专利名称：玉米钙调磷酸酶b类似蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于玉米的钙调磷酸酶B类似蛋白(calcineurin B-like protein，CBL)及其编码基因与其在提高植物耐盐性中的应用。
背景技术：
土壤盐渍化是限制作物生长和造成作物减产的主要非生物胁迫之一。全世界约有20％的耕地和50％的灌溉田受到不同程度的盐害威胁，并有逐年增加的趋势。我国盐渍土地面积约为1.4亿亩，占耕地总面积的近7％，此外还有盐渍荒地2亿多亩。通过基因工程培育耐盐作物品种是开发利用盐渍地最有效、快捷的途径之一。但是迄今为止，在已经分离和鉴定过的基因中，可供基因工程利用的耐盐基因很少，而且有些来自细菌和真菌，其安全性常引起争议。因此，进一步从基因水平研究植物的耐盐机理，从植物中分离并发掘耐盐基因具有重要意义。
土壤或环境中因盐分过多对植物产生的危害又叫盐胁迫。盐胁迫对植物的危害主要包括离子毒害、渗透胁迫、营养胁迫和氧胁迫等方面(1)离子毒害目前认为盐土中危害植物生长的主要成分是Na+，Na+大量进入细胞是导致盐害的主要原因。Na+的毒害是多方面的。首先，Na+与Ca2+的离子半径非常相近，因此Na+可置换细胞膜系统上结合的Ca2+，使膜结构的稳定性及完整性受到破坏，膜的通透性增加，膜功能受损。其结果一方面是可引起细胞内可溶性物质(包括K+等)外渗，另一方面是可使液泡膜上的H+质子泵活性改变，造成膜两侧的H+质子浓度梯度下降甚至消失，液泡碱化，细胞微环境改变。其次，Na+与K+有着相似的化学结构与物理特性，细胞质中大量积累的Na+会与K+形成竞争，直接取代酶活性中心的K+或与某些酶的抑制区结合，从而导致许多酶活性的丧失。因此，细胞质中Na+/K+比值可能是决定Na+毒性的关键。
(2)渗透胁迫盐胁迫与渗透胁迫有着不可分割的关系。过多的盐分会使土壤水势降低，造成植物根系吸水困难，甚至体内水分外渗，所以渗透胁迫是盐胁迫导致植物受害的重要原因。
(3)营养胁迫植物在吸收矿质元素的过程中，一些化学结构及物理特性相近的元素之间存在着竞争关系。许多研究结果证明，高浓度的Na+可抑制植物对K+和Ca2+等必须元素的吸收和积累，从而导致细胞内这些元素的缺乏和离子不平衡。K+是植物必需的大量元素，在维持细胞生长和膨压、调节气孔运动和酶活性等方面均起到重要作用。因此维持细胞内K+、Na+平衡是植物耐盐的重要机制。Ca2+不仅是维持植物细胞结构、酶活性和许多代谢反应的必需成分，更重要的是作为第二信使直接介导细胞内的多种信号途径，从而在植物对逆境胁迫和发育信号的响应中发挥重要调节作用。增加外源Ca2+浓度可以减轻盐胁迫对植物的毒害已经被许多实验所证实。
(4)氧胁迫高盐还能打破植物细胞内活性氧的平衡，导致活性氧过度积累。活性氧含量增高能引起膜脂过氧化或膜脂脱脂作用，从而导致膜的完整性受损，此外还会对蛋白质和核酸等大分子造成损伤。
植物对盐胁迫的适应能力称为耐盐性。研究植物的耐盐机理，分离耐盐基因并通过基因工程培育耐盐高产新品种是多年来国内外学者的不懈追求。通过对模式植物拟南芥的研究，研究人员已经从分子水平上对植物的耐盐机理有了一定了解，并通过转基因技术培育出一些耐盐性明显提高的株系。但迄今为止，已经克隆到的耐盐基因非常有限，其中通过基因工程手段能够提高植物耐盐性、有实际应用价值的耐盐基因更是寥寥无几。以下是目前有关植物耐盐机理的研究结果离子平衡的维持在高盐环境下，维持细胞内的离子平衡，尤其是K+、Na+平衡是植物耐盐的重要机制。现有的研究资料表明，植物对离子平衡的维持需要通过几条途径进行调节，包括限制盐的吸收、增加盐的外排和对吸收的盐分进行区隔化，以及控制盐分从根系向地上部进行长距离运输。
(1)限制Na+内流质膜对Na+的不通透性是限制Na+扩散进入细胞的天然屏障，但在高盐环境下，仍然有大量Na+进入细胞。关于Na+如何进入植物细胞尚无定论，可能通过下列途径一是外整流型阳离子通道，高盐环境和质膜去极化增加了该通道开放的可能性，Na+顺巨大的电化学梯度流入细胞。因此任何减少该离子通道开放的调节都能限制Na+进入细胞而增强耐盐性。二是对电压不敏感的一价阳离子通道(voltage-insensitive monovalent cation channel，VIC)，但其分子基础仍不明确。三是通过低亲K+系统。Na+、K+的跨膜运输相互竞争，表明二者可能有相似的吸收机理。K+的吸收通过高亲K+和低亲K+两种系统进行。在低K+(10-30μM)环境时，通过高亲K+系统吸收，并且不受Na+阻碍。这种高亲K+系统可能就是由K+/H+共运输体HKTI组成。而在高K+(300μM以上)环境时，通过低亲K+系统吸收，此时表现为低的Na+、K+选择性，Na+可能通过此途径进入细胞。因此在盐胁迫下启动高亲K+系统，从而特异性地吸收K+而阻止Na+内流便成为植物耐盐的重要机制。
(2)Na+的外排与区隔化通过质膜上的Na+/H+反向转运体将Na+运出细胞可能是高等植物外排Na+的主要机制。质膜Na+/H+反向转运体由多基因家族编码，从拟南芥中分离到的SOS1即属于该家族成员之一。SOS1基因突变导致拟南芥对氯化钠和氯化锂超敏感，SOS1mRNA在根尖表皮细胞和根、茎、叶质外体与共质体交界处的软组织中表达量非常高，膜转运实验进一步证明SOS1蛋白具有Na+转运活性。这些证据表明SOS1蛋白在拟南芥细胞内Na+跨膜外排中具有重要功能。将细胞内过多的Na+储存在液泡中是植物降低Na+毒害的另一重要机制。这一过程是通过液泡膜上的Na+/H+反向转运体完成的，近年来已经从拟南芥等植物中分离到这类蛋白的编码基因。Na+的液泡内仓储一方面将Na+与细胞质中的酶和质膜等敏感成分隔开，同时还可以平衡由高盐所造成的细胞外渗透胁迫，使细胞尽可能多地吸收水分。
(3)Na+在体内的运输和分配限制Na+从根部向地上部运输，以及Na+在地上部各器官和组织之间的合理分配是构成耐盐性的又一重要因素。控制Na+长距离运输的步骤是Na+在根表皮细胞中的快速装载和在木质部的卸载。拟南芥中控制根部Na+运向地上部的一个组分是SAS1，其突变造成地上部中Na+含量增加几倍而根中Na+含量不变。另一个将Na+在木质部卸载的组分是SOS1。sos1突变体在中度盐浓度下地上部积累的盐分少于野生型，而在高盐条件下其地上部比野生型积累较多的盐分，因此推测在中度盐浓度下SOS1可能促进Na+从木质部向地上部转运，而在高盐条件下SOS1可能又会限制这种转运过程，从而减轻Na+对地上部生长点的危害。
调渗物质和盐胁迫相关蛋白的合成盐胁迫诱导植物体内合成的调渗物质分两类一类是小分子有机化合物，包括脯氨酸、甜菜碱、甘露醇、海藻糖、山梨醇和多胺等，另一类是蛋白质/调渗蛋白(osmotin)。此外还合成一些解毒酶，如谷胱甘肽S转移酶、可溶性环氧化物水解酶、超氧化物酶、过氧化氢酶和抗坏血酸过氧化物酶等，以及许多功能未知的蛋白。这些物质的作用主要是调节渗透平衡、清除活性氧或阻止其对细胞结构与大分子的损伤。干旱、高温和低温等逆境胁迫也会诱导这些物质的合成，这与其作用机制是相符的，因为这些非生物逆境都可以对植物造成渗透胁迫和活性氧伤害，而这些保护性物质的积累是植物抗逆的重要机制之一。
拟南芥的盐胁迫离子平衡信号转导途径-SOS途径植物耐盐性的产生是由多种信号途径交叉对话、共同作用的结果。这些信号途径涉及离子平衡、渗透调节、解毒反应和细胞分裂与生长调节等诸多方面。目前在高等植物中除了拟南芥的SOS途径外，对其它途径的组成及其信号级联反应了解不多。
