制剂，加入待测标本血清或血浆100μl，反复吸打1次左右，每加一个标本换一个吸头，注意应使用带滤芯的吸头；最后加入裂解液100μl。
在板②中用排枪或普通移液器加入100μl磁珠悬液，注意使用磁珠悬液前一两分钟将其上下颠倒数次直到磁珠分散均匀不形成任何肉眼可见的沉淀为止。
在板③中用排枪或普通移液器加入200μl洗涤液A；板④中加入200μl洗涤液B；板⑤中加入200μl洗涤液C；板⑥中加入80μl洗脱液。
将上述六块板分别按编号顺序移入KHB DP-2000仪器操作舱的1-6号位，并在第4位的板④上移入专用板的深孔Tip Comb。
启动KHB DP-2000仪上的“Start”键，使其执行程序。
运行大约需要70分钟，结束后取出板①-⑥，其中板⑥中的液体即为核酸模板，板①-⑤为废板，经消毒后统一废弃。
实施例3 核酸扩增检测单元单管的双酶一步法RT-PCR TaqMan探针多检体系的模式及试剂配制核酸扩增检测单元采用荧光TaqMan PCR，要求配合荧光PCR仪使用。其组份包括如下RT-PCR反应液buffer中含1.8Mm d NTPs(含d UTP)，3.6mM DTT，3.5mM MgCl2，引物BF、BR、CF、CR、IF、IR各0.4μM。
酶混合物0.6U/μl AMV逆转录酶，0.6U/μl热启动Taq DNA聚合酶，1U/μl RNasin；0.1U/μl UNG(heat-labile)等。
探针10μM探针HBV Probe，HCV Probe，HIV Probe，5μM内标探针，稳定剂及缓冲液。
试剂配比及配制按照每测试RT-PCR反应液∶酶混合物∶探针＝8∶6∶1的比例配制成15μl/测试，加入核酸模板15μl即可上机扩增实时检测。
以ABI7500为例，仪器的扩增参数设置如下循环参数设定(可参照各类仪器的操作软件进行设置)
实施例4 检测模式之一的应用根据实际实验硬件条件，本实例的用户所使用的荧光PCR仪为双通道的MJ Opticon2荧光PCR仪，优选的检测探针均用FAM荧光标记，内标探针使用HEX标记，内对照优选加入到RT-PCR试剂配制中而不在裂解液里加入。而RT-PCR/PCR反应液中仅含各个检测项目的引物，探针则每个项目为该项目的检测探针和内标探针的混合物，内对照选用包含三个检测项目引物结合区、中间探针结合区为内标探针结合序列的共同的内对照RNA。
待测标本编号为P1，P2，P3..PN，另有2个对照品(阴性对照和阳性对照)参与平行实验。待测标本中含有很低拷贝数的HBV DNA或HCV RNA或HIV RNA。其中弱阳性标本P1为HBV DNA 1000拷贝/ML、P2为HCV RNA 1000拷贝/ML、P3为HIV RNA 1000拷贝/ML、P4系P1用阴性血浆十倍稀释而来，P5系P2用阴性血浆十倍稀释而来，P6系P3用阴性血浆十倍稀释而来；P7系P1用阴性血浆二十倍稀释而来，P8系P2用阴性血浆二十倍稀释而来，P9系P3用阴性血浆二十倍稀释而来；P10系P1用阴性血浆四十倍稀释而来，P11系P2用阴性血浆四十倍稀释而来，P12系P3用阴性血浆四十倍稀释而来。
结果检测标本的内对照均为阳性，而HBV标本在载量为1000拷贝/ML、100拷贝/ML、50拷贝/ML、25拷贝/ML时均为阳性，而阴性对照、稀释血浆等检测结果为阴性。HCV标本在载量为1000拷贝/ML、100拷贝/ML、50拷贝/ML时均为阳性，而25拷贝/ML、阴性对照、稀释血浆等检测结果为阴性。HIV标本在载量为1000拷贝/ML、100拷贝/ML、50拷贝/ML、25拷贝/ML时均为阳性，而阴性对照、稀释血浆等检测结果为阴性。
实施例5 检测模式之二的应用本检测模式为本发明的最佳体现选用四色乃至五色的荧光PCR仪如ABI7500，检探针分别用FAM、VIC、NED荧光标记，内标使用ROX标记。内对照在裂解液里加入。T-PCR反应液中含各个检测项目的引物，探针含各个项目的检测探针和内标探针。内对照选用包含HIV引物结合区、中间探针结合区为内标探针结合序列的内对照RNA。标本同实施例3，实验结果也与实施例3相同，但质控更为严格，操作更为方便，检测模式与标本提取更加匹配，检测通量更高。
实施例6 检测模式之三的应用本检测模式为实施例3与4的折衷方案仪器可用双色荧光PCR仪，检测的通量及严谨的质控与实施例4相同，但一旦出来阳性扩增结果，不能区分哪个检测项目为阳性。其优选的要点为检测探针均用FAM荧光标记，内标使用HEX或VIC或NED或JOE或TET等标记。内对照在裂解液里加入。RT-PCR反应液中含各个检测项目的引物，探针含各个项目的检测探针和内标探针。内对照选用包含HIV引物结合区、中间探针结合区为内标探针结合序列的内对照RNA。
