专利名称：固定超螺旋dna的方法和分析dna修复的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及固定超螺旋DNA的方法以及固定在载体上的超螺旋 DNA的应用，该载体用作分析DNA修复的酶反应的基质。
背景技术：
生物芯片已经成为生物医学研究和临床诊断的必要分析工具。这 些有力工具可以借助固定在载体上的DNA探针(寡核苷酸、cDNA、PCR放大产物)或蛋白质探针(抗体、肽)同时分析几万至几十万样品。生物芯片利用载体(玻璃、聚丙烯、聚苯乙烯、硅树脂、金属、硝 化纤维素或尼龙)制备，该载体任选被多孔薄膜[涂有尼龙的玻璃(Atlas arrays ; Clontech);涂有水凝胶的硅树脂(NanochipTM; Nanogen),涂有 丙烯酰胺聚合物凝胶Hydrogel (Perkin-Elmer)或甲基丙烯酸聚合物凝 胶的玻璃(美国申请2005/0042363)]改性。使用两类方法将DNA探针或蛋白质探针固定到载体上 * 沉积预先合成的探针并通过共价或非共价连接进行固定探针(寡核苷酸(10-25碱基(bases))、肽、cDNA或PCR放大片段(最 大为500 bp至0.2 kb)、蛋白质(抗体))通常借助自动分配装置沉积于载 体上(Lemmo等人，Current Opinion in Biotechnology, 1998, 9:615-617)。 带电探针也可以沉积在基于涂有可浸透层(琼脂糖凝胶)的微电极上的 载体表面，并通过电泳传送到凝胶里(Heller等人，Electrophoresis, 2000, 21:157-164)。此外，在集落杂交技术的具体情况(Hanahan和Meselson， Gene,1983, 10:63-67)中，置于载体上的菌落被转到尼龙或硝化纤维素滤器 上，然后lyzed以释放DNA (质粒或粘粒)于滤器上。接着，借助共价或非共价(疏水、静电)键或二者的结合将探针固定 在载体上。共价键通常在活化载体的反应性功能团和一端被改性的探针的反 应性功能团之间形成(探针的磷酸或羧酸基和载体的胺基，反之亦然； 探针的胺基和载体的异硫氰酸盐、醛或环氧基；Zammateo等人， Analytical Biochemistry, 2000, 208:143-150)。当载体涂有聚丙烯酰胺膜时，它可以通过由肼处理的酰肼基的置 换而活化。由3-甲基脲嘧啶核苷基进行3'-改性的探针在高碘酸盐存在 下进行氧化以形成反应性醛，然后置于载体上。探针的醛基与凝胶的 肼基之间的反应形成将DNA固定在丙烯酰胺凝胶中的共价键(Khmpko 等人，DNA sequence, 1991, 6:375-388; Yershov等人，P.N.A.S.， 1996, 93:4913-4918)。在凝胶聚合过程中，也可以固定长度小于500核苷的 胺化DNA片段(Rubina等人，Anal. Biochem.， 2004， 325:92-106)。涂有水凝胶的载体尤其能够增强载体的固定能力并改善探针的环 境、灵敏性和检测阈。此外，UV-照射或者单功能或双功能偶联剂也可在涂有聚-L-赖氨 酸的载体的胺基和DNA (UV)的胸苷残基或改性探针(戊二醛)的胺基之 间形成共价键。非共价键主要包括DNA和涂有聚-L-赖氨酸的载体之间的静电相 互作用。* 原地合成和固定探针该方法可仅仅用于制备寡核苷酸芯片(Southem等人，Genomics, 1992,4， 1008-1017)或肽芯片，其能够在划定区域内同时进行共价偶联 和寡核苷酸的合成，尤其是使用掩体(机械或光刻掩体)。这些方法能够获得适用于多种应用的生物芯片遗传分析(测序、绘图、多态性、突变、基因拷贝数(genecopynumber)、表达轮廓)和蛋 白质/配体相互作用的分析(免疫测定、蛋白质和DNA分子或RNA分 子或小分子之间的相互作用)。