SOS途径的发现始于对拟南芥盐超敏感突变体，即sos(salt overly sensitive)突变体的筛选。从1996年开始，美国亚利桑那大学Zhu等(Wu，S.J.，Ding，L.，Zhu，J.K.(1996)SOS1，a genetic locus essential for salt tolerance and potassiumacquisitíon.Plant Cell 8617-627；Liu，J.，Ishitani，M.，Halfter，U.，Kim，C.S.，Zhu，J.K.(2000)The Arabidopsis thaliana SOS2 gene encodes a proteinkinase that is required for salt tolerance.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 973730-3734；Liu，J.，Zhu，J.K.(1998)A calcium sensor homolog required forplant salt tolerance.Science 2801943-1945；Shi，H.，Kim，Y.S.，Guo，Y.，Stevenson，B.，Zhu，J.K.(2003)The Arabidopsis SOS5 locus encodes a putativecell surface adhesion protein and is required for normal cell expansion.PlantCell 1519-32).通过对拟南芥sos突变体的研究，率先在高等植物耐盐性机理方面取得突破性进展。它们共获得5组非等位基因突变体，命名为sos1-sos5，并通过图位克隆分离到5个相应的耐盐基因，即SOS1-SOS5。sos突变体均表现出对氯化钠和氯化锂胁迫的超敏感性。目前对SOS1、SOS2和SOS3的功能较为清楚，其编码产物作用于同一条信号途径。SOS1基因编码一种质膜Na+/H+逆向转运体，其N端含有12个疏水的跨膜结构域，C端为较长的亲水性尾部，位于细胞质一侧，可能与感应细胞质中的Na+浓度有关，它是SOS途径的效应分子。SOS1基因的转录及其蛋白的转运活性至少受SOS2和SOS3的部分调节。SOS2又称为AtCIPK24，编码一种Ser/Thr蛋白激酶，其N端有一个与酵母SNF1激酶(sucrose-non-fermenting protein kinase)和哺乳动物AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinases)相似的催化结构域，C端为调节区，含有一个高度保守的由21个氨基酸残基组成的FISL基序。系列缺失分析表明，FISL基序是介导SOS2与SOS3结合的必须区域。SOS3又称为CBL4，其编码产物为一种钙离子结合蛋白，与酵母和动物钙调磷酸酶的B亚基(CNB)以及动物神经钙传感器(NCS)有较高同源性。推测其氨基酸序列中含有3个与钙离子结合有关的EF手性结构域和一个N端豆蔻酰化特征序列。实验证明钙离子结合以及N端豆蔻酰化对于SOS3在耐盐性中的功能都是必需的。基于上述研究结果，Zhu等(Halfter，U.，Ishitani，M.，Zhu，J.K.(2000)The Arabidopsis SOS2 protein kinasephysically interacts with and is activated by the calcium-binding protein SOS3.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 973735-3740；Qiu，Q.S.，Guo，Y.，Dietrich，M.A.，Schumaker，K.S.，Zhu，J.K.(2002)Regulation of SOS1，a plasma membrane Na+H+exchanger in Arabidopsis thaliana，by SOS2 and SOS3.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 998436-8441；Zhu，J.K.(2002)Salt and drought stress signaltransduction in plants.Annu.Rev.Plant Biol.53，247-273.)提出了拟南芥盐胁迫信号转导的SOS模型在SOS途径中，SOS3感受由盐胁迫所激发的钙信号，然后与其靶蛋白SOS2结合并激活其激酶活性；活化的SOS3-SOS2复合体进一步通过磷酸化作用激活质膜上的SOS1，再由SOS1将胞质溶胶中过多的Na+转运到细胞外，从而维持了细胞内的离子平衡。这一模型已通过SOS途径在酵母中的重建实验得到进一步验证。
耐盐基因分两类，一类是功能基因，其产物为直接在耐盐性中起作用的效应分子，如编码各种小分子调渗物质合成酶的基因和解毒酶类的基因，各种膜运输蛋白、水通道蛋白和一些与盐胁迫相关的代谢酶类的编码基因也属于此类。另一类是调节基因，其产物在盐信号转导途径中位于效应分子的上游，直接或间接地对功能基因的表达或其产物的活性进行调节。已鉴定的调节蛋白包括钙离子感应蛋白、蛋白激酶和转录因子等。近20年来，国内外已经从各种生物，包括细菌、酵母、藻类和高等植物中分离到许多耐盐相关基因，但经功能验证可以提高转基因植物耐盐性者仅占其中一少部分，包括编码调渗物质合成酶、膜运输蛋白和离子泵、抗氧化剂和保护性酶类的功能基因，以及少数调节基因。尽管文献报道这些基因可以提高转基因植物的耐盐性，但多数对于耐盐性的改善程度十分有限，在农业生产中尚无实用价值。造成这一现状的原因主要在于植物耐盐性本身的复杂性以及所用耐盐基因的局限性。植物耐盐性是由多基因控制的数量性状，耐盐性的形成是多个生理过程在器官、组织和细胞等不同层次上综合作用的结果，可能涉及若干信号途径的综合调控。目前，在植物耐盐基因工程中所用的目的基因大多属于耐盐功能基因，转基因在受体细胞中难免受到相关调控途径的影响而不能正常表达甚至发生沉默，再加上多数是单基因转化，因此，通过这一途径来改善植物耐盐性的效果是非常有限的。通过转化耐盐调节基因来调控受体植物的相关代谢过程可能是克服这一局限的有效途径。目前，已经分离并通过转基因验证可以提高植物耐盐性的调节基因很少，包括几种转录因子的编码基因(DREB、Alfinl、MsPRP2和Tsi1等)、酵母的CaN(钙调磷酸酶)基因和HAL1基因、水稻的OsCDPK7(钙离子依赖性蛋白激酶)基因、拟南芥的AtGSK1(糖原合成酶激酶)基因和RS(SR-like剪接蛋白)基因等。其中有些基因(如DREB和OsCDPK7等)还可以提高转基因植物对低温和干旱等逆境胁迫的抗性。
钙离子作为细胞内的重要第二信使，在植物细胞对各种环境胁迫以及自身发育信号的传递过程中起着关键作用。高盐、干旱和低温等逆境胁迫均可以触发植物细胞质中的游离钙离子浓度瞬间升高，从而产生钙信号。一般认为由不同逆境因子所触发的钙信号具有特异性，并被相应的钙离子感应蛋白所识别和传递，进而激活其下游的一系列信号级联反应，最终引起细胞应答。因此，钙离子感应蛋白是各种钙信号途径中最上游的成员，对钙信号的传递及其介导的细胞应答反应具有非常关键的调节作用。至今在高等植物中发现的钙离子感应蛋白主要有三类，第一类是钙调素以及钙调素相关蛋白家族，第二类是钙离子依赖性蛋白激酶(CDPKs)家族，第三类是新近发现的与钙调磷酸酶B类似的蛋白(calcineurin B-like proteins，CBLs)家族。CBL家族在拟南芥和水稻中各有十个成员，其中拟南芥的AtCBL1、4、9和水稻的OsCBL2已经被分离并进行了功能鉴定。AtCBL4/SOS3是第一个被分离和鉴定的CBL基因，在拟南芥的盐胁迫离子平衡信号途径中具有重要调节功能，但至今尚未见到其在转基因植物中可以提高耐盐性的报道。AtCBL1参与拟南芥对低温、干旱和盐胁迫的响应，将其在拟南芥中超表达可以提高植株的耐盐性和耐旱性，但转基因植株的抗冻性却明显降低，这在一定程度上影响了该基因在耐盐基因工程中的应用价值。AtCBL9参与拟南芥对ABA(脱落酸)的响应并在ABA合成中起到重要的调节作用。OsCBL2参与水稻糊粉细胞对GA(赤霉素/酸)的应答，并且可能在GA信号途径介导的糊粉细胞液泡化，即糊粉小泡的形成中行使功能。CBL基因为高等植物所特有，目前尚未见到从其它植物中分离出功能明确的CBL基因的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一个钙调磷酸酶B类似蛋白(calcineurin B-Like protein，CBL)。
