专利名称：一种植物erf转录因子及其编码基因与应用的制作方法
一种植物ERF转录因子及其编码基因与应用
紗舰
本发明涉及植物耐逆生物技术领域中一种植物ERF转录因子及其编码基因与应 用，特别涉及一个来源于大米草(5^ar""3 a/^h'ca)的与耐逆性相关的ERF转录因 子及其编码基因和应用。
背景技术：
在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的 变化。阐明植物对逆境的反应机制，将为植物抗逆的分子育种提供科学的理论基础。
与植物耐逆相关的基因产物可以分为两大类第一类基因编码的产物包括离子通 道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物保护机制 蛋白；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因
子，如蛋白激酶、转录因子等。由于植物的耐逆性是由多基因调控的复杂性状，依靠 导入单个保护性蛋白基因很难实现植物抗逆性的综合提高。因此，利用一个关键性转
录因子促进多个保护基因的表达，从而增强植物的综合抗逆性，成为植物抗逆基因工 程的希望所在。
ERF/AP2转录因子家族蛋白均含有一段非常保守的由60个氨基酸组成的DNA结合 区域即ERF/AP2结构域。它在拟南芥中有147个家族成员，包括有ERF、 AP2、 RAV三 个亚家族，ERF亚家族只含有一个ERF/AP2结构域，AP2亚家族含有两个ERF/AP2结构 域，而RAV亚家族除含一个ERF/AP2结构域外还含有一个B3 DNA保守结合区 (Genome-Wide Analysis of the ERF Gene Family in ^ra/ij'c/opsj's and Rice. Plant Physiology,2006, 140:411 -432)。
研究表明ERF/AP2转录因子家族除调控与植物生长发育等重要生理过程相关基因 的表达外还在植物的耐逆防御过程中起重要作用。如属于ERF亚家族的CBF1基因可以调 控多个与低温耐性有关的功能基因的表达，过量表达拟南芥的CBF1基因可增强拟南芥 的抗冻倉巨力(Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance. Science. 1998, 280(5360) :36.)。刘强等的研究也证实，ERF 亚家族的DREB1A基因可以同时促进多个与逆境耐性有关的基因表达，DREBIA转基因拟 南芥的抗旱、抗寒性得到增强(Two transcription factors, DREBl and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought— and low—temperature-responsive gene expression, respectively, in Ara^Wo/ Ws. Plant Cell. 1998, 10(8) : 1391-406. )。 HARDY基因 也属于ERF/AP2家族，水稻转基因研究表明，它能增加光合作用效率减少蒸腾，从而增力卩植物对水分的禾U用效率(Improvement of water use efficiency in rice by expression of HARDY, an /4raZ)icfops/s drought and salt tolerance gene. PNAS. 2007, 104(39):15270-15275.)。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物ERF转录因子及其编码基因。
本发明所提供的植物ERF转录因子，名称为DMC ERF，其来源于大米草，是具有 下述氨基酸残基序列之一的蛋白质-
1) 序列表中的SEQ ID Na: 1;
2) 将序列表中SEQ ID Nfl: 1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取 代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的蛋白质。
其中，序列表中的序列1由280个氨基酸残基组成。自序列1的氨基端第107位 至第163位氨基酸残基是ERF/AP2保守结构域。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残 基的取代和/或缺失和/或添加。