然而，某些分析，例如DNA修复活性的分析，利用特定DNA探 针，即超螺旋环状双链DNA (超螺旋质粒)，其结构在将DNA固定到 载体上期间必须要保护好， 一旦DNA固定到载体上就保存。实际上， 用于分析DNA修复的基质是超螺旋质粒，其具有残损嘌呤或嘧啶碱基 (氧化、光诱导、化学加成残损)、残损糖、对双螺旋线结构(间或内链 桥接(bridging)、插层剂)的残损、和/或断裂，通过利用不同遗传毒性剂 对质粒的处理，接着在蔗糖或铯梯度上对超螺旋质粒的纯化而诱导。 超螺旋质粒的纯化能够排除包含断裂(松弛结构)的质粒。与上述保护 DNA的超螺旋结构的其它类型的残损不同，这是由于断裂破坏质粒的 超螺旋结构并形成松弛结构。未处理超螺旋质粒(未残损质粒)用作对 照。要分析的生物样品在包括残损的超螺旋质粒(残损质粒)和标志的三 磷酸核苷存在下进行培育。随后，通过测量引入残损质粒中的标志的 量，与对照质粒相比较，来定量DNA修复活性。对DNA的间接残损，特别是在质粒固定到载体上期间以及随后在 固定在载体上的质粒的保护期间出现的断裂(单链或双链)，通过包含在 要分析的样品中的修复系统进行修复。因而，除了改性碱基，断裂的 存在还导致寄生标志的引入，该寄生标志被量化并掩饰特定的碱修复 反应。此外，这些断裂促使质粒的松弛并由此可以更容易到达生物培 养基的核酸酶，从而使质粒修复活性增强。最后，松弛结构促进引发不 想要的聚合反应。因而，DNA间接残损的修复，特别是断裂的修复， 能够掩饰或干扰特定残损的修复。因此，所研究残损的特定信号可能 消失在非特定信号产生的背景噪声中，这使得分析DNA修复很困难，甚至不可能。制备生物芯片的大多数方法不可以固定体积大且具有特殊结构的DNA，如质粒(超螺旋环状DNA)，同时保存它们的完整性。实际上，如专利申请FR02 16435中所述的通过非共价偶联将超螺 旋DNA固定在涂有聚-L-赖氨酸的玻片上没有以稳定方式保护DNA结 构，并且包括固定了的质粒的载体必须在固定DNA后立刻使用，从而 限制了它们的工业应用。DNA的间核苷磷酸基带阴离子，DNA与聚-L-赖氨酸的阳离子基团之间的反应更快或更慢的在质粒的超螺旋结构中 产生不稳定性，导致在DNA中和非合意修复反应的底物(priming)中出 现断裂。因此，与沉积后立刻进行的反应相比较，在聚-L-赖氨酸玻片 上沉积数小时后观察到用作对照的非改性质粒的修复率有所提高。在 对照质粒上检测到的此修复率与玻片的保存时间成比例提高。相同现 象发生在包括DNA残损的质粒上，并掩饰预期的特定反应。因而，玻 片必须在沉积质粒后非常快速的使用，这是工业应用的主要劣势。此外，其上固定有质粒的聚-L-赖氨酸玻片的保存极其依赖沉积质 粒和储存玻片期间的吸湿性环境。然而，此参数难于精确控制，这导 致玻片的随意保存时间。保存的随意性进一步限制了此项技术的应用。 此外，即使质粒的沉积可以任选在潮湿气氛中进行，由于质粒对聚-L-赖氨酸玻片的连接不够有效且获得的修复信号弱，因而此选择不令人满意o此方法的另一劣势涉及在玻片上的质粒溶液沉积物的体积。它达到几百微微升的量级；然而，由于沉积物中所含水的挥发率取决于一 些因素，如环境湿度、环境温度和沉积溶液中可能存在的辅助剂，总 是存在风险，即水的快速挥发将导致液滴周围样品的浓縮，并因此导 致沉积物缺少均匀性。沉积物缺少均匀性导致以沉积物水平定量修复 信号时产生困难，然而精确定量对于确定给定细胞培养基的修复能力和彼此对比不同介质来说是必要的。但是，Rickman等人(Nucleic Acids Res., 2003, 31, e109)表示某些辅助剂使挥发减慢。然而，这类化合物 的应用导致形态学异质性或沉积物尺寸的增加。