专利名称：一种检测曲霉菌荧光定量pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及检验微生物的组合物，具体是检验曲霉菌的组合物，特别是检验曲霉菌基因中的一段核酸序列的试剂盒。
背景技术：
目前临床上常见的深部病原菌是念珠菌、曲霉菌、新隐球菌等，其中念珠菌约占70％。近年来霉菌感染率明显增高，在中性粒细胞缺乏和骨髓移植的患者中，侵袭性曲霉病的感染率高达50％，病死率高达40％以上，存活主要依赖于早期诊断和恰当的抗真菌治疗，而传统的实验室诊断耗时较长，缺乏敏感性，所以探索一种检测曲霉菌的快速可靠的方法已经成为临床实验研究的热点问题。
致病性曲霉的种群有13个，严重的播散性感染总发生于免疫缺陷的患者。其中烟曲霉是最常见的菌种，黄曲霉居第二，免疫缺陷侵袭性肺感染和鼻窦感染中黑曲霉是第三位常见分离菌，其他致病曲霉还包括土曲霉、构巢曲霉、阿姆斯特丹曲霉、亮白曲霉、肉色曲霉。
诊断深部曲霉菌感染的方法有传统的培养方法、影像学方法、血清学方法以及分子生物学方法。传统的真菌培养和组织活检是诊断曲霉菌感染的金标准，但因其所需时间较长，敏感度较低，组织活检给病人带来一定的创伤，已无法满足临床的需要。影像学检查是用高分辨率CT对侵袭性肺曲霉感染的病人胸部进行观察，感染曲霉菌的典型特征是发现光晕征和新月形空气征，这些对诊断曲霉感染高危病人有一定的早期诊断价值，但特异度差，在其他感染和非感染病人中均可出现此特征。血清学方法具有较高的敏感度和特异度，但一些临床常见的致病菌如隐球菌等会引起假阳性。分子生物学方法主要是指PCR(聚合酶链反应)方法。PCR方法具有很高的敏感度，但特异度较差，容易受到外源污染造成假阳性。目前PCR方法主要朝两个方向发展，一个是结合免疫学方法的PCR-ELISA方法，利用ELISA方法的高特异度来克服PCR方法的缺点，但ELISA方法检测曲霉菌抗原结果不稳定，受操作人员、温度等多方面的影响较大，尤其对判定结果的cutoff值的大小是急需解决的问题。另一个实时荧光定量PCR方法，从进样到检测出结果一步到位，可避免中间操作带来的外源污染。
Development and Validation of a Quantitative Real-Time PCR Assay Using FluorescenceResonance Energy Transfer Technology for Detection of Aspergillus fumigatus in ExperimentalInvasive Pulmonary Aspergillosis(Journal Of ClinIcal Microbiology，Dec.2003，p.5676-5682 Vol.41，No.12)一文公开了一种利用实时PCR扩增ITS1-ITS2片段来检测烟曲霉的方法，具有很高的敏感度和特异度，但该方法仅限于检测烟曲霉。
世界知识产权组织2003年11月27日公开了一项“Molecular Identification of AspergillusSpecies”发明专利申请(WO03/097815)，该申请公开了一种利用实时PCR方法扩增ITS1五个区域的序列来鉴定和检测曲霉，还公开了该方法可用于诊断曲霉感染，但该方法鉴定不同种的曲霉需要使用不同的探针，成本极高，且临床诊断并不需要鉴定曲霉菌到种，因此该检测方法并不适用于临床诊断。
发明内容
本发明要解决的技术问题是在实现同时检测曲霉菌属中的多种曲霉菌种，范围广并进一步提高检测曲霉菌的特异度。
本发明解决上述技术问题的技术方案是一种检测曲霉菌荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒由引物、DNA聚合酶、荧光探针、定量阳性模板、荧光定量PCR反应液和阴性对照血清(即健康人的血清)组成，其特征在于(1)所述的引物为特异性扩增曲霉菌ITS I区域的引物，其中，上游引物序列为5’-CGGAAGGATCATTACCGAGTGA-3’(SEQ NO.1)，下游引物序列为5’-CCCGCCGAAGCAACAAG-3’(SEQ NO.2)；(2)所述的荧光探针序列为5’FAM-CCAACCTCCCACCCGTGTCTATYGT-BHQ-13’(SEQ NO.3)，其中FAM为标记在探针5’端的荧光基团，BHQ-1为标记在探针3’端的荧光淬灭基团；(3)所述的定量阳性模板为含有序列为SEQ NO.4的DNA片段的pMD19-T重组质粒。
