专利名称：甘油通道基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及甘油通道(Glycerol Channel)基因及其用途，特别是涉及制造醇厚感、柔滑感等优异的酒类的酿造酵母、使用该酵母制造的酒类及其制造方法等。更具体地说，本发明涉及通过控制编码酿造酵母甘油通道Fps1p的基因FPS1，特别是啤酒酵母中特征性的nonScFPS1基因的表达量，可控制产品的醇厚感、柔滑感等的酵母及使用该酵母的酒类的制造方法等。
背景技术：
甘油除作为甜味成分以外还对酒的醇厚感、柔滑感等起作用，是重要的呈味物质之一。
至今为止，一直在进行以提高酒中甘油含量为目的的甘油生产量高的酵母的育种。为对酵母施行突变处理，高效分离甘油生产量高的酵母，已有关于以烯丙醇或吡唑抗性为指标的方法(日本特公平7-89901号公报)、以甘油一氯茚满(ヒドリン)抗性为指标的方法(日本特开平10-210968号公报)、以耐盐性为指标的方法(日本特开平7-115956号公报)、以氨基酸类似物抗性为指标的方法(J.Ferment.Bioeng.，80，218-222(1995))的报道。
还有，在通过利用基因操作技术的酵母育种方法中，Saccharomycescerevisiae的3-磷酸甘油脱氢酶GPD1在啤酒酵母、葡萄酒酵母等中高表达的实例的报道(FEMS yeast Res.2225-232(2002)、Appl Environ Microbiol.65143-149(1999))。
发明内容
如上所述，为使产品中甘油含量增大，获取了突变株，但其结果显示了未曾预期的发酵延迟和不受欢迎的香味成分等的增加，所以，作为实用性酵母还存在着问题。由此，非常期望有既不影响发酵速度、不损害产品品质，又能生产充分量甘油的酵母育种方法。
本发明者等为解决上述课题不断锐意研究的结果，从啤酒酵母中成功地鉴定·分离出了编码已知蛋白质中起有益作用的甘油通道的基因。另外，制备了将所得基因导入酵母并使其表达的转化酵母，确认了甘油生成量的增加，从而完成了本发明。
即，本发明涉及啤酒酵母中特征性存在的新型甘油通道基因、该基因编码的蛋白质、调节了该基因表达的转化酵母、通过使用调节了该基因表达的酵母，以控制产品中甘油量的控制方法等。具体地说，本发明提供如下所示的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、导入了该载体的转化酵母、使用该转化酵母的酒类的制造方法等。
(1)选自以下(a)～(f)组的多核苷酸(a)含有由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸的多核苷酸；(b)含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；(c)含有编码由序列号2的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列组成的，且具有甘油通道活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；(d)含有编码具有与序列号2的氨基酸序列有等于或大于60％同一性的氨基酸序列的，且具有甘油通道活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；(e)含有与序列号1中的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸，在严格条件下杂交，且编码具有甘油通道活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有与编码序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸，在严格条件下杂交，且编码具有甘油通道活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。
(2)上述(1)所述的多核苷酸，其选自以下(g)～(i)组成的组(g)含有编码由序列号2的氨基酸序列或序列号2的氨基酸序列中1～10个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列组成的，且具有甘油通道活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；(h)含有编码具有与序列号2的氨基酸序列有等于或大于90％同一性的氨基酸序列的，且具有甘油通道活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；及(i)含有与序列号1的碱基序列组成的多核苷酸、或序列号1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸，在严格条件下杂交，且编码具有甘油通道活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。
(3)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸。
(4)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。
(5)上述(1)～(4)中任一项所述的多核苷酸，其是DNA。
(6)选自以下(j)～(m)组成的组中的多核苷酸(j)编码具有上述(5)中所述的多核苷酸(DNA)转录产物的互补碱基序列的RNA的多核苷酸，；(k)编码通过RNAi作用抑制上述(5)中所述多核苷酸(DNA)表达的RNA的多核苷酸；(l)编码具有特异性切割上述(5)中所述多核苷酸(DNA)转录产物活性的RNA的多核苷酸；及(m)编码通过共抑制作用抑制上述(5)中所述多核苷酸(DNA)表达的RNA的多核苷酸。
(7)一种蛋白质，其由上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸编码。
(8)一种载体，其含有上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸。
(8a)上述(8)中所述的载体，其含有具有以下(x)～(z)组成要素的表达框架(x)在酵母细胞内可转录的启动子；(y)上述(1)～(5)中所述的多核苷酸，其与该启动子以正向结合；以及(z)与RNA分子的转录终止及多聚腺苷酸化有关的、在酵母中起作用的信号。
(9)一种载体，其含有上述(6)中所述的多核苷酸。
(10)一种酵母，其中导入了上述(8)或(9)中所述的载体。
(11)上述(10)中所述的酵母，其增强了甘油的生成能力。
(12)一种酵母，其通过导入上述(9)中所述的载体，或通过破坏与上述(5)中所述多核苷酸(DNA)有关的基因，抑制上述(5)中所述的多核苷酸(DNA)的表达。
(13)上述(10)中所述的酵母，其通过使上述(7)中所述的蛋白质的表达量增加，提高甘油的生成能力。
(14)一种酒类的制造方法，其使用上述(10)～(13)中任一项所述的酵母。
(15)上述(14)中所述的酒类的制造方法，其酿造的酒类是麦芽饮料。
(16)上述(14)中所述的酒类的制造方法，其酿造的酒类是葡萄酒。
(17)一种酒类，其用上述(14)～(16)中任一项所述的方法制造。
(18)评价方法，其是使用根据具有序列号1碱基序列的甘油通道基因的碱基序列设计的引物或探针，评价被检酵母的甘油生成能力的方法。
(18a)根据上述(18)中所述的方法，选别甘油生成能力高或低的酵母的方法。
(18b)使用通过(18a)中所述方法选别的酵母制造酒类(例如啤酒)的方法。
(19)评价方法，其通过培养被检酵母，测定具有序列号1碱基序列的甘油通道基因的表达量，评价被检酵母的甘油生成能力。
(20)一种酵母的选择方法，其为培养被检酵母，对上述(7)中所述的蛋白质定量或测定具有序列号1碱基序列的甘油通道基因的表达量，选择与目的甘油生成能力相应的前述蛋白质量或前述基因表达量的被检酵母。