某些化合物在沉积质 量方面似乎提供有利结果，但不适合修复研究，这是由于它们能引起 质粒变性，如甲酰胺的情况(Rickman等人，2003,如上)。DNA至载体的共价偶联不能预料，由于它产生导致在质粒上出现 断裂的压力。此外，它包括化学和/或物理处理步骤(加热、UV-照射)， 这可能对DNA有残损。此外，屑^邀合成方法可仅仅用于制备寡核苷酸 心片。结果，实际上需要提供在载体上固定超螺旋DNA的备选方法，该 方法更满意的满足本领域的需要，它们观察DNA超螺旋结构的完整性 并且它们能够保存此结构用于DNA的后序应用，特别是作为酶促DNA 修复反应的基质。发明内容发明人表示超螺旋DNA可以通过不被反应性官能团活化(非官能 化)的DNA的被动扩散而稳定的固定于多孔聚合物膜中，在聚合物膜 中，也不被活化。在这些条件下，即使当固定的DNA包括通过暴露于 遗传毒性剂引入的残损，它也将其超螺旋结构保留几个月。该DNA有 利的固定在涂有多孔聚合物膜的小型化载体上，该多孔聚合物膜使得 能够制备大量固定DNA的样品，并能够将其储存用于后序应用，特别 是用作DNA修复反应中的基质。因此，本发明的一个主题是用于固定超螺旋DNA的方法，其特征 在于它包括下述步骤-沉积超螺旋DNA样品于多孔聚合物膜表面上，和-通过被动扩散固定超螺旋DNA于该多孔聚合物膜中。定乂-超螺旋DNA:超螺旋环状双链DNA分子，特别是质粒。-多孔聚合物膜:三维基体的薄层，该基体包括一种或多种聚合 物链和溶剂，该基体包括可容纳高分子如DNA的空隙(？L)。该聚合物 膜的厚度足够小从而限制背景噪音。该膜的厚度优选小于0.1 mm。-皿在包括一种或多种聚合物链和溶剂的三维基体内通过被 动扩散的DNA的渗透。在这些条件下，在本领域技术人员已知的常规缓冲液中，特别是 在pH7.4的PBS中稀释的超螺旋DNA，在没有电流的情况下(没有电 泳步骤)渗透多孔聚合物膜，并在对聚合物膜或DNA没有任何后序物 理或化学处理的情况下将其固定在聚合物基体的空隙中。这样固定的 超螺旋DNA在聚合物膜中稳定的维持数月。在优选的多孔聚合物中，可提及可扩展水性聚合物(水凝胶或含 水凝胶多糖，尤其是琼脂糖)和其中共价化学键建立在聚合物链之间 的聚合物，以便形成网格(聚丙烯酰胺)。在聚合物中固定的DNA的量(固定能力)取决于聚合物的性质及其 浓度，并可通过水凝胶中添加DNA吸附剂而提高。根据该方法的第一有利实施方式，该聚合物膜是聚丙烯酰胺水凝 胶。它优选包含5% - 15%的50:1 - 5:1的丙烯酰胺亚甲基二丙烯酰胺 混合物，优选5% - 15%的19:1混合物。根据该方法的第二有利实施方式，该聚合物膜包含0.1% - 5%的 DNA吸附剂，如明胶(gelatin)、胶原质或多糖，如琼脂糖、右旋糖苷或 者葡萄糖或蔗糖聚合物，或者上述吸附剂的混合物。该吸附剂优选是 琼脂糖，优选低熔点琼脂糖，其熔点温度有利的是4(TC。根据上述实施方式的有利安排(armngements)，聚合物膜是聚丙烯酰胺水凝胶，包括10%的19:1的丙烯酰胺亚甲基二丙烯酰胺混合物 和0.8%的低熔点琼脂糖。根据该方法的第三有利实施方案，该超螺旋DNA是质粒。根据该方法的第四有利实施方案，该超螺旋DNA含有遗传毒性剂 诱导的残损。优选的，该残损由用物理或化学遗传毒性剂处理的分离 的质粒或包括该质粒的细胞诱导。在该残损中，可提及对嘌呤或嘧啶 碱基的残损(氧化、光诱导、化学加成残损)、对糖的残损、对双螺旋线 结构(间或内链桥接(bridging)、插层剂)的残损和断裂。根据该方法的第五有利实施方案，将该多孔聚合物膜沉积在本领 域技术人员公知的适当载体上，例如玻璃、金属、硅树脂或塑料载体。 优选微芯片类型的小型化载体。优选载玻片。本发明的目的还包括涂有多孔聚合物膜的载体，包括固定的超螺 旋DNA，其可通过上述固定方法获得。有利的是涂有聚丙烯酰胺水凝胶的载玻片，包括残损超螺旋DNA。