上述植物ERF转录因子编码基因(ZWCM"也属于本发明的保护范围。
上述植物ERF转录因子的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一
1) 序列表中SEQ ID Na: 2的DNA序列；
2) 编码序列表中SEQ ID Na: 1蛋白质序列的多核苷酸；
3) 在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID Na: 2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
上述高严谨条件可为在杂交液中60°C下杂交，并在0. 5XSSC， 0. 1% SDS的溶液 中，在6(TC下洗膜。
其中，序列表中的SEQ ID Na: 2由847个脱氧核苷酸组成，自5'第5位至847 位脱氧核苷酸为编码序列。
含有本发明基因的表达载体、人工导入细胞系、宿主菌及表达盒均属于本发明的 保护范围。
利用现有分子生物学的方法可以得到含有"M7fi F的表达载体，如pBI121m: :dmc ERF (物理图谱如图l所示)。
所述表达盒包括植物启动子、DMC ERF基因和终止子。
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本发明的DMC ERF基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加 上任何一种组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植 物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素 等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，其中，单子叶植 物可为各种草坪草、小麦、大麦、燕麦、水稻或玉米等，双子叶植物可为马铃薯、烟
草、棉花、莴苣、番茄、甜瓜、黄瓜、豌豆、甜菜或向日葵等。
携带有DMC ERF基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、 直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织， 并将转化的组织培育成植株。
实验表明，本发明的DMC ERF蛋白及其编码基因能增强植物对逆境，特别是旱胁 迫的耐性。该基因将广泛用于培育耐逆转基因植物，具有深远的理论意义及广泛的实 践意义。
图1为植物表达载体pBI121m物理图谱
图2为植物表达载体pBIl21m: :dmc ERF物理图谱
图3为DMC ERF转基因烟草的耐旱实验结果
图4为DMC ERF转基因烟草的PCR验证照片 实施发明的最佳方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。 实施例1、 DMC ERF编码基因的获得
以液氮研碎-70'C保存的大米草叶片，每O. lg的植物叶片中加入lml TRIZOL RNA
提取液(鼎国生物技术公司)，并按供应商提供的方案进行总RNA的提取。将得到的总
RNA用DNase酶(Prmega， America)消化，以去除残存的DNA，以分光光度计(Eppendorf
公司，德国)检测样品中总RNA的浓度。取5Pg总RNA用反转录试剂盒(宝生物工程(大
连)有限公司)按试剂盒的方法进行反转录，以得到的cDNA片段为模板进行PCR扩增反
应，扩增ERF的cDNA片段。根据已知的ERF/AP2结构域编码序列设计兼并引物dreb-DES:
5， -BMGGCTSTGGCTCGGSAC和dreb-DEA: 5' -GGARTCVGSGAAGTTGAGGC。 25f4 PCR反应体
系为0. lPg cDNA、 1.5mM MgCl2、 20mM Tris-HC1 (pH8. 4) 、 50mM KC1、 0. 2mM dNTP
混合物、0.2MM引物dreb-DES和0. 2MM引物dreb-DEA，以及1U的T叫聚合酶(上海申能博
彩生物技术公司)。按照下列方案在PCR热循环仪(Eppendorf公司，德国)中进行PCR循
环94°C预变性5分钟；再94。C 30秒，55°C 30秒，72°C 30秒，共30个循环；最后72 。p 、说;ff"增塌5il的^n ■mkn rwA ti"BJ田ip防IH1iKr;士念il合(Hk古；祐时/W"力t壯右