(20a)一科酵母的选择方法，其为培养被检酵母，测定甘油生成能力或甘油通道活性，选择目的甘油生成能力或甘油通道活性的被检酵母。
(21)上述(20)中所述的酵母的选择方法，其为培养标准酵母及被检酵母，测定具有序列号1的碱基序列的甘油通道基因在各酵母中的表达量，选择该基因比标准酵母高表达或低表达的被检酵母。
(22)上述(20)中所述的酵母的选择方法，其为培养标准酵母及被检酵母，对各酵母中上述(7)中所述的蛋白质定量，选择该蛋白质量比标准酵母多或少的被检酵母。即上述(20)中所述的酵母的选择方法，其为培养多种酵母，对各酵母中上述(7)中所述的蛋白质定量，选择其中该蛋白质量多或少的被检酵母。
(23)一种酒类的制造方法，其特征在于，使用上述(10)～(13)中所述的酵母及通过上述(20)～(22)的方法选择的任一种酵母，进行用于酒类制造的发酵，调节甘油生成量。
图1是啤酒试验酿造中酵母增殖量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示OD660时的值。
图2是啤酒试验酿造中浸出物消耗量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。
图3是啤酒试验酿造中酵母的nonScFPS1基因表达变动的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示检测出的信号辉度。
图4是啤酒试验酿造中酵母增殖量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示OD660时的值。
图5是啤酒试验酿造中浸出物消耗量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。
图6是啤酒试验酿造中甘油生成量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示甘油量(g/L)的值。
具体实施例方式
本发明者等认为，通过增大或减少酵母的甘油通道活性，可控制产品中的甘油。基于此设想反复进行了研究，以用日本特开2004-283169中公开的方法解读的啤酒酵母基因组信息为基础，分离·鉴定了编码啤酒酵母特有的甘油通道的nonScFPS1基因。此碱基序列如序列号1所示。另外，由此基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列号2所示。
1.本发明的多核苷酸首先，本发明提供(a)含有由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸的多核苷酸；及(b)含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA或RNA。
作为本发明对象的多核苷酸，不限于编码来自上述啤酒酵母的甘油通道基因的多核苷酸，还包含编码与此蛋白质具同等功能的蛋白质的其他多核苷酸。作为功能相同的蛋白质，例如，可例举为(c)由序列号2的氨基酸序列中1个或多个的氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列组成的，且具有甘油通道活性的蛋白质。
作为此种蛋白质，在序列号2的氨基酸序列中，例如，可以举出由1～100个、1～90个、1～80个、1～70个、1～60个、1～50个、1～40个、1～39个、1～38个、1～37个、1～36个、1～35个、1～34个、1～33个、1～32个、1～31个、1～30个、1～29个、1～28个、1～27个、1～26个、1～25个、1～24个、1～23个、1～22个、1～21个、1～20个、1～19个、1～18个、1～17个、1～16个、1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个(1～数个)、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、1个的氨基酸残基缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列组成的，且具有甘油通道活性的蛋白质。上述氨基酸残基缺失、取代、插入及/或付加的数量，一般优选较小的数量。此种蛋白质，可例举为具有(d)与序列号2的氨基酸序列有等于或大于约60％、等于或大于约70％、等于或大于71％、等于或大于72％、等于或大于73％、等于或大于74％、等于或大于75％、等于或大于76％、等于或大于77％、等于或大于78％、等于或大于79％、等于或大于80％、等于或大于81％、等于或大于82％、等于或大于83％、等于或大于84％、等于或大于85％、等于或大于86％、等于或大于87％、等于或大于88％、等于或大于89％、等于或大于90％、等于或大于91％、等于或大于92％、等于或大于93％、等于或大于94％、等于或大于95％、等于或大于96％、等于或大于97％、等于或大于98％、等于或大于99％、等于或大于99.1％、等于或大于99.2％、等于或大于99.3％、等于或大于99.4％、等于或大于99.5％、等于或大于99.6％、等于或大于99.7％、等于或大于99.8％、等于或大于99.9％同一性的氨基酸序列，且具有甘油通道活性的蛋白质。上述同源性的数值一般越大越好。
甘油通道活性，例如可根据Eur.J.Biochem.271771-779，2004中所述的方法测定。
另外，本发明也包含(e)含有与序列号1碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸，在严格条件下杂交、且编码具有甘油通道活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有与编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸，在严格条件下杂交、且编码具有甘油通道活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。
此处的“在严格条件下杂交的多核苷酸”，是指以序列号1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸、或编码序列号2的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分为探针，通过使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或Southern杂交法等得到的多核苷酸(例如DNA)。杂交方法，例如，可利用MolecularCloning 3rd Ed.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons1987-1997等中所述的方法。
本说明书中所述的“严格条件”可为低严格条件、中严格条件、高严格条件中的任一种。“低严格条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件。“中严格条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的条件。“高严格条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件。在上述条件中，越提高温度，越能期待高效地获得具有高同源性的多核苷酸(例如DNA)。影响杂交严格性的因素可为温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，本领域技术人员通过适宜选择这些因素，均可实现同样的严格条件。
另外，杂交中使用市售的试剂盒时，例如，可使用Alkphos Direct LabellingReagents(Amersham Pharmacia公司制)。此时，根据试剂盒中附带的说明方案，与标记了的探针进行一夜培养后，将膜在55℃的条件下，用含有0.1％(w/v)SDS的洗涤缓冲液洗涤1次后，可检测杂交后的多核苷酸(例如DNA)。