根据本领域技术人员已知的常规技术进行聚合物膜在载体表面的 聚合和沉积。所有已知技术可用于实施本发明。利用含丙烯酰胺水溶 液和聚合方式制备多孔聚合物如聚丙烯酰胺水凝胶。例如，(i) 5% - 15% 的丙烯酰胺亚甲基二丙烯酰胺混合物(50:1-5:1，优选19:1)， (ii) 0%-5% 的上述DNA吸附剂，优选多糖，尤其是低熔点琼脂糖，和(iii)自由基 源，例如0.001% - 0.1%的过硫酸铵与0.001% - 0.5%的TEMED (N,N,N，,N，-四甲基乙二胺)一起。也可使用制备好的聚合物组合物，特别是水凝胶如HydroGel (Perkin-Elmer; www.perkinelmer.com/proteomics)。载体是，例如预先涂有氨基硅烷的载玻片。接着利用合适方式如 盖玻片使水凝胶的水溶液沉积在载体上并将其覆盖，从而形成均匀薄 层。任选通过加热或曝露于紫外线使水凝胶聚合，取决于使用的聚合方式。这样获得的涂有聚合物膜的载体可任选被干燥，优选通过加热 方式。DNA， 尤其是质粒，禾U用Cwre打Z尸ratoco/s z'w Afo/ecw/flr所o/ogy (Fm/e"'cA: M ^4msm&" 2Q00'附/ej; 5b" /"c" Z^&ra/^ o/ Cowgress， f7&4)中所述的标准协议，根据常规分子生物技术制备。根据专利申请FR0216435中所述的标准协议，用遗传毒性剂对 DNA的处理根据本领域已知的常规技术进行。根据专利申请FR 0216435中所述的标准协议，超螺旋DNA部分 通过蔗糖梯度和/或氯化铯梯度离心进行分离。将超螺旋DNA在标准缓冲液如PBS， pH 7.4中稀释至优选浓度为 5-100吗/ml，有利的是20-40昭/ml。接着将超螺旋DNA沉积在涂有水凝胶的载体部分上，例如使用诸 如压电自动装置的自动装置进行。本发明的目的还包括一种水性组合物在固定超螺旋DNA方面的 应用，该水性聚合物包括10%的19:1丙烯酰胺亚甲基二丙烯酰胺混 合物和0.8%的低熔点琼脂糖。本发明的目的还包括上述固定在多孔聚合物膜中的超螺旋DNA 的应用，用作在生物培养基中分析DNA修复用的基质。根据申请FR0216435中描述的DNA修复的整体和特定能力的定 量评价方法，可特别分析DNA修复。DNA修复在生物培养基中的分析，特别是在生物培养基中的DNA 修复的整体和特定能力的定量评价，可特别建立给定媒介的修复轮廓， 可诊断DNA修复相关的疾病，可评价物理或化学处理对给定生物培养 基修复能力的影响，并可筛选能够调整生物培养基的修复系统的物质。利用水凝胶而非聚-L-赖氨酸来固定超螺旋DNA (DNA包括残损 (残损超螺旋质粒)和受控DNA(超螺旋质粒))，具有下列优势，特别是用来测定生物培养基中的DNA修复活性 -固定在水凝胶中的质粒的稳定性:尽管有对DNA的残损，固定在水凝胶涂敷的载体上的质粒，例如丙烯酰胺聚合物，在从湿度测定方面来说不受控制的环境中将其超螺 旋结构保留几周。这样，大量包括固定质粒的玻片可以同时制备并容 易的存储直至几周后它们被使用。-DNA修复检测灵敏性修复信号值的范围宽泛，这使得对要分析修复活性的样品更精确 的分析，且更好的辨别所分析样品之间的差异。除了上述安排，本发明还包括根据下述的其它安排，其参考在水 凝胶中固定的残损超螺旋DNA用作DNA修复酶反应的基质的应用的 实施例，并参考附图。