本发明所提供的钙调磷酸酶B类似蛋白，名称为ZmCBL4，来源于玉米属玉米(Zeamays L.)，是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)将序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有提高植物耐盐性功能的蛋白质。
序列表中的SEQ ID NO1由211个氨基酸残基组成，其中，自氨基端第44-57位、第81-92位、第118-129位和第162-173位氨基酸残基为与钙离子结合相关的EF手性结构域，自氨基端第1-6位氨基酸残基为N端豆蔻酰化特征基序。
所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。
编码本发明钙调磷酸酶B类似蛋白的基因(ZmCBL4)，其cDNA是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；3)与序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有提高植物耐盐性功能的核苷酸序列；4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO2由636个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-633位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列的蛋白质。
其基因组基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO3的DNA序列；2)与序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有提高植物耐盐性功能的核苷酸序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO3由1994个碱基组成，自5′端第1-82位碱基为该基因组基因的第1个外显子，自5′端第83-199位碱基为该基因组基因的第1个内含子，自5′端第200-282位碱基为该基因组基因的第2个外显子，自5′端第283-392位碱基为该基因组基因的第2个内含子，自5′端第393-452位碱基为该基因组基因的第3个外显子，自5′端第453-527位碱基为该基因组基因的第3个内含子，自5′端第528-636位碱基为该基因组基因的第4个外显子，自5′端第637-833位碱基为该基因组基因的第4个内含子，自5′端第834-886位碱基为该基因组基因的第5个外显子，自5′端第887-1530位碱基为该基因组基因的第5个内含子，自5′端第1531-1605位碱基为该基因组基因的第6个外显子，自5′端第1606-1716位碱基为该基因组基因的第6个内含子，自5′端第1717-1829位碱基为该基因组基因的第7个外显子，自5′端第1830-1939位碱基为该基因组基因的第7个内含子，自5′端第1940-1994位碱基为该基因组基因的第8个外显子。
含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增ZmCBL4中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个目的是提供一种提高植物耐盐性的方法。
本发明所提供的提高植物耐盐性的方法，是将所述玉米钙调磷酸酶B类似蛋白基因ZmCBL4或与ZmCBL4具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列导入植物组织、细胞或器官，植物耐盐性获得提高。
在上述提高植物耐盐性的方法中，所述玉米钙调磷酸酶B类似蛋白基因ZmCBL4既可为ZmCBL4的cDNA序列，也可为ZmCBL4的基因组基因序列；与ZmCBL4具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列，是将ZmCBL4的cDNA或基因组基因序列用已知的方法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用(例如，反义或共抑制技术)中，部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。基因序列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变化的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。
所述玉米钙调磷酸酶B类似蛋白基因ZmCBL4或其同源序列可通过含有ZmCBL4或其同源序列的植物表达载体导入植物组织、细胞或器官；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA系列载体、PER8、PX6、pBI系列载体、pBin系列载体或其它衍生植物表达载体，所述出发载体还可为可在原核生物中复制的载体，如pUC系列载体或pBluescript系列载体等。
使用ZmCBL4或其同源序列构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子；所述组成性表达启动子可为花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子，玉米Ubiquitin启动子或水稻actin1启动子等；所述组织特异性表达启动子可为种子特异性表达启动子、花特异性表达启动子或花粉特异性表达启动子，如2S1启动子(GenBank号NM_118848.2，GI30687489)和NapinA(GenBank号M64633.1，GI349405)启动子；所述诱导型启动子可为受ABA、乙烯或化学等诱导的启动子；上述启动子可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、庆大霉素标记物或卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。所述含新霉素磷酸转移酶基因的宿主植物细胞、组织或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等进行筛选，含潮霉素磷酸转移酶基因的宿主植物细胞、组织或器官可由潮霉素进行筛选。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。经上述方法进行筛选后还可采用Southern、PCR或点杂交等分子检测手段对转基因植株进行检测，以确定其是否转化有目的基因。
其中，以pCAMBIA3301为出发载体，构建的含有ZmCBL4的植物表达载体为p3301-ZmCBL4。
携带有本发明玉米钙调磷酸酶B类似蛋白基因ZmCBL4或其同源序列的植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca2+、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管、微注射、电激、基因枪等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。
此外，通过将转化有本发明玉米钙调磷酸酶B类似蛋白基因ZmCBL4或与ZmCBL4具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列的转基因植株进行继代培养后，可从中进一步筛选出基因型纯合的转基因植株。
本发明的方法对双子叶植物和单子叶植物均适用，因此，所述被转化的植物细胞、组织或器官既可来源于拟南芥、油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕榈树、橄榄树、蓖麻、马铃薯或烟草等双子叶植物，也可来源于玉米、水稻、小麦、大麦、燕麦、黑麦、高梁、谷子或草坪草等单子叶植物。