此外，可杂交的多核苷酸，通过FASTA、BLAST等同源性搜索软件，使用默认值(default)计算时，可以举出编码序列号2的氨基酸序列的多核苷酸有等于或大于约60％、等于或大于约70％、等于或大于71％、等于或大于72％、等于或大于73％、等于或大于74％、等于或大于75％、等于或大于76％、等于或大于77％、等于或大于78％、等于或大于79％、等于或大于80％、等于或大于81％、等于或大于82％、等于或大于83％、等于或大于84％、等于或大于85％、等于或大于86％、等于或大于87％、等于或大于88％、等于或大于89％、等于或大于90％、等于或大于91％、等于或大于92％、等于或大于93％、等于或大于94％、等于或大于95％、等于或大于96％、等于或大于97％、等于或大于98％、等于或大于99％、等于或大于99.1％、等于或大于99.2％、等于或大于99.3％、等于或大于99.4％、等于或大于99.5％、等于或大于99.6％、等于或大于99.7％、等于或大于99.8％、等于或大于99.9％同一性的多核苷酸。
另外，氨基酸序列、碱基序列的同一性，可使用根据Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873，1993)来决定。开发了基于BLAST算法、被称为BLASTN、BLASTX的程序(Altschul SF，et alJ.Mol.Biol.215403，1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，参数例如为score＝100、wordlength＝12。另外，使用BLASTX分析氨基酸序列时，参数例如为score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认值(default)参数。
而且，本发明的多核苷酸包含(j)编码具有上述(5)中所述多核苷酸(DNA)转录产物的互补碱基序列的RNA的多核苷酸；(k)编码通过RNAi作用抑制上述(5)中所述多核苷酸(DNA)表达的RNA的多核苷酸；(l)编码具有特异性切割上述(5)中所述多核苷酸(DNA)转录产物活性的RNA的多核苷酸；及(m)编码通过共抑制作用抑制上述(5)中所述多核苷酸(DNA)表达的RNA的多核苷酸。这些多核苷酸整合进载体，并可在导入了其载体的转化细胞中抑制上述(a)～(i)的多核苷酸(DNA)的表达。因此，在适合抑制上述多核苷酸(例如DNA)表达的场合优选使用。
本说明书中，“编码具有DNA转录产物的互补碱基序列的RNA的多核苷酸”，是指所谓的反义DNA。反义技术，作为抑制特定的内源性基因表达的方法己为人们公知，在各种文献中均有记载[例如，参照平岛及井上新生化学实验讲座2核酸IV基因的复制和表达(日本生化学会编，东京化学同人)pp.319-347，1993等]。反义DNA的序列，优选与内源性基因或其一部分互补的序列，但只要能有效地抑制基因的表达，即使不完全互补也可。被转录的RNA与靶基因的转录产物，优选具有等于或大于90％，更优选具有等于或大于95％的互补性。反义DNA的长度，至少为等于或大于15个碱基，优选等于或大于100个碱基，更优选等于或大于500个碱基。
本说明书中，“编码通过RNAi作用抑制DNA表达的RNA的多核苷酸”，是指用于通过RNA interference(RNAi)抑制内源性基因表达的多核苷酸。“RNAi”是指将具有与靶基因序列同一或类似的序列的双链RNA导入细胞内时，导入的外源基因及内源性靶基因的表达均被抑制的现象。此处使用的RNA，例如可为产生了21～25碱基长度的RNA干涉的双链RNA，例如，dsRNA(double strand RNA)、siRNA(small interfering RNA)或shRNA(shorthairpin RNA)。此种RNA可通过脂质体等的释放系统向所需位点局部释放，且使用生成上述双链RNA的载体使其局部表达。此种双链RNA(dsRNA、siRNA或shRNA)的制备方法、使用方法等已由许多文献公开(参照特表2002-516062号公报；美国公开专利第2002/086356A号说明书；NatureGenetics，24(2)，180-183，2000 Feb.；Genesis，26(4)，240-244，2000 April；Nature，4076802，319-20，2002 Sep.21；Genes & Dev.，Vol.16，(8)，948-958，2002 Apr.15；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，99(8)，5515-5520，2002 Apr.16；Science，296(5567)，550-553，2002 Apr.19；Proc Natl.Acad.Sci.USA，999，6047-6052，2002 Apr.30；Nature Biotechnology，Vol.20(5)，497-500，2002 May；Nature Biotechnology，Vol.20(5)，500-505，2002 May；Nucleic Acids Res.，3010，e46，2002 May 15等)。
本说明书中，“编码具有特异性切割DNA转录产物活性的RNA的多核苷酸”一般是指酸性核酸。酸性核酸是指具有催化活性的RNA分子，通过切割靶DNA的转录产物，阻断其基因的功能。酸性核酸的设计可参照各种公知文献(例如参照FEBS Lett.228228，1988；FEBS Lett.239285，1988；Nucl.Acids.Res.177059，1989；Nature 323349，1986；Nucl.Acids.Res.196751，1991；Protein Eng 3733，1990；Nucl.Acids Res.193875，1991；Nucl.Acids Res.195125，1991；Biochem Biophys Res Commun 1861271，1992等)。且“编码由共抑制作用抑制DNA表达的RNA的多核苷酸”，是指通过“共抑制”，阻断靶DNA功能的核苷酸。
本说明书中，“共抑制”是指细胞中通过由转化导入与内源性靶基因具有同一或类似序列的基因，导入的外源基因及内源性靶基因的表达均被抑制的现象。具有共抑制作用的多核苷酸的设计，可参照种种公知文献(例如，参照Smyth DRCurr.Biol.7R793，1997、Martienssen RCurr.Biol.6810，1996等)。
2.本发明的蛋白质本发明也提供由上述多核苷酸(a)～(i)中任一个编码的蛋白质。本发明的优选蛋白质，是由序列号2中的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列组成的，且具有甘油通道活性的蛋白质。
此种蛋白质，例如，可例举为由序列号2的氨基酸序列中上述数量的氨基酸残基缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列组成的，且具有甘油通道活性的蛋白质。另外，此种蛋白质，可例举为含有与序列号2的氨基酸序列具有如上述同源性的氨基酸序列、且具有甘油通道活性的蛋白质。
此种蛋白质，可使用《分子克隆》第3版、《Current Protocols in MolecularBiology》、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”、“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等中所述的定点诱变法获得。