标本同实施例3，实验结果也与实施例3相同，质控严格，操作方便，检测模式与标本提取相匹配，检测通量高，但是HBV阳性或HCV阳性或HIV阳性或两种同时阳性乃至三种共同阳性均不能知道。然而这在血液筛查中并不算得什么缺点，因为血筛的目的在于筛选出不合格的血液，不管哪种病毒核酸阳性或联合阳性均为淘汰的血液。
实施例7 检测模式之四的应用合成下列核酸作为HBV、HCV、HIV、内对照RNA的共同中间(捕获)探针5’-acc acc aaa tgc ccc tat ttt ttt agt acc aca agg cct ttc g aaaaaa cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc aaa aaa aaa aaa aaa aaaaaa aaa-3′(99bp)纯度PAGE或HPLC(SEQ.ID.NO.15)生物素化探针5’Biotin-Oligo(d T)25(SEQ.ID.NO.16)。
上述两种探针同时配制在裂解液中，且有固定的比例，共同中间(捕获)探针的量的优化对提取灵敏度有决定性的作用。
试剂均同本发明的实施例2.1检测流程同实施例2(标本提取)，检测模式按实施例4，结果与实施例4检测结果完全相同。
根据本发明的公开内容，本领域的熟练技术人员无需过多实验即可对本发明所要求保护的血液筛查项目的试剂盒进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对本发明进行描述，但并不构成对本发明的限制。本领域的熟练技术人员用显而易见的相似替代物或改造，或用某些在化学上或生物上结构功能相关的制剂替代在此描述的制剂，或对本发明的有关内容进行变动，但不超出本发明的精神、范围和思想，均落入本发明要求保护的范围。
序列表SEQ.ID.NO.15’-acc acc aaa tgc ccc tat-3’，SEQ.ID.NO.25’-ttc tgc gac gcg gcg a-3’，SEQ.ID.NO.35′FAM-cga cga ggc agg acc cct aga aga a-NFQ3′，SEQ.ID.NO.45’-cgg gag agc cat agt gg-3’，SEQ.ID.NO.55’-agt acc aca agg cct ttc g-3’，SEQ.ID.NO.65′FAM-ctg cgg aac cgg tga gta cac-NFQ3′，SEQ.ID.NO.75′-gac atc aag cag cca tgc aaa t-3’，SEQ.ID.NO.85′-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’，SEQ.ID.NO.95′Vic(Rox)-aac ctt gga acc ttg gaa ctg gag aga gaa-NFQ3’，SEQ.ID.NO.105’BIOTIN-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG gac atc aag cag cca tgc aaa t-3’，SEQ.ID.NO.115’BIOTIN-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’，SEQ.ID.NO.125’-AAC CTT GGA ACC TTG GAA CTG GAG AGA GAA gagtgcatccagtgcatgcag-3’，SEQ.ID.NO.135’-TTC TCT CTC CAG TTC CAA GGT TCC AAG GTT tct ctt taa tta aca ttt gc-3’，SEQ.ID.NO.145′Vic(Rox)-aac ctt gga acc ttg gaa ctg gag aga gaa-NFQ3’，