本发明提供了一个来源于玉米的钙调磷酸酶B类似蛋白ZmCBL4及其编码基因。本发明提供的玉米耐盐调节基因ZmCBL4属于高等植物CBL基因家族成员，其编码蛋白在植物对盐胁迫响应的钙离子信号转导途径中具有重要调节功能，最终使植物的耐盐性增强。转基因实验结果表明，将其在拟南芥sos3突变体中超表达可以完全恢复突变体的耐盐表型，而在野生型中超表达可以明显提高转基因株系在种子萌发期和幼苗生长期的耐盐性。推断ZmCBL4转基因植株的耐盐机理为该基因可以感受由盐胁迫触发的钙信号，并启动植物的离子平衡信号转导途径，即SOS途径，从而使细胞能够在高盐环境下维持离子平衡，植物耐盐性得到增强。本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐盐机制的研究，以及提高植物的耐盐性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物的耐盐基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1A为ZmCBL4基因全长cDNA PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱图1B为ZmCBL4基因基因组DNA PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱图2为ZmCBL4在玉米基因组中拷贝数的Southern blot分析图谱图3A为ZmCBL4基因在不同胁迫条件下在玉米幼苗叶片中的表达动态分析结果图3B为ZmCBL4基因在不同胁迫条件下在玉米幼苗根系中的表达动态分析结果图4为ZmCBL4在玉米不同组织中的特异性表达水平图5为构建的植物表达载体p3301-ZmCBL4的酶切鉴定电泳图谱图6为转基因拟南芥T1代阳性植株中目的基因ZmCBL4的PCR鉴定电泳图谱图7A为ZmCBL4在ZmCBL4转基因拟南芥sos3突变体T3代纯合株系中的Northernblot分析图谱图7B为ZmCBL4在ZmCBL4转基因野生型拟南芥T3代纯合株系中的Northern blot分析图谱图8A为幼苗弯根试验检测的ZmCBL4转基因拟南芥sos3突变体T3代纯合株系在MS附加不同浓度氯化钠或氯化锂培养基上的耐盐性鉴定结果图8B为种子萌发及幼苗生长试验检测的ZmCBL4转基因拟南芥sos3突变体T3代纯合株系在MS附加不同浓度氯化钠或氯化锂培养基上的耐盐性鉴定结果图9为ZmCBL4转基因野生型拟南芥T3代株系在MS附加一定浓度氯化钠或氯化锂培养基上的耐盐性鉴定结果图10A为ZmCBL4转基因野生型拟南芥T3代株系在附加不同浓度氯化钠的MS培养基上的种子萌发率统计结果图10B为ZmCBL4转基因野生型拟南芥T3代株系在附加不同浓度氯化锂的MS培养基上的种子萌发率统计结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见《Molecular CloningA Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rdedition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物及DNA序列均由上海生工生物工程有限公司合成。
实施例1、玉米钙调磷酸酶B类似蛋白基因ZmCBL4的获得及其基因组织结构和基因组拷贝数分析一、玉米钙调磷酸酶B类似蛋白基因ZmCBL4的全长cDNA序列的获得与全长cDNA和基因组DNA的扩增1、玉米钙调磷酸酶B类似蛋白基因ZmCBL4 cDNA序列的获得用拟南芥的钙调磷酸酶B类似蛋白(CBL)的氨基酸残基序列在NCBI、MaizeGDB和TIGR等基因组数据库中对玉米的各种序列进行TBLASTN和BLASTP搜索，并将获得的序列进行拼接组装，结果共得到9个重叠群，即9个推测的玉米的CBL编码序列，然后将这9个推测的CBL氨基酸残基序列与拟南芥中的10个CBL的氨基酸残基序列进行序列比对和聚类分析，结果发现一个与AtSOS3/AtCBL4的编码序列(GenBank号AF192886)同源性最高的基因序列，该序列具有序列表中SEQ ID NO4的核苷酸序列，由1417bp个碱基组成，其编码序列具有序列表中SEQ ID NO2的核苷酸序列，由636个碱基组成，编码序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列，序列表中的SEQID NO1由211个氨基酸残基组成，与AtSOS3/AtCBL4的一致性为57％，相似性为72％，序列分析结果表明该基因编码的氨基酸残基序列中有4个与钙离子结合相关的EF手性结构域(分别为SEQ ID NO1中自氨基端第44-57位、第81-92位、第118-129位和第162-173位氨基酸残基)和一个N端豆蔻酰化特征基序(SEQ ID NO1中自氨基端第1-6位氨基酸残基)，将该基因命名为ZmCBL4，其编码蛋白命名为ZmCBL4。
2、玉米钙调磷酸酶B类似蛋白基因ZmCBL4 cDNA序列的扩增根据ZmCBL4基因完整编码框两端的序列设计一对引物(SN1和AB1)，引物序列如下SN1(上游引物)5’-GATCCATGGGCTGCGCGACGTCCAA-3’；AB1(下游引物)5’-GTGGGTCACCATACGCAGATGTACGCAAAC-3’。
用热酚法提取玉米旱21(由山西省农业科学院作物研究所提供)自交系幼苗的总RNA，用Promega公司的M-MLV反转录酶并参照说明书反转录合成其cDNA并以此为模板，在引物SN1和AB1的引导下，用常规的PCR法扩增ZmCBL4的全长cDNA。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.4％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1A所示(泳道M为100bp Marker，泳道1和2为PCR扩增产物)，经扩增获得了674bp的DNA片段，与预期结果相符，回收并纯化该片段，将其连接入载体pGEM-T Easy(Promega公司)中，再将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞(三博公司)，筛选阳性克隆，提质粒，得到含有目的片段的重组质粒，命名为pGEM-ZmCBL4，对其进行测序，共对3次独立PCR的pGEM-ZmCBL4重组质粒进行了序列测定，测序结果表明获得了序列正确的ZmCBL4的全长cDNA序列，具有序列表中SEQ ID NO2的核苷酸序列，由636个碱基组成，编码序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列，其中，自5’端第132-171位、第243-276位、第354-387位和第486-519位碱基编码与钙离子结合相关的EF手性结构域，自5’端第1-18位碱基编码N端豆蔻酰化特征基序。
3、玉米钙调磷酸酶B类似蛋白基因ZmCBL4基因组DNA的扩增用CTAB法提取玉米旱21自交系幼苗的基因组DNA，在引物SN1和AB1的引导下，用常规的PCR法扩增ZmCBL4的基因组DNA。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1B所示(泳道M为100bp Marker，泳道1和2为PCR扩增产物)，经扩增获得了2032bp的DNA片段，与预期结果相符，回收并纯化该片段，将其连接入载体pGEM-T Easy中，再将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，得到含有目的片段的重组质粒，命名为pGEM-ZmCBL4Z，对其进行测序，测序结果表明获得了序列正确的ZmCBL4的基因组DNA，具有序列表中SEQ ID NO3的核苷酸序列，由1994个碱基组成，编码序列表中SEQ IDNO1的氨基酸残基序列。