上述方案中序列SEQNO.4具体为cggaaggatcattaccgagtgagggccctctgggtccaacctcccacccgtgtctatcgtaccttgttgcttcggcgggcccgccgtttcgacggccgccggggaggccttgcgcccccgggcccgcgcccgccgaagaccccaacatgaacgctgttctgaaagtatgcagtctgagttgattatcgtaatcagttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcg。
本发明所述的定量阳性模板的构建方法是用引物SEQ NO.5和SEQ NO.6扩增曲霉菌ITS I基因，所得片段大小为234bp，然后将该片段插入质粒载体中构建重组质粒，具体方法为1)以从曲霉菌提取出总DNA为模板，用序列为SEQ NO.5和SEQ NO.6的引物扩增出序列为SEQ NO.4的DNA片段，扩增程序为93℃变性3min后进入循环，93℃ 30s、56℃30s、72℃ 40s，共33个循环，最后一步为70℃ 40s延伸；
2)回收并纯化扩增所得的DNA片段SEQ NO.4；3)将DNA片段SEQ NO.4插入到质粒载体中，即可。
上述方法中，所述的曲霉菌可以是烟曲霉、黑曲霉、黄曲霉、土曲霉或构巢曲霉；所述的质粒载体是T克隆载体，如pMD19-T载体；所述的将DNA片段SEQ NO.4插入到质粒载体的方法为本领域的常规方法，具体的步骤和工艺参数视所选的质粒载体而定。
本发明所述的试剂盒的使用方法为(1)反应体系如表1所示。
表1 本发明试剂盒PCR反应体系
(2)反应程序37℃5min94℃1min
(3)定量标准曲线制备将定量阳性模板按10倍稀释法稀释成109～101copies/ml 9个浓度梯度，按照上述反应体系和反应程序，每个浓度平行加入3个反应管同时进行扩增，共做4次；反应结束后计算机自动绘制标准曲线Y＝aX+b，R2，其中Y表示起始模板拷贝数的对数，X表示C(t)值。
(4)样品检测取病人血清200μl，按常规提取曲霉菌DNA的方法提取DNA，取5μl作为模板，按照上述反应体系和反应程序进行扩增即可。
(5)结果判断C(t)值小于35.0为阳性，大于35.0为阴性，起始模板拷贝数则根据标准曲线和所得的C(t)值计算。
rDNA是真核生物基因组DNA中的中等重复、并有转录活性的基因家族，本发明人通过大量曲霉菌属内外菌株的多处rRNA基因比对，发现各菌属在ITS I区间差别较大，而曲霉菌种在此间较保守，本发明试剂盒正是通过检测这段序列来判断样品中是否存在曲霉菌，扩增的片段为cggaaggatcattaccgagtgagggccctctgggtccaacctcccacccgtgtctatcgtaccttgttgcttcggcggg(SEQNO.7)，在曲霉基因组中的位置如图1所示，大小为79bp。
与以往检测单种曲霉菌的PCR试剂盒不同的是本发明所述的试剂盒能同时检测出临床上常见的导致侵袭性曲霉感染的曲霉菌如烟曲霉、黑曲霉、黄曲霉、土曲霉和构巢曲霉等，不需要针对不同的曲霉来设计不同的引物和探针，与血清学方法类的试剂盒相比，本发明具有更高的特异度，能快速准确地检测出血液或血清中的曲霉菌，最低检测下线达到5～10CFU/ml，可用于诊断侵袭性曲霉菌感染。
图1是本发明试剂盒扩增的DNA片段的在曲霉基因组中的位置图，图中剖面线方框所示的部位是本发明试剂盒扩增的DNA片段。
图2是实施例2所述的试剂盒的荧光定量PCR的标准曲线图。
图3是实施例2所述的试剂盒检测标准菌株等比例稀释液结果，其中1～6分别为浓度为105个/ml、104个/ml、103个/ml、102个/ml、10个/ml、1个/ml的标准菌稀释液。
具体实施例方式
下面将结合实施例来说明本发明具有的有益效果。
实施例1本发明所述的试剂盒的制备1、检测曲霉菌荧光定量PCR试剂盒的组成上游引物5’-CGGAAGGATCATTACCGAGTGA-3’(SEQ NO.1)，5pmol/μl；下游引物5’-CCCGCCGAAGCAACAAG-3’(SEQ NO.2)，5pmol/μl；荧光探针5’FAM-CCAACCTCCCACCCGTGTCTATYGT-BHQ-1 3’(SEQ NO.3)，10pmol/μl；定量阳性模板含有DNA片段SEQ NO.4的pMD19-T重组载体，浓度是105copy/ml。