限公司)按试剂盒提供的方案回收该片段，用pGEM-Teasy vector系统(Promega公司， 美国)按试剂盒提供的方案克隆该片段并测序(三博远志生物技术公司)，序列分析表 明该序列是ERF/AP2结构域编码基因的保守区片段。根据该区段设计5' RACE和3' RACE
5的特异性引物，取5yg总RNA进行5' RACE和3' RACE反应。RACE程序按照宝生物工程(大 连)有限公司提供的5' RACE和3' RACE试剂盒的说明书进行。5' RACE反应的引物包括: 磷酸化RT引物CGTCGCCGCGGAGAC; dmc ERF-Sl: 5' - GACCAGGCGGCCTACCGTCT; dmc ERF-A1: 5'— TAGGCTAGCGCCGCCTCC; dmc ERF-S2: 5' - TACCGTCTCCGCGGCGAC和dmc ERF-A2: 5'-GCCTCCTCAGCGGTGTCGAA，以磷酸化RT引物进行反转录反应，连接反应后， 再以S1和A1为引物进行第一轮扩增，然后再用稀释100倍的第一轮PCR产物作模板，以 S2和A2为引物进行第二轮PCR扩增。25W PCR反应体系为0. lHg cDNA、 1. 5mM MgCl2、 20mM Tris-HCl (pH8. 4) 、 50mM KC1、 0. 2mM dNTP混合物、0. 2MM正向及反向引物，以 及l个单位的Pfu酶(上海申能博彩生物技术公司)。按照下列方案在PCR热循环仪 (Eppendorf公司，德国)中进行PCR循环。其中，第一轮PCR反应条件94'C预变性5分 钟；再94'C 30秒，57°C 30秒，72°C l分钟，共30个循环；最后72。C IO分钟。第二轮 PCR反应条件94°C预变性5分钟；再94'C 30秒，60'C 30秒，72°C l分钟，共30个循 环；最后72。C IO分钟。3' RACE的引物为dmc ERF-S3: 5'~GACCAGGCGGCCTACCGTCT 和试剂盒提供的接头引物。反应条件94°C预变性5分钟；再94'C 30秒，60°C 30秒， 72°C l分钟，共30个循环；最后72。C IO分钟。
所得5' -RACE和3' -RACE产物经克隆测序，合成引物，取5Mg大米草叶片总RNA， 用反转录试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)按试剂盒的方法反转录得到的cDNA 为模板，克隆ERF基因的cDNA 。合成的引物为dmc ERF-TS: 5'-ATCCATGGCTGCAGCTATAGATCT和dmc ERF-TA: 5'-TTAATCGGCGGCGAGGAG; 25j4 PCR 反应体系为0. lPgcDNA、 1.5mMMgCl2、 20mM Tris-HCl (pH8. 4) 、 50mM KC1、 0. 2mM dNTP混合物、0. 2幽dmc ERF-TS和0. 2幽dmc ERF-TA，以及1个单位的Pfu聚合酶 (上海申能博彩生物技术公司)。按照下列方案在PCR热循环仪(E卯endorf公司，德 国)中进行PCR循环以扩增ERF基因的cDNA: 94°C预变性5分钟；再94°C 30秒，60 °C 30秒，72'C l分钟，共30个循环；最后72'C IO分钟。将扩增得到的片段用凝胶 回收试剂盒(北京天纬时代科技有限公司)按试剂盒提供的方案回收该片段，插入 pBluscript IIKSM的fcoRV位点，该重组质粒被命名为pBS: :dmc ERF，测序(三博远 志生物技术公司)，测序结果表明该片段大小为847bp，具有序列表中序列2的核苷酸 序列，名称为dmc ERF;序列分析表明该cDNA的第5位至847位脱氧核苷酸编码具有 序列1的氨基酸残基序列的DMC ERF。 DMC ERF的自序列1的氨基端第107位至第163
/fiV每甚酸战甚县曲型的t^ IWA转Acm /AD9丝均械
实施例2、 DMC ERF植物表达载体构建和转基因烟草的耐逆实验 1.植物转化载体pBI121(Genebank: AF485783)的改造质粒pCAMBIA2300 (Genebank: AF234315)上的35S启动子(命名为eP35S)片断经as伐I-J力oI双酶切回收后连接到经分AI-酶切的具有相同互补末端的质粒pUC18 (Genbank: L09136)上，然后再经历'73din-双酶切回收，连接到pBI121的相同位点，得到 的重组质粒被命名为pBI121ml。此外，pBI121原有的gusA基因被5feal-feci双酶切 平滑化处理后，插入到质粒pUC18的5feal位点上，再经Ssal-fecl双酶切回收插入到 pBI121ml的相同位点处，该重组质粒被命名为pBI121m (图1)。