二、ZmCBL4基因组织结构与基因组拷贝数分析1、基因组织结构分析将步骤一经测序获得的ZmCBL4基因的cDNA序列与基因组DNA序列进行序列比对分析，结果表明该基因的基因组DNA具有7个内含子和8个外显子，其中，自5′端第1-82位碱基为该基因组基因的第1个外显子，自5′端第83-199位碱基为该基因组基因的第1个内含子，自5′端第200-282位碱基为该基因组基因的第2个外显子，自5′端第283-392位碱基为该基因组基因的第2个内含子，自5′端第393-452位碱基为该基因组基因的第3个外显子，自5′端第453-527位碱基为该基因组基因的第3个内含子，自5′端第528-636位碱基为该基因组基因的第4个外显子，自5′端第637-833位碱基为该基因组基因的第4个内含子，自5′端第834-886位碱基为该基因组基因的第5个外显子，自5′端第887-1530位碱基为该基因组基因的第5个内含子，自5′端第1531-1605位碱基为该基因组基因的第6个外显子，自5′端第1606-1716位碱基为该基因组基因的第6个内含子，自5′端第1717-1829位碱基为该基因组基因的第7个外显子，自5′端第1830-1939位碱基为该基因组基因的第7个内含子，自5′端第1940-1994位碱基为该基因组基因的第8个外显子。
2、用Southern杂交法进行基因组拷贝数分析用Southern杂交法对ZmCBL4基因进行拷贝数分析，方法为取30μg玉米自交系旱21幼苗的基因组DNA，分别用限制性内切酶EcoRI、EcoRV、HindIII、BamHI、Kpn I和Sac I进行单酶切消化，对酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，然后用碱转移液(见Sambrook，et al.，《Molecular CloningA Laboratory Manual》，3rdedition，2001，NY，Cold Spring Harbor)转移至Southern印迹膜，再以ZmCBL4基因的全长cDNA为探针进行杂交(用Promega公司的Prime-a-Gene Labelling System试剂盒并参照试剂盒说明书制备探针)；预杂交和杂交液为Church缓冲液(见Sambrook，et al.，《Molecular CloningA Laboratory Manual》，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)；杂交结束后，依次用2×SSC+0.5％SDS、1×SSC+0.5％SDS、0.5×SSC+0.5％SDS和0.1×SSC+0.1％SDS洗膜液在65℃下各洗膜一次，每次15min，然后用吸水纸吸掉膜表面的水分，用保鲜膜包好后压磷板，三天后进行图像扫描，结果如图2所示，表明ZmCBL4基因在玉米基因组中只有一个拷贝。
实施例2、ZmCBL4基因的诱导表达和组织特异性表达分析一、ZmCBL4基因在不同胁迫条件下的表达动态分析首先用常规的Northern blot法分析ZmCBL4基因在不同胁迫条件(250mM NaCl、20mM LiCl、100μM ABA、20％PEG溶液)下的表达情况，结果均未检测到杂交信号，表明该基因的表达丰度很低，因此改用实时荧光定量PCR(Real-time quantitativePCR，RT-qPCR)技术对ZmCBL4基因在不同胁迫条件下的表达情况进行分析，具体方法包括以下步骤1、胁迫处理用沙培法培养玉米旱21自交系幼苗至三叶期，从花盆中小心取出整株幼苗并洗净根部沙子，用Hogland营养液(配方参见陈建勋，王晓峰.植物生理学实验指导(第二版)，华南理工大学出版社，2006年2月)在通气条件下适应培养三天，然后分别换成250mM NaCl、20mM LiCl、100μM ABA和20％PEG溶液(用Hogland营养液配制)进行胁迫处理，取经胁迫处理0、2、6、12和24小时后的幼苗，将根系和叶片分开并迅速投入液氮，转移至-76℃冰箱中保存。
2、RT-qPCR检测用热酚法分别提取步骤1中经不同胁迫处理的玉米植株的根系和叶片的总RNA，并用RQI DNase(Promega公司)消化，以去除基因组DNA污染，然后以总RNA为模板反转录合成其cDNA，再将合成的cDNA稀释10倍作为RT-qPCR的模板。然后，以玉米α-微管蛋白(α-tubulin)基因(GenBank号X15704)作为内标基因，在数据分析时对不同样品RNA/cDNA模板的上样量进行均一化。根据实时荧光定量PCR引物的设计原则(Applied Biosystems)，用Primer Express 2.0软件设计目的基因ZmCBL4和内标基因α-tubulin的特异性引物，为了避免模板cDNA中可能存在的基因组DNA污染对扩增结果产生影响，将正义引物与反义引物分别设在不同外显子中，引物序列如下检测目的基因ZmCBL4表达水平的引物RTS3(上游引物)5’-TCAGTGTGTTCCACCCTAAAGCA-3’RTA3(下游引物)5’-ATCAAGCAGCGCCAAGACCAT-3’，在引物对RTS3&RTA3引导下，以cDNA作为模板的扩增产物长度预期为128bp，以基因组DNA作为模板的扩增产物长度预期为963bp。
检测内标基因α-tubulin表达水平的引物
TS6(上游引物)5’-GAGCATGGCATTCAGGCTGACG-3’TA6(下游引物)5’-TCAACAAAAACAGCACGGGGCA-3’，在引物对TS6&TA6引导下，以cDNA作为模板的扩增产物长度预期为128bp，以基因组DNA作为模板的扩增产物长度预期为987bp。
以上述经10倍稀释的cDNA作为模板，分别在引物对RTS3&RTA3和TS6&TA6的引导下进行RT-qPCR检测，PCR反应体系为2×SYBR Green I PCR Master Mix(ABI公司)12.5μL，RTS3(或TS6)(10μM)0.5μL，RTA3(或TA6)(10μM)0.5μL，cDNA模板(1∶10稀释)1μL，用灭菌ddH2O补充反应体系至25μL。PCR反应条件为先50℃2min；然后95℃ 10min；再94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 18s，共40个循环；最后95℃15s，60℃ 15s，95℃ 15s，1个循环。反应结束后，对PCR扩增产物进行2.0％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测，结果对目的基因ZmCBL4和内标基因α-tubulin的扩增产物的长度均为128bp，与预期结果一致，说明没有基因组DNA污染。以未处理样品(0h)为参照样品，按照2-△△Ct公式(Liyak，K.J.，Schmittgen，T.D.(2001)Analysis of relativegene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CTmethod.Methods 25402-408)计算ZmCBL4在不同胁迫处理条件下的表达动态。结果表明，在250mM NaCl胁迫下，ZmCBL4在叶片中表达量迅速下调，而在根系中表达量缓慢增加；在20mM LiCl胁迫下，根系中ZmCBL4表达水平的变化动态与氯化钠相似，而在叶片中则是先迅速增加，然后又降低到基础表达水平；100μM ABA处理可以使ZmCBL4的表达迅速上调，尤其是在根系中的上调幅度更加明显，此外在整个处理期间根系和叶片中的上调幅度均表现出波浪式变化；20％PEG胁迫使ZmCBL4的表达水平明显下调，在叶片中变化更为明显。ZmCBL4具体的表达动态及其在不同时间点的相对变化值见图3A(ZmCBL4在叶片中的表达动态)和图3B(ZmCBL4在叶片中的表达动态)。上述试验结果表明，ZmCBL4在玉米幼苗期有一定的基础表达，高盐、高渗或外源ABA处理会使其表达模式发生变化，表明该基因参与玉米幼苗对这些逆境胁迫的应答，并有可能在不同的钙信号途径中发挥调节作用。