DNA聚合酶TaqDNA聚合酶，购自华银生物基因有限公司；PCR Mix购自华银生物基因有限公司；上述核酸均由广州华银生物技术有限公司合成。
2、所述定量阳性模板的制备方法是(1)以从曲霉菌提取出总DNA为模板，用序列为SEQ NO.5和SEQ NO.6的引物扩增出序列为SEQ NO.4的DNA片段，扩增程序为93℃变性3min后进入循环，93℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 40s，共33个循环，最后一步为70℃ 40s延伸；(2)使用DNA胶回收试剂盒回收并纯化扩增所得的DNA片段SEQ NO.4；(3)将DNA片段SEQ NO.4插入到pMD19-T载体中，具体方法是a.DNA片段SEQ NO.4与T载体的连接和转化1)在微量离心管中加入PMD19-T Vector 1μl目的DNA SEQ NO.4 5μldH2O 3μl；2)加入9μl的Ligation Mix；3)16℃反应过夜；4)把感受态细胞DH5α从-80℃冰箱中取出，置于冰中。60μl移至灭菌处理的试管内；5)加入目的DNA 10μl；6)冰中放置30min；7)42℃ 60S；8)冰中放置2～3min；9)加入37℃ LB液体培养基1ml；10)37℃振荡1h(120r/min)；11)取200μl培养基涂板于LB氨苄青霉素固体培养基中；12)37℃过夜培养；13)取3个菌落放入LB氨苄青霉素液体培养基3ml中摇菌扩增24h。
b.重组质粒提取1)取扩增菌液2ml离心10,000g 1min；2)弃上清，加入250μl Solution I/R NaseA悬浮细胞；3)加入250μl SolutionII，轻轻混均，上下颠倒4～6次；4)加入350μl SolutionIII，轻轻混均，上下颠倒直到白色絮状物形成；5)离心10,000g 10min；6)小心把清澈的上清加入到干净的HiBindTMDNA Miricolumn中，离心Miricolumn 10,000g1min；7)去液，加500μl bufferHB洗管后，离心10,000g 1min；8)弃液，加入700μl DNA wash buffer，离心10,000g 1min；
9)重复步骤8)；10)再离心空管10,000g 1min；11)把空管放入干净的1.5ml离心管中，加入去离子水300μl，离心10,000g 1min。
3、鉴定将所得重组质粒用引物SEQ NO.5和SEQ NO.6扩增，反应条件同上，所得产物大小为234bp。
下述实施例所用的试剂盒均为实施例1所述的试剂盒。
实施例2体外检测实验1、模板DNA的制备a.试剂核酸提取试剂盒，购自广州华银生物技术有限公司合成。
b.标准菌株培养及制备曲霉菌标准菌株烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、构巢曲霉，由南方医院提供；待检测样品临床分离的几种曲霉菌；阴性对照菌株白色光滑念珠菌、热带念珠菌、隐球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌。
c.DNA的提取取含菌悬液0.5ml，13000r/min离心6min，弃上清，加入0.2mlTris(100mmol/L，pH7.4)缓冲液，lyticase酶5U，37℃水浴1h。取50μl，用核酸提取试剂盒提取DNA，终体积为20μl(详细步骤请参照试剂盒说明书)。提取的DNA模板-20℃保存备用。
2、荧光定量PCR反应1)反应体系如表2所示表2 本实施例试剂盒PCR反应体系
2)方法每批反应设一个阳性对照，一个空白对照(由dH2O取代)，一个阴性对照(为正常人血的提取标本)，反应程序为37℃ 5min；94℃ 1min 仪器MJ opticon2荧光定量PCR仪，MJ公司(美国)。
3)定量标准曲线制备将定量阳性模板10倍倍比稀释成109～101copies/ml浓度梯度，在上述反应条件下每个浓度平行加入3个反应管同时进行扩增，共做4次，反应结束后计算机自动绘制标准曲线，如图2所示，起始模板在107～104copies/ml时线性较好，结果在Opticon monitor 2软件上分析，得到标准曲线Y＝-0.37X+16.05，R2＝0.997。