图1说明在+4。C时85天时期内，在涂有聚丙烯酰胺水凝胶的载 玻片上固定的残损超螺旋DNA的稳定性。具有由不同物理或化学试剂 诱导的残损的超螺旋质粒DNA如实施例1所述进行制备，然后利用对 照(未处理)质粒进行稀释，以便保持质粒在PBS缓冲液中的总浓度为 40吗/ml:仅残损质粒(4/4); 30吗/ml残损质粒和10吗/ml对照质粒 (3/4); 20吗/ml残损质粒和20(ig/ml对照质粒(1/2)。未处理质粒DNA 用作对照。将DNA样品沉积在涂有聚丙烯酰胺水凝胶的载玻片上，接 着将该玻片在通过测定荧光发射来评价DNA修复之前在+4。C时保存 1、 3、 71和85天(D!、 D3、 D"禾口D8s)。荧光值以任意单位(a.u.)表示。 T:对照。UVC: UVC-照射(0.3 J/cm2)。 endo:用内过氧化萘处理。 DDE:用反，反-2,4-癸二烯处理。CIS:用顺氯氨铂(cisplatin)处理。PSO: 用补骨脂素(psoralene)处理。ABA:引入无碱位点。U:引入尿嘧啶。图2说明在+4。C时在涂有聚-L-赖氨酸的载玻片上的残损超螺旋 DNA。具有由不同物理或化学试剂诱导的残损的超螺旋质粒DNA如实 施例1所述进行制备，然后利用对照(未处理)质粒进行稀释，以便保 持质粒在PBS缓冲液中的总浓度为40pg/ml:仅残损质粒(4/4); 30吗/ml残损质粒和10|iig/ml对照质粒(3/4); 20吗/ml残损质粒和 20pg/ml对照质粒(1/2)。未处理质粒DNA用作对照。将DNA样品沉 积在涂有聚-L-赖氨酸的载玻片上，接着通过测定荧光发射在沉积后立 刻评价DNA修复(D。)或者在评价DNA修复之前将该玻片在+4。C时保 存1天(DO。荧光值以任意单位(a.u.)表示。T:对照。UVC: UVC-照 射(0.3J/cm2)。 endo:用内过氧化萘处理。DDE:用反，反-2，4-癸二烯处理。CIS:用顺氯氨铂处理。PSO:用补骨脂素处理。ABA:引入无碱 位点。U:引入尿嘧啶。
具体实施方式
然而，应当理解这些实施例只是用于解释本发明的主题，它们不 能构成限制。实施例:在水凝胶中固定的DNA作为分析DNA修复的基质的应用用于比较在涂有聚-L-赖氨酸或涂有水凝胶的载体上固定的DNA 的修复的DNA修复试验的原理在专利申请FR0216435中进行了描述。 1)材料和方法a)制备包含残损的超螺旋DNA根据供货商提供的协议，通过五.co/z' (Stratagene)的XL1蓝色MRF 链的转化制造质粒(pBluescriptII, Stratagene)。质粒使用Plasmid midi kit (Qiagen)纯化并稀释于PBS缓冲液中(IO mM磷酸盐，pH 7.4， 137mMNaCl， 2mMKCl)。用不同物理或化学试剂处理质粒以在其中引入残损，艮P:使用在254 nm发射的灯照射PBS中的质粒溶液(25 40昭/ml)。 收到的剂量是0.3 J/cm2 (图1和2)或者0.03, 0.06和0.12 J/cm2 (图3)。 -鹏过靴激鄰一20^1 50mM的内过氧化萘(l,4-内过氧化N,N'-二(2,3-二羟基丙 基)-l,4-萘二丙酰胺，根据J. Biol. Chem.， 2000, 275, 40601-40604中所述 的协议制备)利用200 pi 1 mg/ml在PBS中的质粒在37°C培育2小时。-^虎及-2，^蒡二靡必楚(2)i^)200 pl 1 mg/ml在PBS中的质粒与200 pl 0.2 M碳酸盐/碳酸氢盐缓 冲液，pH 9.2及200 |ul四氢呋喃混合，并向其中加入4 ^ DDE (5.7 M) 和12 ^tl H202 (8.8 M)。在黑暗中在50°C培育该混合物16小时。接着 用二氯甲烷通过两次提取除去DDE。-用顺氯氨铂处理(T/》150 pl 1 mg/ml在PBS中的质粒用1 pl 15 mg/ml顺式-二胺二氯铂 (II)的二甲亚砜(DMSO)溶液在37°C处理2小时。 -用补骨脂素处理(PSQ)150 |nl 1 mg/ml在PBS中的质粒与20 (il 120 ^M补骨脂素胺溶液混 合，并在365 nm在1.48 J/cm2的剂量下照射。 -引入无碱位点^Ai)100 pi 1 mg/ml的质粒在含有12KC1 (2 M)的0.05 M, pH 4.8的柠 檬酸钠中在70°C培育4小时。 -引入尿嘧啶(X9根据供货商提供的协议，通过缺乏尿嘧啶-DNA-糖基化酶活性 (UNG—)的E co"链的转化制造质粒(pBluescriptII, Stratagene)。质粒使 用Plasmid midi kit (Qiagen)纯化，接着在蔗糖梯度上。处理的质粒接着被沉淀并在蔗糖梯度上纯化，收集含有至少90%超螺旋质粒的部分，如申请FR0216435中所述。含有残损的超螺旋 DNA的不同制剂，以及包含未残损超螺旋DNA的未处理对照质粒在 PBS中稀释至40 ng/ml。b)制备载体并沉积DNA涂有聚-L-赖氨酸的载玻片由VWR International提供。 b0 制备涂有聚丙烯酰胺水凝胶的载玻片载玻片(76 x26mm)置于玻片架中，接着在包括4 ml Bind-Silane (3-甲基丙烯氧丙基三甲氧基硅烷)和220 pl冰醋酸且用蒸馏水将总体积加至1升的溶液中培育1小时，并搅拌。接着用蒸馏水清洗玻片三次， 并用乙醇清洗一次，然后在侧吸罩(suction hood)中干燥。聚丙烯酰胺水凝胶是一种水溶液，其也可以由PBS缓冲液(或由 TBE缓冲液)制备，含有10%的19:1丙烯酰胺和亚甲基二丙烯酰胺混 合物、0.8%的低熔点琼脂糖(Tebu-Bio)、 0.06%的过硫酸铵和0.065% 的TEMED (N,N,N，,N，-四甲基乙二胺)。100 pl的此溶液均匀沉积在如 上准备的载玻片(76 x26mm)上，然后使用盖玻片将其薄薄的均匀的 展开。盖有盖玻片的载玻片在40°C时加热5分钟，以便使凝胶变硬。接 着移去盖玻片，然后将带有凝胶的载玻片在40°C下再加热3分钟从而 干燥水凝胶。聚丙烯酰胺水凝胶涂敷的玻片在+4。C时保存。使用前， 优选将它们在+4。C时保存至少24 h。 b2) 沉积DNA样品在PBS缓冲液中，样品中的总质粒浓度是40pg/ml，更具体的参 考1禾n 2:仅残损质粒(4/4); 30昭/ml残损质粒和10吗/ml对照质粒 (3/4); 20吗/ml残损质粒和20吗/ml对照质粒(1/2)。未残损超螺旋质 粒DNA用作对照。使用压电自动装置(Scieflexarrayer, Scienion)将三滴DNA样品(总 体积为大约500微微升)沉积在载玻片的每个部分。聚-L-赖氨酸涂敷的玻片在沉积后立刻使用(D。)或者分析DNA修 复前(D04。C保存24 h(D!)。4。C被动固定DNA 24h后，水凝胶涂敷的玻片用于分析DNA修 复(DO，或者在分析DNA修复前在相同温度下保存不同时间段(D3， D7], D85)。c) 修复反应和修复信号的测定将包含容易含有DNA修复系统的细胞溶解产物(25 ^d; 0.6 mg/ml 的来自HeLa细胞的核提取物的蛋白质；CilBiotech)和使生物培养基的 蛋白质进行修复反应所需求的各种化合物(5 ^的ATG缓冲液(200 mM Hepes KOH pH7.8， 356 mM MgCl2， 2.5 mM DTT， 1.25pM dATP, 1.25 pM dGTP, 1.25 pM TTP， 17% glycerol, 10 mM EDTA, 250吗/ml肌 氨酸磷酸激酶，50 mM磷酸肌酸，10 mM ATP， 1.25 dCTP-Cy5))的 溶液(30 pl)沉积在含固定DNA的不同样品的玻片的每个区域。玻片在 30°C培育3小时。接着将该玻片在含0.5% Tween 20的PBS中(清洗2 次，3 min)接着在蒸馏水中(清洗2次，3 min)清洗。离心(800 rpm, 3 min) 干燥后，测定荧光信号(Genepix4200A扫描系统，Axon)并使用Genepix Pro 5.1软件(Axon)进行分析。