二、检测ZmCBL4基因的组织特异性表达情况用与步骤一中相同的RT-qPCR法检测ZmCBL4基因在不同组织和器官中的特异性表达情况，结果如图4所示(1为三叶期的幼根；2为三叶期的幼叶；3为抽雄期的成熟根；4为抽雄期的成熟茎；5为抽雄期的成熟叶；6为抽雄期的雌穗；7为抽雄期的雄穗；8为刚吐出的花丝)，表明ZmCBL4基因在不同组织或器官中的表达丰度存在明显差别，其中以抽雄期的成熟叶、茎和雄穗中表达丰度最低，而在雌穗中最高。如果以抽雄期的成熟叶作为参照样品，在其它组织或器官中的相对表达倍数变动在1.05-10.98之间。此外，ZmCBL4基因的表达丰度在三叶期的幼根中低于幼叶，而在抽雄期的成熟根中却是成熟叶中的近3倍，这种组织特异性表达模式暗示ZmCBL4基因可能在玉米的正常发育过程中参与对某些信号途径的调节。
实施例3、ZmCBL4转基因拟南芥的获得及其耐盐性鉴定一、ZmCBL4转基因拟南芥的获得1、ZmCBL4植物表达载体的构建根据引物SN1和AB1两端设计的NcoI和BstEII酶切位点，用限制性内切酶NcoI和BstEII对含有ZmCBL4全长cDNA片段载体pGEM-ZmCBL4进行双酶切，回收并纯化660bp的ZmCBL4 cDNA片段，将其与经同样酶双酶切的植物表达载体pCAMBIA3301(p3301，澳大利亚CAMBIA公司)载体进行连接，使ZmCBL4在CaMV35S启动子的驱动之下，然后再将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，依次用BamH I进行单酶切及Nco I & BstE II双酶切鉴定，对酶切产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示(泳道1为BamH I单酶切产物，泳道2为Nco I & BstE II双酶切产物，泳道M为1kb Marker)，经BamH I单酶切可获得9073bp和844bp的DNA片段，经Nco I & BstE II双酶切可获得约9257bp和660bp的DNA片段，与预期结果相符，表明获得了插入序列及位置正确的ZmCBL4的植物表达载体，命名为p3301-ZmCBL4。
2、转化拟南芥取步骤1获得的质粒p3301-ZmCBL4约1μg，将其转化农杆菌GV3101感受态细胞(三博公司)，在28℃、YEB固体培养基(含卡那霉素Kan 100μg/mL，利福平Rif 125μg/mL)上培养两天，然后挑选三个单克隆在引物对SNI&ABI的引导下做菌液PCR鉴定，结果均扩增出674bp的目标条带，表明目的基因ZmCBL4已转化进农杆菌GV3101中。再将鉴定好的菌液接种于加有卡那霉素Kan 100μg/mL和利福平Rif 125μg/mL抗生素的液体YEB培养基中，在28℃下振荡培养至OD600为0.5-0.8，在4℃、5000rpm离心15min集菌。将菌体沉淀用1×MS大量元素(Murashige and Skoog，1962)加5％蔗糖的渗入缓冲液悬浮，随后用沾花法转化拟南芥sos3突变体植株(Liu andZhu，1998)和野生型植株。转化后代用0.5‰的ppt(除草剂)结合PCR方法(引物对SNI&ABI)进行筛选和鉴定，以未转基因植株为阴性对照，其中，转基因T1代植株的PCR鉴定结果如图6所示(泳道M1kb Marker，泳道1-1010株转基因T1代植株，扩增出674bp目标条带；泳道11未转基因阴性对照)，表明转基因植株的基因组中均整合有ZmCBL4的cDNA。
3、ZmCBL4转基因拟南芥的Northern blot检测用Northern blot方法检测ZmCBL4在转基因拟南芥中的表达情况，包括以下步骤1)用热酚法提取转基因拟南芥的总RNA；2)制备变性胶称取0.72g琼脂糖，加入43.2mL DEPC处理水，微波炉熔化，待冷却至约60℃，加入10.8mL甲醛和6mL 10×MOPS，再加入少量EB，混匀后倒胶；3)样品的制备将20μg总RNA用DEPC处理水补至9μl，依次加入10×MOPS 4μl，甲酰胺20μl，甲醛7μl，混匀，65℃水浴10min，冰浴5min，离心，将溶液收集至管底；4)电泳每份样品加4μl 10×Loading buffer(上样缓冲液)上样，以1×MOPS为电泳缓冲液，先以30V电压电泳，待样品离开点样孔后，加大电压至50V，电泳5-6h；5)转膜电泳完毕后，用DEPC处理水漂洗凝胶3次，每次15min；切去凝胶多余胶边，并切一小角以表明方向；将一磁盘加入碱转移液，架上一块玻璃板，上放4层宽于凝胶的吸水纸，两头浸于液体中，滤纸间不能有气泡；将凝胶点样孔朝下置于滤纸上，排尽其间气泡，胶块四周放好隔水条；将一块长宽均比凝胶大1mm的尼龙膜(已经在碱转移液中均匀浸透，Amersham公司)铺于胶上，再铺上四张与膜相同大小的滤纸，排尽其间气泡；加数层纸巾，其上压一块玻璃板及750g重物，吸印5-6h；将膜取下，用铅笔做标记，在2×SSC(0.3M NaCl，0.03M柠檬酸，pH7.0)中漂洗后放至滤纸上，超净台吹干；将膜夹于滤纸和两块玻璃之间，于80℃烘0.5-1h，用保鲜膜包裹，4℃保存备用；6)探针的标记、杂交及洗膜方法同实施例1中的Southern吸印杂交。
结果共得到拟南芥sos3突变体ZmCBL4转基因T3代纯合株系30个，野生型ZmCBL4转基因T3代纯合株系20个，分别取其中6个拟南芥sos3突变体ZmCBL4转基因T3代纯合株系(SS1、SS13、SS23、SS24、SS28、SS29)和6个野生型ZmCBL4转基因T3代纯合株系(SW8、SW9、SW16、SW17、SW18、SW19)用上述方法进行Northern blot分析，分别以转化p3301空载体的拟南芥sos3突变体(sos3)和野生型拟南芥(WT)为对照，拟南芥sos3突变体ZmCBL4转基因株系的检测结果如图7A所示(sos3sos3突变体对照；SS1-SS296个转基因株系；rRNA为上样量的量参)，野生型ZmCBL4转基因株系的检测结果如图7B所示(WT野生型对照；SW8-SW196个转基因株系；rRNA为上样量的量参)，上述转基因株系均能检测到ZmCBL4的较强表达，证明获得了拟南芥sos3突变体ZmCBL4阳性转基因株系及野生型ZmCBL4阳性转基因株系。
二、转基因株系的耐盐性鉴定
1、ZmCBL4基因在拟南芥sos3突变体中表达可以完全恢复其耐盐性选择步骤一中经Northern blot检测ZmCBL4表达较强的3个sos3突变体T3代ZmCBL4转基因纯合株系(SS1、SS13和SS23)，分别用幼苗弯根试验和种子萌发试验对其进行耐盐性鉴定。幼苗弯根试验方法为将在MS培养基上萌发5d龄的幼苗转移到MS(MS固体培养基1升MS基本培养基中加20g蔗糖，10g琼脂，pH 5.7)、MS添加100-175mM(100、125、150或175mM)NaCl和MS添加10-20mM(10、12、15或20mM)LiCl的三种不同的固体培养基上，根尖朝上垂直放置生长，第12d拍照；种子萌发试验方法为将转基因植株的种子分别点种于MS、MS添加125-175mM(125、150或175mM)NaCl及MS添加12-20mM(12、15、17或20mM)LiCl的三种不同的固体培养基上，在22℃下萌发8d(MS)，14d(含125-175mM NaCl的MS)和12d(含12-20mMLiCl的MS)后拍照。以转化p3301空载体的拟南芥sos3突变体(sos3)和野生型拟南芥(WT)为对照。
幼苗弯根试验结果如图8A所示(以SS1株系为例)，种子萌发试验结果如图8B所示(以SS1和SS13株系为例)，在100-175mM氯化钠胁迫下，ZmCBL4转基因株系的耐盐性均明显比对照sos3突变体强而与野生型没有差别；在10-20mM氯化锂胁迫下，3个转基因株系的耐盐性不仅明显比sos3突变体强，而且也明显超过野生型对照，证明本发明的ZmCBL4基因可提高植物的耐盐性。
2、ZmCBL4基因在拟南芥野生型中表达可以明显提高其耐盐性选择步骤一中经Northern blot检测ZmCBL4表达较强的4个拟南芥野生型T3代纯合株系(SW16、SW17、SW18及SW19)，对其在种子萌发和幼苗生长期的耐盐性进行鉴定，以未转基因的野生型拟南芥(WT)为对照。鉴定方法为按照常规方法将种子消毒，分别接种于MS、MS附加125、150或175mM NaCl，以及MS附加12、15、17或20mM LiCl的固体平板培养基上，4℃春化4d，然后移至正常生长条件(22℃，16h光照/d)下培养，水平或垂直放置，观察记录种子萌发和幼苗的生长情况。