4)敏感性、特异度测定取标准菌株储备液按比例稀释为105、104、103、102、10、1个孢子/ml，按照上述方法消化提取模板，用荧光定量PCR分析，以确定最低检测下线。取白色念珠菌、隐球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌标准菌株以及其他几种曲霉菌，挑取菌落制备成细菌悬浊液，消化、提取DNA后分析检测。
结果如图3所示，标准菌株等比例稀释液real-time PCR结果呈现规律的Ct值变化，说明仪器参数稳定，最低检测下线达到5～10CFU/ml。其他几种曲霉菌为阳性扩增。对白色念珠菌、隐球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的检测结果均为阴性，与预期结果完全相同，无非特异度扩增。
实施例3临床实验1、实验方法1)临床标本的收集2006年4月至2007年2月，在广州南方医院共收集高度疑似曲霉菌感染病例71例，标本232份。普通生化管抽取病人静脉血2ml，4000r/min离心8min，取300μl、400～600μl血清分装在无菌1.5mlEP管中，编号登记，-20℃冰箱保存。
2)主要仪器MJ opticon2荧光定量PCR仪MJ公司(美国)生物安全柜 haier公司(中国)高速离心机 TG16-WS(中国)
水浴槽 江苏太仓市实验设备厂超净工作台 苏州净化设备厂涡旋振荡器 Thermolyne M63210-26(美国)全自动酶标分析仪BIO-RAD公司(美国)3)纳入排除标准对血液科、肿瘤科、肝肾移植的免疫力低下高度疑似曲霉菌感染的病人进行研究。纳入病人必须符合1项宿主因素、1项临床标准或微生物学标准。如下宿主因素(1)外周血中性粒细胞减少中性粒细胞计数＜0.5×109/L，且持续10d以上；(2)体温＞38℃或＜36℃，且存在下列任何1种易感因素①之前60d内出现过长期中性粒细胞减少(10d以上)；②之前30d内，曾使用过或正在使用强效免疫抑制剂；③侵袭性真菌感染病史；④患者同时患有艾滋病；⑤存在移植物抗宿主病的症状和体征；⑥长期使用类固醇激素(3周以上)。
临床标准持续发热超过96h，合理的广谱抗生素治疗无效。下呼吸道感染主要标准CT检出以下任何1种渗出征象光晕征；新月形空气征；实变区域内出现空腔。次要标准下呼吸道感染症状(咳嗽，胸痛，咯血，呼吸困难等)。
微生物学标准(1)痰液或支气管肺泡灌洗液培养呈真菌；(2)痰液或支气管肺泡灌洗液经直接镜检或细胞学检查，发现曲霉菌；(3)支气管肺泡灌洗液、脑脊液或2份以上的血液样品呈曲霉菌抗原阳性；(4)无菌体液中，经直接镜检或细胞学检查，发现曲霉菌；(5)血培养呈真菌阳性；(6)肺部异常，与下呼吸道感染的相关标本中(血液、痰液和支气管肺泡灌洗液等)无法培养出任何致病细菌。
排除标准溶血严重的血标本。
侵袭性真菌感染(IPFI)的诊断由宿主因素、临床特征、微生物学检查和组织病理学四部分组成。临床诊断IPFI分确诊、临床诊断及拟诊3个级别，判断标准如表3所示。
表3 侵袭性真菌感染的诊断标准
4)临床研究步骤对符合上述纳入标准的病人进行跟踪研究。争取在使用抗真菌类药物以前抽血，而后每周1-2次，40天为一个试验研究周期。而后继续跟踪病人情况，直致出院或死亡。收集到一定数量后，用本发明试剂盒和曲霉菌抗原检测试剂盒(sigma公司)，下面将简称为ELISA试剂盒，对标本进行检测。
统计学方法检测结果用SPSS12.0分析，对ELISA方法和PCR方法的敏感度、特异度做x2检验即McNemar检验。取α＝0.05水准双侧检验。
2、实验结果根据中华内科杂志编辑委员会2006年8月在中华内科杂志发表的《侵袭性肺部真菌感染的诊断标准与治疗原则(草案)》，对71个病例进行判别分类，其中确诊10例，临床诊断30例，拟诊8例，非曲霉菌感染病例23例。
(1)实施例1所述的试剂盒对71个病例、232份标本的检测阳性率为42.2％(98/232)。结果见表4敏感度为87.5％(42/48)，特异度为95.6％(22/23)，准确度为90.1％(64/71)。阳性预测值为97.6％(41/42)，阴性预测值为75.8％(22/29)。
表4 本发明试剂盒的诊断结果
(2)曲霉菌抗原检测试剂盒的检测结果见表5敏感度为91.6％(44/48)，特异度为60.8％(14/23)，准确度为81.6％(58/71)。
表5 曲霉菌抗原检测试剂盒的诊断结果
(3)两种试剂盒的比较对48例诊断为曲霉菌感染的病人，用本发明试剂盒和ELISA试剂盒检测结果的配对计数资料的x2检验即McNemar检验，结果如表6所示，P＝0.549(双侧)，P＞0.05，我们认为两种方法的敏感度差异无显著性意义；Kappa＝-0.119，kappa＜0.4，说明两者吻合度较弱。