SEQ.ID.NO.155’-acc acc aaa tgc ccc tat ttt ttt agt acc aca agg cct ttc g aaaaaa cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc aaa aaa aaa aaa aaa aaaaaa aaa-3′，SEQ.ID.NO.165’Biotin-Oligo(d T)25SEQ.ID.NO.175’BIOTIN-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG cgg gag agc cat agt gg-3’SEQ.ID.NO.185’BIOTIN-agt acc aca agg cct ttc g-3’SEQ.ID.NO.195’-AAC CTT GGA ACC TGG ACC GGG CGGAATTGCCAGGACGACCGGG-3’，SEQ.ID.NO.205’-CCC GGT CCA GGT TCC AAG GTT accactatggctctcc-3’，SEQ.ID.NO.215’AGG GAG acc acc aaa tgc ccc tat-3’，SEQ.ID.NO.225’AGG GAG ttc tgc gac gcg gcg a-3’，SEQ.ID.NO.235’-TACGACGACGACGACGACGACGAGA gaactccc tcgcctcgc-3’，SEQ.ID.NO.245’-TCTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTA tctaacaacagtagtttc-3’，SEQ.ID.NO.25gaca tcaagcagcc atgcaaatgt taattaaagagac catcaatgag gaagctgcag aatgggatagagtgcatcca gtgcatgcag ggcctattgc accaggccag atgagagaac caaggggaag tgacatagSEQ.ID.NO.26C GGGAGAGCCA TAGTGGTCTG CGGAACCGGT GAGTACACCG GAATTGCCAGGACGACCGGG TCCTTTCTTG GATCAACCCG CTCAATGCCT GGAGATTTGG GCGTGCCCCCGCGAGACTGC TAGCCGAGTA GTGTTGGGTC GCGAAAGGCC TTGTGGTACTSEQ.ID.NO.275′FAM-cca tca atg agg aag ctg cag aat ggg ata-NFQ3’，SEQ.ID.NO.28
5’BIOTIN-acc acc aaa tgc ccc tat-3’，SEQ.ID.NO.295’BIOTIN-agt acc aca agg cct ttcg-3’，SEQ.ID.NO.305’BIOTIN-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’。
权利要求
1.一种同步扩增检测肝炎及艾滋病毒核酸的方法，其特征在于包括基于杂交原理，选用磁珠作为自动化介质，采用磁珠分离仪进行特异性同步捕获HIV、HBV和HCV病毒核酸的方法，其中，选用与后续扩增检测中一条引物序列相一致的生物素修饰的寡核苷酸作为核酸提取试剂的捕获探针；或者，设计一段中间探针，与后续的荧光PCR体系中的一条引物序列相一致的无修饰的寡核苷酸，在其3’端连接一串Oligo(dA)18-25，作为中间杂交的主干探针，使用生物素修饰的Oligo(dT)25作为通用杂交捕获探针；或者，合成一条包含上述HBV、HCV、HIV特异探针序列的线形排列的寡核苷酸，作为一条三联共同探针，其中间间隔连接3-8个T或A，生物素的修饰仍位于共同探针的5’端。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于还包括RNA外标和RNA内对照的快速加端PCR构建和纯化方法，其中，用于构建RNA内对照或RNA外标的引物，其5’加端并修饰生物素，其中一条引物5’加端为附加有T7 RNA聚合酶的转录启动子识别位点序列，当PCR/PT-PCR获得含有靶序列的DNA后，将链亲和素包裹的磁珠直接加入，结合带有生物素的PCR产物，弃去液体，用PCR缓冲液洗涤2次后，加入转录缓冲液及T7 RNA聚合酶，在37℃反应50-60分钟，然后用PCR缓冲液稀释所得的转录出的RNA及原先的DNA模板复合物，热变性后于冰上骤冷，DNA模板上带有的生物素标记被牢固结合于链亲和素包裹的磁珠，而转录出的RNA不带有生物素标记而不能结合于磁珠，且由于变性使其与DNA模板完全分开，离心取上清或用磁铁分离磁珠，剩下纯净的RNA制品，进一步用乙醇沉淀浓缩纯化。