其中，在22℃下萌发10d后在MS附加150mM NaCl，以及MS附加17mM LiCl的固体平板培养基上的SW16、SW17的幼苗生长情况如图9所示，在普通MS培养基上，转基因株系与野生型对照在种子萌发和幼苗生长状况上没有差别，但在不同浓度氯化钠或氯化锂胁迫下，转基因株系的种子萌发及其幼苗生长状况均明显优于野生型对照，这种差别在氯化锂胁迫下尤为突出。以在MS+150mM NaCl培养基上萌发(以绿子叶展开为标准)第5d为例，如图10A所示，四个转基因株系，即SW16、SW17、SW18及SW19的萌发率分别为76.10％、76.37％、73.74％和77.42％，而野生型WT为56.76％，相差大约20％；如图10B所示，在MS+15mM LiCl培养基上萌发5d后，上述四个转基因株系的种子萌发率均在70％以上，而野生型WT只有11.24％。在125mM或175mM NaCl，以及12mM或20mM LiCl胁迫下，这种差别依然存在。当氯化钠浓度达到150mM时，野生型幼苗生长缓慢，逐渐黄化甚至枯萎，而转基因株系苗色正常，仍能保持较快的生长速度；当氯化钠浓度达到175mM时，野生型很难长出真叶并逐渐枯萎，而转基因株系幼苗基本保持绿色，仍能维持一定的生长。在15mM LiCl胁迫下，大部分野生型幼苗逐渐白化死亡，而转基因株系幼苗全部长势良好；当氯化锂浓度增至17mM时，部分野生型种子虽然能够萌发，但绝大部分子叶颜色发白，不能继续生长而枯萎，转基因株系苗色正常，长势仍然较好；当氯化锂浓度高达20mM时，野生型的种子几乎不能萌发，而转基因株系的种子大部分仍能萌发，并且至少有30％以上的绿苗。
上述实验结果表明，ZmCBL4是AtSOS3/AtCBL4的同源基因，参与植物对盐胁迫响应的信号转导过程，它不仅是正常野生型植株耐盐性形成所必需的一个关键基因，而且将其超表达可以显著提高种子萌发期和幼苗生长期的耐盐性，因此该基因可用于植物耐盐性的基因工程改良。
序列表<160>4<210>1<211>211<212>PRT<213>玉米属玉米(Zea mays L.)<400>1Met Gly Cys Ala Thr Ser Lys Gln Phe Ser Arg Ser Ala Pro Ala His1 5 10 15Ala Asp Pro Ala Val Leu Ala Thr Gln Thr Ser Phe Thr Met Asn Glu20 25 30Val Glu Ala Leu Tyr Glu Leu Tyr Lys Lys Leu Ser Cys Ser Ile Val35 40 45Lys Asp Gly Leu Ile His Lys Glu Glu Phe Gln Leu Ala Leu Phe Arg50 55 60Asn Ser Arg Arg Ala Asn Leu Phe Ala Asp Arg Val Phe Asp Leu Phe65 70 75 80Asp Leu Lys Arg Asn Gly Val Ile Asp Phe Glu Glu Phe Val Arg Ser85 90 95Leu Ser Val Phe His Pro Lys Ala Asp Thr Ser Glu Lys Thr Ala Phe100 105 110Ala Phe Lys Leu Tyr Asp Leu Arg Gly Thr Gly Tyr Ile Glu Lys Glu115 120 125Glu Leu Arg Glu Met Val Leu Ala Leu Leu Asp Glu Ser Asp Leu Cys130 135 140Leu Ser Asp Ser Thr Val Glu Thr Ile Val Asp Asn Thr Phe Ser Gln145 150 155 160Ala Asp Ser Asn Gly Asp Gly Arg Ile Asp Pro Glu Glu Trp Glu Glu165 170 175
Phe Val Lys Arg Asn Pro Ala Thr Leu Arg Asn Met Thr Leu Pro Tyr180 185 190Leu Gln Asp Ile Thr Met Ser Phe Pro Ser Phe Ile Met Arg Ser Glu195 200 205Ala Ser Asp210<210>2<211>636<212>DNA<213>玉米属玉米(Zea mays L.)<400>2atgggctgcg cgacgtccaa gcagttcagc aggagcgcgc cggcgcacgc ggatccggcc60gtgctggcga cccagacctc attcacgatg aacgaggtgg aggcgctgta cgagctgtac120aagaagctga gctgctccat cgtcaaagac gggctcatcc acaaggagga gttccagctc180gccttgttca ggaacagcag gagagcgaac ctctttgcag acagggtctt cgatctgttc240gatctcaagc ggaacggagt catcgatttc gaggagttcg tgcggtcgct cagcgtgttc300caccctaaag cagatacgtc ggagaagacg gcgttcgctt tcaagctgta tgatctgagg360gggacaggct acatcgagaa agaagagctg agagagatgg tcttggcgct gcttgatgag420tccgacctct gcctttcaga cagcaccgtc gagacgatcg tcgataacac gttcagccaa480gcggactcga acggagatgg caggatagat cctgaagaat gggaggagtt cgtgaagagg540aacccggcaa cgttaaggaa catgactctc ccctatctgc aggacatcac catgtcattt600ccgagcttca taatgcgttc agaagccagt gactga 636<210>3<211>1994<212>DNA<213>玉米属玉米(Zea mays L.)<400>3atgggctgcg cgacgtccaa gcagttcagc aggagcgcgc cggcgcacgc ggatccggcc60
gtgctggcga cccagacctc atgtgagcat ctcacctccc tccctccccc tcacctccgg120caacgacagc gccaattgcg tgacgctgac ccacgtctgc tgcggctgcg gctgttgtgt180tgcttgtgtg gcatggcagt cacgatgaac gaggtggagg cgctgtacga gctgtacaag240aagctgagct gctccatcgt caaagacggg ctcatccaca aggtggggat cgaccgacga300cccatctcgg tacattccct ggtttctgat acttagatcg cgccgctaac gggttggagt360ctgtgctgtg ttggtttggt ctggtcggcc aggaggagtt ccagctcgcc ttgttcagga420acagcaggag agcgaacctc tttgcagaca gggtaagcat ctcgtgctca ttttcgccct480tacaggacac aggaggagga aactcagttc gtgtttcgcc gtcacaggtc ttcgatctgt540tcgatctcaa gcggaacgga gtcatcgatt tcgaggagtt cgtgcggtcg ctcagtgtgt600tccaccctaa