本发明的蛋白质氨基酸序列中等于或大于1个的氨基酸残基被缺失、取代、插入及/或附加，是指在同一序列中任意的、且1个或多个的氨基酸序列的位置上，有1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入及/或附加之意，缺失、取代、插入及附加中的2种或大于2种也可同时发生。以下，举例表示可相互取代的氨基酸残基。同一组中包含的氨基酸残基可相互取代。A组亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、o-甲基丝氨酸(o-methylserine)、叔丁基甘氨酸(t-butyl glycine)、叔丁基丙氨酸(t-butyl alanine)、环己基丙氨酸(cyclohexyl alanine)；B组天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸(isoglutamic acid)、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸(2-aminosuberic acid)；C组天冬酰胺、谷氨酰胺；D组赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E组脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组苯丙氨酸、酪氨酸。
本发明的蛋白质可通过Fmoc法(fluorenylmethoxycarbonyl)、tBoc法(t-Butyl Oxy Carbonyl)等的化学合成法制造。也可利用Advanced Chem Tech公司制、珀金埃尔默(Perkin Elmer)公司制、Farumashia公司制、ProteinTechnologies Instruments公司制、Synthecell-Vega公司制、Perceptive公司制、岛津制作所公司制等的肽合成机进行化学合成。
3.本发明的载体及导入了该载体的转化酵母其次，本发明提供含有上述多核苷酸的载体。本发明的载体含有上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸(DNA)或上述(j)～(m)中任一项所述的多核苷酸。另外，本发明的载体通常如下构成，其含有(x)在酵母细胞内可转录的启动子；(y)与该启动子以正向或反向结合的、上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸(DNA)；以及(z)含有与RNA分子的转录终止及聚腺苷酸化有关的、在酵母中起作用的信号作为构成因子的表达框架。本发明中，后述的酒类(例如啤酒)酿造中，在使上述本发明的蛋白质高表达时，为促进上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸(DNA)的表达，将这些多核苷酸针对该启动子正向导入。另外，在后述的酒类(例如啤酒)酿造中，在抑制上述本发明的蛋白质表达时，为抑制上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸(DNA)的表达，将这些多核苷酸针对该启动子反向导入。在抑制上述本发明的蛋白质表达时，也可在载体中导入上述(j)～(m)中任一项所述的多核苷酸，使其能表达。还有，在本发明中，通过破坏上述靶基因(DNA)，可抑制上述多核苷酸(DNA)的表达或上述蛋白质的表达。基因的破坏，可通过参与靶基因中基因产物表达的区域，例如向编码区域、启动子区域等的内部使附加或缺失单一或多个碱基，或使这些区域的全体缺失来进行。此种基因破坏的手法，可参照公知的文献(例如，参照Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，4951(1979)；Methods in Enzymology，101，202(1983)；Yeast，101793-1808(1994)；日本特开平6-253826号公报等)。
导入酵母时使用的载体，可利用多拷贝型(YEp型)、单拷贝型(YCp型)、染色体整合型(YIp型)中的任一种。例如，作为YEp型载体，YEp24(J.R.Broach et al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，AcademicPress，New York，83，1983)；作为YCp型载体，YCp50(M.D.Rose et al.，Gene，60，237，1987)；作为YIp型载体，YIp5(K.Struhl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，1035，1979)均已为人所知，且易获得。
用于调节酵母中基因表达的启动子/终止子，如能在酿造用酵母中起作用，同时又不受醪液中成分的影响，可任意组合。例如可利用3-磷酸脱氢酶基因(TDH3)的启动子、3-磷甘油酸激酶(PGK1)的启动子等。这些基因已被克隆，例如可通过M.F.Tuite et al.，EMBO J.，1，603(1982)中详细记载的已知方法很容易地获得。
因酿造用酵母不能利用营养缺陷型标记，所以，转化时使用的选择性标记可利用耐氨基糖苷类抗生素(geneticin)基因(G418r)、耐铜基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，337 1984)、耐浅蓝菌素基因(fas2m，PDR4)(分别参见猪腰淳嗣等，生化学，64，660，1992；Hussain et al.，Gene，101，149，1991)等。
如上所述构建的载体被导入宿主酵母。作为宿主酵母，为可用于酿造的任意的酵母，例如可为啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体地说，虽可例举为酵母属(Saccharomyces)等的酵母，但在本发明中，可使用啤酒酵母例如Saccharomyces pastorianus W34/70等，Saccharomycescarlsbergensis NCYC453、NCYC456等，Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。而且，可使用威士忌酵母，例如Saccharomyces cerevisiae NCYC90等；还可使用例如协会葡萄酒用1号、同3号、同4号等的葡萄酒酵母；例如协会酵母、清酒用7号、同9号等的清酒酵母，但不限于此。本发明中，啤酒酵母例如可优选使用Saccharomycespastorianus。
酵母的转化方法，可利用一般可使用的公知的方法。例如，可使用电穿孔法“Meth.Enzym.，194，p182(1990)”、原生质球法(Spheroplast法)“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)”、醋酸锂法“J.Bacteriology，153，p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)、Methods in yeastgenetics，2000 EditionA Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中所述的方法实施，但不限于此。
更具体地说，将宿主酵母置于标准酵母营养培养基(例如YEPD培养基“Genetic Engineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)”等)中培养，使OD600nm时的值为1～6。将此培养酵母离心分离后收集、洗涤，用浓度约为1～2M的碱金属离子、优选锂离子进行预处理。将此细胞在约30℃、静置约60分钟后，与导入的DNA(约1～20μg)同时在约30℃、静置约60分钟。加入聚乙二醇，优选加入约4,000Dalton的聚乙二醇，使最终浓度约为20％～50％。在约30℃、静置约30分钟后，将此细胞在约42℃、加热处理约5分钟。优选将此细胞悬浮液用标准酵母营养培养基洗涤后，放入所定量的新鲜标准酵母营养培养基中，约30℃、静置约60分钟。之后，移植到含有作为选择性标记使用的抗生素等的标准琼脂培养基上，获得转化体。