2.大米草ERF基因植物表达载体的构建&oRV-AiwI双酶切质粒pBS::dmcERF， 回收0. 89kb的ERF基因片段，插入到具有同样互补末端的经Ai^I-5feal双酶切的质粒 pBI121m上，得到的重组质粒命名为pBI121m: :dmc ERF， ERF基因受到启动子eP35S 的控制，终止子为T加s (图2)。将pBI121m::dmc ERF转入农杆菌LBA4404,得到含 有pBI121m::dmc ERF的农杆菌菌株，命名为TpBI-ERF,将质粒pBI121m转化根癌农 杆菌LBA4404，得到含有pBI121m空载体的菌株，命名为TpBI121m。用无菌刀片将烟 草无菌苗叶片切成四边长约lcm的叶盘，分别在ODeoo值为1的TpBI-ERF和TpBI121m (转空载体对照)菌液中浸泡10分钟，转接入共培养培养基(MS基本培养基加6—苄 氨基嘌呤1. Omg/L、吲哚乙酸O. lmg/L、蔗糖30g/L, pH5. 2)，于25。C暗培养3天，转 入筛选培养基(MS基本培养基加6—苄氨基嘌呤1. Omg/L、吲哚乙酸O. lmg/L、羧苄青 霉素250mg/L、卡那霉素50mg/L、蔗糖30g/L, pH5.8);继续培养14天，再转入再生 培养基(MS基本培养基加6—苄氨基嘌呤1.0mg/L、羧苄青霉素250mg/L、卡那霉素 50mg/L、蔗糖30g/L， pH5.8)。待叶片边缘长出丛生再生芽至2-3cm时，用解剖刀将 再生芽切下，并转入生根培养基(MS基本培养基加卡那霉素50mg/L、蔗糖20g/L， pH5. 8。)中培养20天，共得到36棵转pBI121m::dmc ERF植株和31株转pBI121m植 株。
用CTAB法分别提取转pBI121m::dmcERF和pBI121m烟草基因组DM。分别以500ng 提取的基因组DNA为模板，引物F: 5' -CCCACTATCCTTCGCAAGACC和引物R: 5' -CGTCGCCGCGGAGACCGTAG进行PCR反应。反应体系为25|4，含有500ng基因组DNA、 1. 5mM MgCl2、 20mM Tris-HC1 (pH8. 4) 、 50mM KC1、 0. 2mM dNTP混合物、0. 2幽引物 F和0.2MM引物R、 lU的Taq聚合酶(上海申能博彩生物技术公司)。按照下列方案在 PCR热循环仪(Eppendorf公司，德国)中进行PCR循环先94'C 5分钟；再94'C 30 秒，58。C 30秒，721: l分钟，共30个循环；最后72°C 10分钟。将扩增产物进行电 泳，对转基因植物进行PCR实验确认。
讼转nRT1 91m- PPC1畑苗知枯nRT1 91m f劲教/f7t时昭、袖苗站培；+m
收种，然后同时播种于沙土中，一盆沙土分别成对角播种四棵转基因苗四棵对照。常规 管理，待长至8片叶时停止浇水，三周后复水，一周后观察转pBI121m烟草全部枯萎， 而转pBI121m::dmcERF烟草1号和2号植株恢复生长较为良好，如图3所示。取存活植株的叶片用CTAB法提取其基因组DNA，并用实施例2中的引物对植株进行PCR反应 验证，结果如图4所示，转pBI121m::dmcERF烟草存活植株的PCR扩增产物在预计的 约592bp(箭头示)处有清晰的条带(从左往右第1、 2泳道为1号转基因烟草后代，第3 泳道为2号转基因烟草后代)，而转pBI121m (从左往右第4泳道)烟草无PCR产物条 带。取1号和2号植株的种子重复上述实验，均得到相似的结果。序列表
<160〉 2
<210> 1 <211> 280 〈212> PRT
〈213〉大米草(Spartina anglica) 〈400〉 1
MAMIDLSGE ALMNALEPFI RDASAPHGSA ASPPHQIAGP TSPFAF冊M AYNPYAMVD 60 EAGQLSPAQM QYIQARLHLQ RQAQSVLGAR AQPMKASAAS PRPQKLYRGV RQRHWGKWVA 120 EIRLPRNRTR LWLGTFDTAE EAALAYDQAA YRLRGDMRL NFPDNAASRA PLHASVDAKL 180 QTLCQNISAS KKGSKASATA AAATSSCSSP SSDDASSSCL ESAESSPFTS LSPLPSPEAA 240 TVPEMEQLDF SEAPWDEAAG FALTKYPSYE IDWDSLLAAD 280