agcagatacg tcggagaaga cggcgtgtac gaactgcata cctcaatgtt660cattcatcat cttcttcttc tcgtgcatta ggccatgttt gcaacgaggg attttttctc720tcgctaaaaa tcctgagctt ctcgcgtgaa attcctgtac ggttcggaat ggccacaccg780agaaaggacg gagatgacat gtttgatttg gacttttctc atcctttatg cagtcgcttt840caagctgtat gatctgaggg ggacaggcta catcgagaaa gaagaggtga tccttcatgc900gttctcttgt atattttcca aagaaaaaaa aacaaccaga gcgcatgcca tttaatgact960ggaaaccata gtgtctgtgt gtttttttag ataatggacc aaaatccggc tttcgcctct1020ttcgaagata aggttaagtt cacacaactt gaaacaaata tccaacagct cacaaaaata1080tgacaaaact gtaagcctaa aagagttaat agcttcccta tttctcaccg actcaaactc1140acttaaaaat taatttatta caacccaatc ctgtttgaaa acctccaacc ctgataatca1200aaaaactgca tgaccaccga ctctagatga cgataagctt ttcttaaaag atctgctctt1260tttcactttt ctgtagttgt gcccgtagtc tgagctaatg agtacctttg actagaacct1320gcaaataagt caacatacgt aatttattaa atattaagtc atttatactt ttccaaaaag1380ctcagcacag tgttgagaca catgtaataa tcagattctt agtatttgga tccatcccgt1440caaccaactc ccaaccataa tgcttgtgta cactgcactt gttcgattct aatataaaac1500agtaactttg ttcttgagaa gcagctgaga gagatggtct tggcgctgct tgatgagtcc1560gacctctgcc tttcagacag caccgtcgag acgatcgtcg ataacgtaac tgatacactg1620ctactctccg ctagtcatca ggtgctagtt tgcaaagatc ccgtctccgt tctaactcgt1680atcatatcgt gctgctctgt tcgcgttgga gtgcagacgt tcagccaagc ggactcgaac1740ggagatggca ggatagatcc tgaagaatgg gaggagttcg tgaagaggaa cccggcaacg1800ttaaggaaca tgactctccc ctatctgcag tgcgtagcat agcgtagcgc atgtcctttt1860ctttcctttc ctttccaaat gatctttcct tcaaaaaaaa aagttctgac tacttttgaa1920attactgttg attgttcagg gacatcacca tgtcatttcc gagcttcata atgcgttcag1980
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1.来自玉米的钙调磷酸酶B类似蛋白，是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)将序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有提高植物耐盐性功能的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于所述蛋白的氨基酸残基序列如序列表中的SEQ ID NO1所示。
3.编码权利要求1或2所述玉米钙调磷酸酶B类似蛋白基因的cDNA序列，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；3)与序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有提高植物耐盐性功能的核苷酸序列；4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述基因的cDNA序列如序列表中的SEQ ID NO2所示。
5.编码权利要求1或2所述玉米钙调磷酸酶B类似蛋白基因的基因组序列，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO3的DNA序列；2)与序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有提高植物耐盐性功能的核苷酸序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
6.含有权利要求3或4或5所述基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。
7.一种提高植物耐盐性的方法，是将权利要求3或4或5所述玉米钙调磷酸酶B类似蛋白基因或与所述基因具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列导入植物组织、细胞或器官，植物耐盐性获得提高。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述玉米钙调磷酸酶B类似蛋白基因或与该基因具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列通过含有该基因或与该基因具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列的植物表达载体导入植物组织、细胞或器官；用于构建所述植物表达载体的出发载体为p3301、PER8、PX6、pBI系列载体、pBin系列载体、pCAMBIA系列载体、pUC系列载体或pBluescript系列载体。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述植物表达载体为p3301-ZmCBL4。
10.根据权利要求7-9任一项所述方法，其特征在于所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。
全文摘要
本发明公开了一个来源于玉米的钙调磷酸酶B类似蛋白及其编码基因与应用。其目的是提供一个来源于玉米的钙调磷酸酶B类似蛋白及其编码基因与其在提高植物耐盐性中的应用。该蛋白是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)将序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有提高植物耐盐性功能的蛋白质。本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐盐机制的研究，以及提高植物的耐盐性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物的耐盐基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号C12N15/55GK101054411SQ20071006526
公开日2007年10月17日 申请日期2007年4月9日 优先权日2007年4月9日
发明者王国英, 王茅雁, 付俊杰 申请人:中国农业科学院作物科学研究所