有关其他一般性的克隆技术，可参照(《分子克隆》第3版)、“Methodsin Y east Genetics，A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)”等。
4.本发明的酒类制造方法及根据其制法获得的酒类将上述本发明的载体导入适合酿造需制造酒类的酵母中，通过使用该酵母，制造所需要的、增大了甘油含量、增加了醇厚感、柔滑感等的酒类。另外，通过下述本发明的酵母评价方法选择的酵母也可同样使用。作为制造对象的酒类并不限于此，例如可例举为啤酒、发泡酒等的啤酒味饮料，葡萄酒、威士忌、清酒等。本发明中，根据需要，可通过使用抑制靶基因表达的酿造用酵母，制造使所需酒类的甘油含量降低了的酒类。即使用导入了上述本发明的载体的酵母、抑制了上述本发明多核苷酸(DNA)表达的酵母或根据下述本发明的酵母的评价方法选择的酵母，进行用于酒类制造的发酵，通过调节(增加或减低)甘油生成量，制造所需种类的、且调节(增加或减低)了甘油含量的酒类。
制造上述酒类时，除使用本发明中所得到的酿造酵母代替亲株以外，可利用公知的手法。因此，原料、制造设备、制造管理等可与以往完全相同，不会为制造增大了甘油含量的酒类而增加成本。即，根据本发明，可在使用已有设施、不增加成本的情况下，制造出醇厚感、柔滑感等优异的酒类。
5.本发明的酵母的评价方法本发明涉及使用根据具有序列号1碱基序列的甘油通道基因碱基序列设计的引物或探针，评价被检酵母的甘油生成能力的方法。此种评价方法的一般手法为公知，例如，如WO01/040514号公报、日本特开平8-205900号公报等的记载。以下，就此评价方法进行简单说明。
首先，制备被检酵母的基因组。制备方法可使用Hereford法、醋酸钾法等公知的任何方法[例如，Methods in Y east Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，p130(1990)]。以所得到的基因组为对象，使用根据甘油通道基因的碱基序列(优选ORF序列)设计的引物或探针，测定被检酵母的基因组中是否存在其基因或其基因的特异性序列。引物或探针的设计可使用公知的手法进行。
基因或特异性序列的检测，可使用公知的手法进行。例如，将含有包含特异性序列的一部分或全部的多核苷酸或其碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸作为一个引物使用，另一个引物使用含有包含此序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或其碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸，通过PCR法扩增酵母的核酸，并测定扩增物的有无、扩增物分子量的大小等。用于引物的多核苷酸的碱基数通常为等于或大于10bp，优选为15～25bp。另外，夹在两引物间的碱基数，通常为300～2000bp较适当。
PCR法的反应条件无特别限定，例如，可使用变性温度90～95℃、退火温度40～60℃、延伸温度60～75℃、循环数等于或大于10次等的条件。所得到的反应生成物可使用琼脂糖凝胶等的电泳法等分离，测定扩增产物的分子量。根据此方法，通过扩增产物的分子量是否含有特异部分的DNA分子的大小，来预测·评价其酵母的甘油生成能力。另外，通过分析扩增物的碱基序列，可进一步更正确地预测·评价上述性能。
本发明中，也可通过培养被检酵母，测定具有序列号1碱基序列的甘油通道基因的表达量，评价被检酵母的甘油生成能力。还有，甘油通道基因的表达量的测定，可通过培养被检酵母，对甘油通道基因的产物mRNA或蛋白质进行定量来进行。mRNA或蛋白质的定量，可使用公知的手法来进行。mRNA的定量例如可通过Northern杂交法、定量的RT-PCR等，蛋白质的定量例如可通过Western印迹法来进行(Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons 1994-2003)。
而且，通过培养被检酵母，测定具有序列号1碱基序列的甘油通道基因的表达量，选择与目的甘油生成能力相应的前述基因表达量的酵母，可选择适合酿造所需酒类的酵母。另外，也可培养标准酵母及被检酵母，测定各酵母中前述基因的表达量，比较标准酵母和被检酵母的前述基因的表达量，以选择所需的酵母。具体地说，例如，可通过培养标准酵母及被检酵母，测定具有序列号1碱基序列的甘油通道基因的各酵母中的表达量，通过选择该基因比标准酵母高表达或低表达的被检酵母，来选择适合所需酒类酿造的酵母。
或者，通过培养被检酵母，选择甘油生成能力高或低的、或甘油通道活性高或低的酵母，以选择适合所需酒类酿造的被检酵母。
此时，作为被检酵母或标准酵母，例如可使用上述导入了本发明载体的酵母、调节了上述本发明的多核苷酸(DNA)表达的酵母、实施了突变处理的酵母、自发突变的酵母等。甘油生成能力，例如可通过Method of EnzymaticAnalysis，vol.4 1825-1831，1974中所述的方法测定。甘油通道活性，例如可通过Eur.J.Biochem.271771-779，2004中所述的方法测定。突变处理，例如可使用紫外线照射、放射线照射等的物理方法，通过甲磺酸乙酯(EMSEthylmethanesulfonate)、N-甲基-N-亚硝基胍等药剂处理的化学方法等的任何方法进行(例如，参照大岛泰治编著、生物化学实验法39酵母分子遗传学实验法，p 67-75、学会出版中心等)。
还有，可作为标准酵母、被检酵母使用的酵母，可例举为酿造时可使用的任意的酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体地说，可例举为酵母属(Saccharomyces)等的酵母(例如，Saccharomyces pastorianus、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces carlsbergensis)，在本发明中，可使用啤酒酵母例如Saccharomyces pastorianus W34/70等，Saccharomycescarlsbergensis NCYC453、NCYC456等，Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。而且还可使用例如协会葡萄酒用1号、同3号、同4号等的葡萄酒酵母；例如协会酵母、清酒用7号、同9号等的清酒酵母，但不限于此。本发明中，啤酒酵母例如可优选使用Saccharomyces pastorianus。标准酵母、被检酵母可从上述酵母中以任意组合选择。
实施例以下，通过实施例详细叙述本发明，但本发明不限于以下实施例。
实施例1新型甘油通道基因(nonScFPS1)的克隆使用日本特开2004-283169中记载的比较数据库检索的结果，发现了啤酒酵母中特有的新型甘油通道基因nonScFPS1(序列号1)。以所得到的碱基序列信息为基础，设计用于扩增各自全长基因的引物nonScFPS1_for(序列号3)/nonScFPS1_rv(序列号4)，以基因组解读株Saccharomycespastorianus Weihenstephaner 34/70株的染色体DNA为模板，通过PCR，获得了含有nonScFPS1全长基因的DNA片段(约2kb)。
将如上所述得到的nonScFPS1基因片段，通过TA克隆，插入到pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen公司制)。将nonScFPS1基因的碱基序列用Sanger方法(F.Sanger，Science，214，1215，1981)进行分析，以确认碱基序列。