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于还包括试剂盒的RNA外标和RNA内对照的基因工程构建法或PCR构建法；其中，RNA外标制备是将含有扩增靶序列的核酸片断经酶切得到线性化DNA，再经体外转录成RNA，并用DNA酶消化后经纯化得到RNA制品，这里的核酸片段，对于HBV为含有HBV C区的质粒，对于HCV为含有HCV 5’NCR区的质粒，对于HIV为含有HIV GAG区的质粒；上述的HBV、HCV和HIV的阴性对照单独使用或者混合使用，或者使用基因工程方法将上述3个核酸片段组装到一个载体中再线性化，体外转录使用其DNA或RNA，或者2者混合使用；RNA内标采用阳性对照模板的定点突变构建，或使用嵌段PCR方法构建；并根据检测病毒的核酸类型构建成相应的DNA或RNA，单独使用或混合使用，或通过基因工程方法或加端PCR方法将3个内对照片段组装到一个片段中。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于还包括实时同步多项检测的基于TaqMan探的RT-PCR扩增法，其中使用单管的一步法RT-PCR双酶体系试剂，多项检测的项目含有DNA和RNA，所选用的抗污染体系的为经典的UNG-dUTP系统；这里的双酶体系为含有逆转酷和耐热DNA聚合酶。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述构建RNA外标和RNA内对照的引物如下(1)HIV的阳性对照引物为SEQ.ID.NO.10和SEQ.ID.NO.11，内对照引物为SEQ.ID.NO.12和SEQ.ID.NO.13；(2)HCV的阳性对照引物为SEQ.ID.NO.17和SEQ.ID.NO.18，内对照引物为SEQ.ID.NO.19和SEQ.ID.NO.20；(3)HBV的阳性对照引物为SEQ.ID.NO.21和SEQ.ID.NO.22，内对照引物为SEQ.ID.NO.23和SEQ.ID.NO.24。
6.一种检测艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎核酸的试剂盒，其特征在于包含去抑制剂、裂解液、磁珠悬液、洗涤液、洗脱液、内对照、RT-PCR反应液、酶混合物、荧光探针、阳性对照、阴性对照，其中，所述的去抑制剂为含蛋白酶的醇溶液；所述裂解液为裂解血清、血浆标本中病毒颗粒的硫氰酸胍溶液；所述洗涤液为含氯化钠的溶液；所述洗脱液为低盐缓冲液或水；所述磁珠悬液含链亲和素包裹磁珠；所述RT-PCR反应液含HBV、HCV、HIV引物和dNTP及缓冲盐溶液；所述荧光探针为Taqman探针；所述酶混合物为多酶组份体系；所述阳性对照为含有HBV、HCV、HIV扩增目的基因外侧的一段DNA或RNA；所述阴性对照为正常献血员的血浆；所述内对照为竞争性内标RNA，包含有检测项目相同的引物结合区，但与检测项目的探针结合区不同，不能结合检测探针却能结合内标探针；其中PT-PCR反应液中HBV引物为5’-acc acc aaa tgc ccc tat-3’，5’-ttc tgc gac gcg gcg a-3’，HBV的Taqman探针为5′FAM-cga cga ggc agg acc cct aga aga a-NFQ3′，HCV引物为5’-cgg gag agc cat agt gg-3’，5’-agt acc aca agg cct ttc g-3’，HCV的Taqman探针为5′FAM-ctg cgg aac cgg tga gta cac-NFQ3′，HIV引物为5′-gac atc aag cag cca tgc aaa t-3’，5′-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’，HIV的Taqman探针为5′FAM-cca tca atg agg aag ctg cag aat ggg ata-NFQ3’，内标探针为SEQ.ID.NO.14。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于使用与后续PCR检测引物一致的生物素化寡核苷酸序列作为探针以杂交原理去同步提取纯化血清或血浆标本中的HBV DNA、HCVRNA、HIV RNA的磁珠法标本处理试剂。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于使用逆转录酶、耐热DNA聚合酶双酶单管一步法RT-PCR的TaqMan多项同检体系，检测项目包含DNA及RNA病毒；含有UNG-dUTP防污染组分；还含有内对照作为每个测试的全程监测质控。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于使用生物素修饰的加端引物快速构建、纯化内对照RNA、阳性对照RNA纯RNA。