〈210〉 2 <211> 847 〈212〉 DNA
<213〉 大米草(Spartina anglica) <400〉 2
atccatggct gcagctatag atctgtctgg ggaggcgctg atgaatgcgc tcgagccttt 60 tatccgggac gcctctgctc cacacggatc cgctgcgtcc cccccgcacc agatcgctgg 120 tcccacctcg ccgttcgcct tccaccacgc cgccgcctac aacccgtacg ccgcagctgt 180 tgacgaggcg ggccagctga gcccggccca gatgcagtac atccaggccc gcctccacct 240 tcagcgccag gcgcagtccg tcctgggcgc ccgggcgcag cccatg肌gg cgtcggcggc 300 ctcgccgcgc ccgcagaagc tgtaccgcgg cgtgcggcag aggcactggg gcaagtgggt 360 ggcggagatc cgcctcccac gcaaccgcac ccgcctctgg ctcggcacct tcgacaccgc 420 tgaggaggcg gcgctagcct acgaccaggc ggcctaccgt ctccgcggcg acgcggcgcg ■ cctcaacttc cccgacaacg ccgcctcacg cgccccgctc cacgcctccg tcgacgccaa 540gctgcagacc ctctgtcaga acatctccgc atccaagaag gggtccaaag cttccgccac 600 ggccgcggcc gcgacgtcct cctgctcatc gccatcctcc gacgacgcgt cctcgtcctg 660 cttggagtca gcggagtcct cgccgttcac gtccctgtca ccgctgccct cccccgaggc 720 cgcgacggtg ccgg卿tgg agcagctgga cttcagcgag gcgccctggg acgaggccgc ■ cggcttcgcg ctcaccaagt acccgtcgta cgagatcgac tgggactcgc tcctcgccgc 840 cgattaa 84权利要求
1、一种植物ERF转录因子蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的蛋白质。
2、 根据权利要求l所述的蛋白质，其特征在于所述蛋白质具有序列表中的SEQ ID Na: 1的氨基酸残基序列。
3、 权利要求1或2所述的植物ERF转录因子蛋白的编码基因。
4、 根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述植物ERF转录因子蛋白的cDNA 基因，具有下述核苷酸序列之一1) 序列表中SEQ ID Na: 2的DNA序列；2) 编码序列表中SEQ ID Na: 1蛋白质序列的多核苷酸；3) 在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID Ma: 2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
5、 含有权利要求3或4所述基因的表达载体。
6、 含有权利要求3或4所述基因的人工导入细胞系。
7、 含有权利要求3或4所述基因的宿主菌。
8、 含有权利要求3或4所述基因的表达盒。
9、 权利要求1或2所述的植物ERF转录因子蛋白及其编码基因在培育耐逆性植物 中的应用。
10、 根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述耐逆性为耐旱性。
全文摘要
本发明公开了一种植物ERF转录因子及其编码基因与应用。该植物ERF转录因子是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的蛋白质。本发明的蛋白及其编码基因能增强植物对逆境的耐性。
文档编号C12N15/82GK101538321SQ20071017911
公开日2009年9月23日 申请日期2007年12月11日 优先权日2007年12月11日
发明者茜 吴, 徐健勇, 蕾 陈 申请人:北京北方杰士生物科技有限责任公司