相对于每个部分的信号的中值对这些信 号进行标准化。2)结果a) DNA修复评价灵敏性的提高在水凝胶涂敷的玻片上固定的DNA可以提高DNA修复活性的检 测灵敏性，如在DNA样品被动固定后进行的DNA修复测定的比较中实际上，与使用聚-L-赖氨酸(各种残损在D。时的信号为 9000-12000任意单位)相比，使用聚丙烯酰胺水凝胶可以获得较大范围 的DNA修复信号值(各种残损在D,时信号为11000-20000任意单位)， 不考虑用于修复研究的DNA残损的类型。此不同可通过在水凝胶中固 定的DNA的数量和/或质量的提高以及在此媒介中的修复反应的效率 的提高来解释。b)固定的DNA的稳定性在水凝胶涂敷的玻片上固定的DNA稳定存在超过2个月，如DNA 在水凝胶上沉积后的不同时间进行的DNA修复试验的结果所示(图1)。 在D^， DNA修复活性与在^检测到的相当，不考虑用于修复研究的 DNA残损的类型。此外，对照DNA在D,获得的较低背景噪音反映出 DNA在水凝胶中固定期间其结构得到较好的保留。比较起来，对于在涂有聚-L-赖氨酸的玻片上固定的DNA， Do时 观察到对照DNA较高的背景噪声，随着对照DNA样品和残损DNA 中DNA修复信号(D,)都快速增强，表明DNA中出现额外断裂。
权利要求
1.固定超螺旋DNA的方法，其特征在于它包括下述步骤-沉积超螺旋DNA样品于多孔聚合物膜表面上，和-通过被动扩散固定超螺旋DNA于所述多孔聚合物膜中。
2. 如权利要求1的方法，其特征在于所述多孔聚合物是聚丙烯酰胺 水凝胶。
3. 如权利要求2的方法，其特征在于所述聚丙烯酰胺水凝胶包括 5%-15%的50:1-5:1丙烯酰胺亚甲基二丙烯酰胺混合物。
4. 如权利要求3的方法，其特征在于所述聚丙烯酰胺水凝胶包括 5%-15%的19:1丙烯酰胺亚甲基二丙烯酰胺混合物。
5. 如权利要求1-4中任一项的方法，其特征在于所述聚合物膜包括 0.1%-5%的一种或多种DNA吸附剂。
6. 如权利要求5的方法，其特征在于所述吸附剂是多糖。
7. 如权利要求6的方法，其特征在于所述吸附剂是琼脂糖。
8. 如权利要求7的方法，其特征在于所述吸附剂是低熔点琼脂糖。
9. 如权利要求4-8中任一项的方法，其特征在于聚丙烯酰胺水凝胶 包括10%的19:1丙烯酰胺亚甲基二丙烯酰胺混合物和0.8°/。的 低熔点琼脂糖。
10. 如权利要求1-9中任一项的方法，其特征在于所述超螺旋DNA 是质粒。
11. 如权利要求1-10中任一项的方法，其特征在于所述超螺旋DNA 含有由遗传毒性剂引起的残损。
12. 如权利要求1-11中任一项的方法，其特征在于所述多孔聚合物 膜沉积在适当载体上。
13. 如权利要求12的方法，其特征在于所述载体是载玻片。
14. 涂有多孔聚合物膜的载体，包括固定的超螺旋DNA，其通过权 利要求12或13的方法获得。
15. 如权利要求14的载体，其特征在于它是涂有包括残损超螺旋 DNA的聚丙烯酰胺水凝胶的载玻片。
16. 包括10%的19:1丙烯酰胺亚甲基二丙烯酰胺混合物和0.8%的 低熔点琼脂糖的水性组合物的应用，用于固定超螺旋DNA。
17. 在权利要求1-13中任一项限定的多孔聚合物膜中固定的超螺旋 DNA的应用，作为分析DNA修复用的基质。
全文摘要
一种固定超螺旋DNA的方法，包括在多孔聚合物膜表面上沉积超螺旋DNA样品，通过被动扩散将超螺旋DNA固定在其中，利用本发明方法获得载体，和使用该载体分析DNA分布。
文档编号C12Q1/68GK101253275SQ200680030302
公开日2008年8月27日 申请日期2006年6月19日 优先权日2005年6月20日
发明者J-F·米约, S·索瓦热 申请人:法国原子能委员会