实施例2啤酒试验酿造中nonScFPS1基因表达分析使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株进行啤酒试验酿造，将从发酵中的啤酒酵母菌体中提取的mRNA用啤酒酵母DNA微阵列检测。
麦汁浸出物浓度 12.69％麦汁容量 70L麦汁溶解氧浓度 8.6ppm发酵温度 15℃酵母投入量 12.8×106cells/mL对发酵液经时抽样，观察酵母增殖量(图1)、表观浸出物浓度(图2)的经时变化。与此同时，对酵母菌体抽样，对制备后的mRNA进行生物素标记，使其在啤酒酵母DNA微阵列中杂交。信号检测使用GCOSGeneChipOperating Software 1.0(AFFYMETRIX公司制)来进行。nonScFPS1基因表达模式如图3所示。由此结果，可确认通常的啤酒发酵中nonScFPS1基因进行了表达。
实施例3nonScFPS1基因高表达株的制备将实施例1中所述的nonScFPS1/pCR2.1-TOPO用限制性内切酶SacI及BamHI酶切，制备包含蛋白质编码区域全长的DNA片段。使此片段与用限制性内切酶SacI及BamHI処理的pYEGNot连接，构建了nonScFPS1高表达载体nonScFPS1/pYEGNot。pYEGNot是YEp型的酵母表达载体，导入的基因通过丙酮酸激酶基因PYK1的启动子高表达。酵母中的选择性标记包含耐氨基糖苷类抗生素(geneticin)基因G418r，大肠杆菌中的选择性标记包含氨苄青霉素抗性基因Ampr。
使用由上述方法制备的高表达载体，用日本特开平07-303475中所述的方法转化Saccharomyces pastorianus Weihenstephaner 34/70株。用含有氨基糖苷类抗生素300mg/L的YPD平板培养基(1％酵母浸出物、2％聚蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂)选择转化体。
实施例4啤酒试验酿造中甘油生成量的解析使用亲株(34/70株)及实施例3得到的nonScFPS1高表达株，通过以下条件进行了发酵试验。
麦汁浸出物浓度 12.8％麦汁容量 1L麦汁溶解氧浓度 约10ppm发酵温度 15℃一定酵母投入量 6g湿酵母菌体/L麦汁对发酵醪液经时抽样，观察酵母增殖量(OD660)(图4)、浸出物消耗量的经时变化(图5)、甘油生成量的经时变化(图6)。对醪液中甘油的定量使用F-试剂盒甘油(产品编号148270、Roche公司制)进行(参照Method of Enzymatic Analysis，vol.4 1825-1831，1974等)。发酵终止时醪液中的甘油对于亲株的1.6g/L，nonScFPS1高表达株为2.1g/L，增加到约1.3倍。
实施例5nonScFPS1基因的破坏按照文献(Goldstein et al.，yeast.15 1541(1999))的方法，以含有抗药性标记的质粒[pFA6a(G418r)，pAG25(nat1)，pAG32(hph)]为模板，通过PCR，制备了基因破坏用片段。
用制备的基因破坏用片段转化啤酒酵母Saccharomyces pastorianusW34/70株、或由W34/70分离的孢子克隆株(W34/70-2)。转化用日本特开平07-303475中所述的方法进行。选择药剂的浓度分别为geneticin 300mg/L、诺尔丝菌素50mg/L。
实施例6啤酒试验酿造甘油生成量的解析使用亲株及实施例5得到的nonScFPS1破坏株，按以下条件进行。
麦汁浸出物浓度 13％麦汁容量1L麦汁溶解氧浓度 约10ppm发酵温度15℃酵母投入量 6g湿酵母菌体/L麦汁对发酵醪液经时抽样，观察酵母增殖量(OD660)、浸出物消耗量的经时变化、甘油生成量的经时变化。对甘油的定量使用F-试剂盒甘油(产品编号148270、Roche公司制)进行(参照Method of Enzymatic Analysis，vol.41825-1831，1974等)。
根据本发明的酒类制造法，因控制向产品赋予醇厚感、柔滑感等的甘油含量，所以，可制造出香味优异的酒类。
序列表(SEQUENCE LISTING)<110>三得利株式会社(Suntory Limited)<120>甘油通道基因及其用途(Glycerol channel gene and use thereof)<130>G06-0063CN<150>JP2005-253281<151>2005-09-01<150>JP2006-55562<151>2006-03-01<160>4<210>1<211>1986<212>DNA<213>酵母(yeast)<400>1atgagtaatc ctcaaaaggc cttaaacgat tttctgtcca atgaatcagt ccacactcat 60gagagttcta gaaaacaatc tcataataga cgctcatcgg acgaaggacg ttcttcctca 120caaccctcac atcatcattc caacggtcac aataataatg gtagccctgg taacggtaat 180gatggggaca acgatgatgg ttatgactat gagatgcaag attatagacc gtcgcaacaa 240agcgcgcttc ccacacctac atacgtccca cagtattctg taggaagtgg gccctctttc 300ccgatccagg aggtcgttcc taacgcgtac ataaacacac aagacacgaa ccataaagat 360aacggtccgc caagtgcaag tagtaataga gcattcagac caagaggcca aaccaccgta 420tcagcgaacg tacttaacgt cgaggatttt tataagaatg gagatgacgc gtatactata 480ccagagtcgc atctgtcgag aagaaggagc agatcaaggg ctgagagcaa cactggtcac 540agcgccacta cgggcgctac aaatgcaagg actactggcg ctcaaaccaa tatggaaaat 600
aacgagccgc cacgtagcgt tcctattatg gtgaagccaa aaacgctgta ccagaatcct 660caaactccaa cagttttgcc ttccacgtac catccgatca acaaatggtc ttcggtgaaa 720aacacttact tgaaggaatt tctggctgaa tttatgggaa caatggttat gattattttc 780ggtagtgccg tcgtatgtca agtcaatgtt gcgggcaaaa tacagcaaga caacttcaat 840tcagctctgg ataatattaa agtcaccgat tcctccgcag aaacgataga aactatgaag 900agtctaactt cgctagtatc ttctgttgca ggcggtacgt ttgacgatgt ggcactgggt 960tgggctgctg ccgtcgtgat gggatatttc tgtgctggtg gtagtgctat ctccggtgct1020catttgaatc catctattac attggcaaat ctggtatata gaggtttccc cctaaagaag1080gtgccctatt attttgctgg acaactgatc ggggccttta cgggtgcttt gattttgttt1140atttggtata aaagagtgct acaagaggca tacggcgata tatggataag cgaaagtgtt1200gcgggaatgt tttgtgtttt tccaaagcct tatttaagtt caggaagaca atttttttcc1260gaatttctat gtggggctat gttgcaagct