表6 两种试剂盒的敏感度比较
对23例诊断为非曲霉菌感染的病人，进行荧光定量PCR和ELISA方法配对计数资料的x2检验即McNemar检验，结果如表7所示，P＝0.021(双侧)，P＜0.05，我们认为两种方法的特异度差异有显著性意义，荧光定量PCR的特异度较高。Kappa＝-0.085，kappa＜0.4，说明两者吻合度较弱。
表7 两种试剂盒的特异度比较
上述实验结果表明，本发明试剂盒与曲霉菌抗原检测试剂盒相比，在保证检测敏感度相当的情况下，大大提高了特异度，可见，本发明试剂盒应用于侵袭性曲霉菌感染的诊断具有快速且更准确的优点。
SEQUENCE LISTING<110>南方医科大学<120>一种检测曲霉菌荧光定量PCR试剂盒<160>7<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1cggaaggatc attaccgagt ga 22<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>2cccgccgaag caacaag 17<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>3ccaacctccc acccgtgtct atygt 25<210>4<211>234<212>DNA<213>人工序列<400>4cggaaggatc attaccgagt gagggccctc tgggtccaac ctcccacccg tgtctatcgt60
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权利要求
1.一种检测曲霉菌荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒由引物、DNA聚合酶、荧光探针、荧光定量PCR反应液、定量阳性模板和阴性对照血清组成，其特征在于(1)所述的引物为特异性扩增曲霉菌ITS I区域的引物，其中，上游引物序列为5’-CGGAAGGATCATTACCGAGTGA-3’(SEQ NO.1)，下游引物序列为5’-CCCGCCGAAGCAACAAG-3’(SEQ NO.2)；(2)所述的荧光探针序列为5’FAM-CCAACCTCCCACCCGTGTCTATYGT-BHQ-1 3’(SEQ NO.3)，其中FAM为标记在探针5’端的荧光基团，BHQ-1为标记在探针3’端的荧光淬灭基团；(3)所述的定量阳性模板为含有序列为SEQ NO.4的DNA片段的pMD19-T重组质粒。
2.权利要求1所述的一种检测曲霉菌荧光定量PCR试剂盒，其中所述的定量阳性模板的制备方法，该方法由以下步骤组成(1)以从曲霉菌提取出总DNA为模板，用序列为SEQ NO.5和SEQ NO.6的引物扩增出序列为SEQ NO.4的DNA片段，扩增程序为93℃变性3min后进入循环，93℃30s，56℃30s，72℃40s，共33个循环，最后一步为70℃40s延伸；(2)回收并纯化扩增所得的DNA片段SEQ NO.4；(3)将DNA片段SEQ NO.4插入到pMD19-T中，即可，上述步骤(1)中所用的曲霉菌是烟曲霉、黑曲霉、黄曲霉、土曲霉或构巢曲霉。
全文摘要
本发明提供了一种检测曲霉菌荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有引物5’－CGGAAGGATCATTACCGAGTGA－3’(SEQ NO.1)，5’－CCCGCCGAAGCAACAAG－3’(SEQ NO.2)；和荧光探针5’FAM－CCAACCTCCCACCCGTGTCTATYGT－BHQ－1 3’(SEQ NO.3)。本发明试剂盒特异性扩增曲霉菌ITS I区间的基因，产物大小为79bp，能快速准确地检测出常见的多种致病曲霉菌(如烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉和构巢曲霉)，最低检测下线达到5～10CFU/ml，用于临床诊断侵袭性曲霉菌感染具有很好的敏感度和特异度。
文档编号C12Q1/04GK101038254SQ200710027789
公开日2007年9月19日 申请日期2007年4月29日 优先权日2007年4月29日
发明者王前, 张梦宇 申请人:南方医科大学