10.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所说的裂解液中含有标本提取所用的生物素探针对于HBV为5’BIOTIN-acc acc aaa tgc ccc tat-3’，对于HCV为5’BIOTIN-agt acc aca agg cct ttc g-3’，对于HIV为5’BIOTIN-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’。
11.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所说裂解液中含有标本提取所用的中间探针5’-acc acc aaa tgc ccc tat ttt ttt agt acc aca agg cct ttc g aaaaaa cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc aaa aaa aaa aaa aaa aaaaaa aaa-3′(SEQ.ID.NO.15)和5’Biotin-Oligo(dT)25(SEQ.ID.NO.16)。
12.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于裂解液的组成为4-6M硫氰酸胍，20-50mM Tris，PH6.0-8.0，1-20％NP-40，1-20％Triton X-100，0.1-10％SDS，0.01-1μM生物素化探针，1-10％聚合物；其中捕获探针为5’BIOTIN-acc acc aaa tgc ccc tat-3’对HBV，5’BIOTIN-agt acc aca agg cct ttcg-3’(对HCV)，5’BIOTIN-cta tgt cacttc ccc ttg gtt ctc tc-3’(对HIV)，纯度为PAGE或HPLC；所述磁珠悬液为含有TWEEN20的超顺磁材料的磁珠，表面包有均匀一层链亲和素，直径为0.1-10μM，含有BSA、NaN3成分，所述去抑制剂为含有蛋白酶的醇溶液；所述洗脱液为低盐缓冲液或水，洗脱液DEPC处理过的纯化水配制的Tris缓冲液，加有Tween 20分散剂和EDTA、NaN3和DTT。
13.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述RT-PCR反应液为buffer中含1.8Mm d NTPs，3.6mM DTT，3.5mM MgCl2，引物BF、BR、CF、CR、IF、IR各0.4μM。
14.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述的酶混合液含有逆转录酶、DNA聚合酶、RNasin、热不稳定的UNG、RT-PCR促进剂和酶稳定剂。
全文摘要
本发明属诊断试剂核酸诊断技术领域，具体为一种同步提取并同步扩增均相检测肝炎和艾滋病毒核酸的方法和试剂盒。该方法包括以磁珠作为自动化介质，特异性同步捕获HBV、CHV、HIV核酸的方法。RNA外标和RNA内标快速加端生物素引物的PCR构建和纯化，实时同步多项检测的基于Tagman探针的T－PCR扩增法等。相应的试剂盒包括去抑制剂、裂解液、磁珠悬液、洗涤液、洗脱液、内对照、RT－PCR反应液、酶混合物、荧光探针、阳性对照、阴性对照。本发明的的特点是单管操作，封闭性检测，自动化程度高，多种病毒核酸同步提取，同步实时检测；灵敏度高，特异性好，精密度高；适用于大规模血液筛查和大容量的临床检测。
文档编号C12Q1/70GK1940087SQ200610030229
公开日2007年4月4日 申请日期2006年8月18日 优先权日2006年8月18日
发明者周科隆, 华锦彪, 王缦 申请人:上海科华生物工程股份有限公司