ggtacatttg cgttgaccga tccttataca1320tgtttgtcat ccgatgtttt cccgttaatg atgttcattc tgatttttgt cataaatgcc1380tccatggcct atcaaacggg tacagcaatg aatttggctc gtgacttagg cccacgtctc1440gccttgtacg ctgttggatt tgaccataga atgctttgga tacaccacca tcatttcttt1500tgggtaccta tggtaggtcc atttcttggt gcattaatgg gcgggctggt ttatgatgtt1560tgtatttatc agggtcatga atctccagtc aattggtctt taccagtcta taaggaaatg1620ataatgagag cttggttcag aagacccggt tggaaaaaga gaaacagagc tagaagaaca1680tcggacttga gtgatttctc ctacaacaac gatgacgatg acgatgagtt cggtgaaaga1740atggctcttc aaaagacaaa aactaagtca tccatttcag acaacgaaaa tgaagctggt1800gaaaagaaag tccaatttaa gtctgttcag cgtggtaaaa gaacgttcgg aggtatacca1860accattcttg aagaagagga ttctatcgaa acagcttcac taggtgcgac taccacagat1920tccatgggat tgtctgatat atcttcagaa gattctcatt tcgggaattt aaagaaagta1980acgtag 1986<210>2<211>661<212>PRT<213>酵母(yeast)<400>2
Met Ser Asn Pro Gln Lys Ala Leu Asn Asp Phe Leu Ser Asn Glu Ser15 10 15Val His Thr His Glu Ser Ser Arg Lys Gln Ser His Asn Arg Arg Ser20 25 30Ser Asp Glu Gly Arg Ser Ser Ser Gln Pro Ser His His His Ser Asn35 40 45Gly His Asn Asn Asn Gly Ser Pro Gly Asn Gly Asn Asp Gly Asp Asn50 55 60Asp Asp Gly Tyr Asp Tyr Glu Met Gln Asp Tyr Arg Pro Ser Gln Gln65 70 75 80Ser Ala Leu Pro Thr Pro Thr Tyr Val Pro Gln Tyr Ser Val Gly Ser85 90 95Gly Pro Ser Phe Pro Ile Gln Glu Val Val Pro Asn Ala Tyr Ile Asn100 105 110Thr Gln Asp Thr Asn His Lys Asp Asn Gly Pro Pro Ser Ala Ser Ser115 120 125Asn Arg Ala Phe Arg Pro Arg Gly Gln Thr Thr Val Ser Ala Asn Val130 135 140Leu Asn Val Glu Asp Phe Tyr Lys Asn Gly Asp Asp Ala Tyr Thr Ile145 150 155 160Pro Glu Ser His Leu Ser Arg Arg Arg Ser Arg Ser Arg Ala Glu Ser65 170 175Asn Thr Gly His Ser Ala Thr Thr Gly Ala Thr Asn Ala Arg Thr Thr180 185 190Gly Ala Gln Thr Asn Met Glu Asn Asn Glu Pro Pro Arg Ser Val Pro195 200 205Ile Met Val Lys Pro Lys Thr Leu Tyr Gln Asn Pro Gln Thr Pro Thr210 215 220Val Leu Pro Ser Thr Tyr His Pro Ile Asn Lys Trp Ser Ser Val Lys225 230 235 240Asn Thr Tyr Leu Lys Glu Phe Leu Ala Glu Phe Met Gly Thr Met Val245 250 255Met Ile Ile Phe Gly Ser Ala Val Val Cys Gln Val Asn Val Ala Gly
260 265 270Lys Ile Gln Gln Asp Asn Phe Asn Ser Ala Leu Asp Asn Ile Lys Val275 280 285Thr Asp Ser Ser Ala Glu Thr Ile Glu Thr Met Lys Ser Leu Thr Ser290 295 300Leu Val Ser Ser Val Ala Gly Gly Thr Phe Asp Asp Val Ala Leu Gly305 310 315 320Trp Ala Ala Ala Val Val Met Gly Tyr Phe Cys Ala Gly Gly Ser Ala325 330 335Ile Ser Gly Ala His Leu Asn Pro Ser Ile Thr Leu Ala Asn Leu Val340 345 350Tyr Arg Gly Phe Pro Leu Lys Lys Val Pro Tyr Tyr Phe Ala Gly Gln355 360 365Leu Ile Gly Ala Phe Thr Gly Ala Leu Ile Leu Phe Ile Trp Tyr Lys370 375 380Arg Val Leu Gln Glu Ala Tyr Gly Asp Ile Trp Ile Ser Glu Ser Val385 390 395 400Ala Gly Met Phe Cys Val Phe Pro Lys Pro Tyr Leu Ser Ser Gly Arg405 410 415Gln Phe Phe Ser Glu Phe Leu Cys Gly Ala Met Leu Gln Ala Gly Thr420 425 430Phe Ala Leu Thr Asp Pro Tyr Thr Cys Leu Ser Ser Asp Val Phe Pro435 440 445Leu Met Met Phe Ile Leu Ile Phe Val Ile Asn Ala Ser Met Ala Tyr450 455 460Gln Thr Gly Thr Ala Met Asn Leu Ala Arg Asp Leu Gly Pro Arg Leu465 470 475 480Ala Leu Tyr Ala Val Gly Phe Asp His Arg Met Leu Trp Ile His His485 490 495His His Phe Phe Trp Val Pro Met Val Gly Pro Phe Leu Gly Ala Leu500 505 510Met Gly Gly Leu Val Tyr Asp Val Cys Ile Tyr Gln Gly His Glu Ser515 520 525
Pro Val Asn Trp Ser Leu Pro Val Tyr Lys Glu Met Ile Met Arg Ala530 535 540Trp Phe Arg Arg Pro Gly Trp Lys Lys Arg Asn Arg Ala Arg Arg Thr545 550 555 560Ser Asp Leu Ser Asp Phe Ser Tyr Asn Asn Asp Asp Asp Asp Asp Glu565 570 575Phe Gly Glu Arg Met Ala Leu Gln Lys Thr Lys Thr Lys Ser Ser Ile580 585 590Ser Asp Asn Glu Asn Glu Ala Gly Glu Lys Lys Val Gln Phe Lys Ser595 600 605Val Gln Arg Gly Lys Arg Thr Phe Gly Gly Ile Pro Thr Ile Leu Glu610 615 620Glu Glu Asp Ser Ile Glu Thr Ala Ser Leu Gly Ala Thr Thr Thr Asp625 630 635 640Ser Met Gly Leu Ser Asp Ile Ser Ser Glu Asp Ser His Phe Gly Asn645 650 655Leu Lys Lys Val Thr660<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列(artificial)<220>
<223>引物(primer)<400>3gagctcatag cggccatgag taatcctcaa aaggccttaa40
<210>4<211>42<212>DNA<213>人工序列(artificial)<220>
<223>引物(primer)<400>4ggatcctatg cggccgctat acctctttgt acaaatttat at 4权利要求
1.一种多核苷酸，其选自以下由(a)～(f)组成的组中(a)含有由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸的多核苷酸；(b)含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；(c)含有编码由序列号2的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列组成的，且具有甘油通道活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；(d)含有编码具有与序列号2的氨基酸序列有等于或大于60％同一性的氨基酸序列的，且具有甘油通道活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；(e)含有与序列号1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸，在严格条件下杂交，且编码具有甘油通道活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有与编码序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸，在严格条件下杂交，且编码具有甘油通道活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。
2.按照权利要求1中所述的多核苷酸，其选自由以下(g)～(i)组成的组(g)含有编码由序列号2的氨基酸序列或序列号2的氨基酸序列中1～10个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列组成的，且具有甘油通道活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；(h)含有编码具有与序列号2的氨基酸序列有等于或大于90％同一性的氨基酸序列的，且具有甘油通道活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；及(i)含有与序列号1的碱基序列组成的多核苷酸、或序列号1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸，在严格条件下杂交，且编码具有甘油通道活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。
3.按照权利要求1中所述的多核苷酸，其含有由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸。
4.按照权利要求1中所述的多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。
5.按照权利要求1～4中任一项所述的多核苷酸，其是DNA。
6.一种多核苷酸，其选自由以下(j)～(m)组成的组(j)编码具有权利要求5中所述的多核苷酸(DNA)转录产物的互补碱基序列的RNA的多核苷酸；(k)编码通过RNAi作用抑制权利要求5中所述多核苷酸(DNA)表达的RNA的多核苷酸；(l)编码具有特异性切割权利要求5中所述多核苷酸(DNA)转录产物活性的RNA的多核苷酸；及(m)编码通过共抑制作用抑制权利要求5中所述多核苷酸(DNA)表达的RNA的多核苷酸。
7.一种蛋白质，其由权利要求1～5中任一项所述的多核苷酸编码。
8.一种载体，其含有权利要求1～5中任一项所述的多核苷酸。
9.一种载体，其含有权利要求6中所述的多核苷酸。
10.一种酵母，其中导入了权利要求8或9中所述的载体。
11.按照权利要求10中所述的酵母，其增强了甘油生成能力。
12.一种酵母，其通过导入权利要求9中所述的载体，或通过破坏与权利要求5中所述多核苷酸(DNA)有关的基因，抑制权利要求5中所述的多核苷酸(DNA)的表达。
13.按照权利要求10中所述的酵母，其通过使权利要求7中所述蛋白质的表达量增加，提高甘油生成能力。
14.一种酒类的制造方法，其使用权利要求10～13中任一项所述的酵母。
15.按照权利要求14中所述的酒类的制造方法，其酿造的酒类是麦芽饮料。
16.按照权利要求14中所述的酒类的制造方法，其酿造的酒类是葡萄酒。
17.一种酒类，其用权利要求14～16中任一项所述的方法制造。
18.一种评价方法，其是使用根据具有序列号1碱基序列的甘油通道基因的碱基序列设计的引物或探针，评价被检酵母的甘油生成能力的方法。
19.一种评价方法，其是通过培养被检酵母，测定具有序列号1碱基序列的甘油通道基因的表达量，评价被检酵母的甘油生成能力的方法。
20.一种酵母的选择方法，其为培养被检酵母，对权利要求7中所述的蛋白质定量或测定具有序列号1碱基序列的甘油通道基因的表达量，选择与目的甘油生成能力相应的前述蛋白质量或前述基因表达量的被检酵母。
21.按照权利要求20中所述的酵母的选择方法，其为培养标准酵母及被检酵母，测定具有序列号1的碱基序列的甘油通道基因在各酵母中的表达量，选择该基因比标准酵母高表达或低表达的被检酵母。
22.按照权利要求20中所述的酵母的选择方法，其为培养标准酵母及被检酵母，对各酵母中的权利要求7中所述的蛋白质定量，选择该蛋白质量比标准酵母多或少的被检酵母。
23.一种酒类的制造方法，其特征在于，使用权利要求10～13中所述的酵母及通过权利要求20～22中所述的方法选择的酵母中的任一种酵母，进行用于酒类制造的发酵，调节甘油生成量。
全文摘要
本发明涉及甘油通道(Glycerol Channel)基因及其用途，特别是涉及制造醇厚感、柔滑感等优异的酒类的酿造酵母、使用该酵母制造的酒类及其制造方法等。更具体地说，本发明涉及通过控制编码酿造酵母甘油通道Fps1p的基因FPS1、特别是啤酒酵母中特征性的nonScFPS1基因的表达量，控制对产品醇厚感、柔滑感等起作用的甘油的生成能力的酵母及使用该酵母的酒类制造方法等。
文档编号C12C11/00GK1924018SQ20061012886
公开日2007年3月7日 申请日期2006年8月31日 优先权日2005年9月1日
发明者中尾嘉宏, 儿玉由纪子, 下永朋子 申请人:三得利株式会社