利用Nsp2基因缺失构建PRRSV基因缺失疫苗毒株的方法及其应用的制作方法

专利名称：：利用Nsp2基因缺失构建PRRSV基因缺失疫苗毒株的方法及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种利用Nsp2基因缺失构建PRRSV基因缺失疫苗毒株的方法及其应用。技术背景猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)最初被称为"猪神秘病"，自从20世纪80年代末期在美国发现以来，广泛流行于各养猪国家，己成为危害全球养猪产业经济的最重要疾病之一。该病的主要特征是种猪繁殖障碍，哺乳仔猪死亡率升高，各年龄段猪特别是哺乳和保育阶段仔猪的呼吸道疾病以及生长和育肥猪的流感样症状。作为PRRS的致病因子，猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)首先在荷兰和美国分离到，并分别作为欧洲型(LV)和美洲型(VR-2332)的原型毒株。PRRSV基因组为单股正链RNA，长约15kb，5'端有帽子结构，3，端有poly(A)尾。基因组RNA有9个开放阅读框(open-readingframes,ORFs)。位于5'端的两个大的ORF约占基因组的五分之四，编码病毒的复制酶多聚蛋白，并在自剪切蛋白酶的作用下产生13种非结构蛋白，其余7个ORF中除了ORF3尚存争议外，都编码病毒的结构蛋白。PRRSV非结构蛋白2(Nsp2)具有胰凝乳蛋白酶样(或微RNA病毒3C样)半胱氨酸蛋白酶结构域、线形B细胞表位和潜在的T细胞表位。推测Nsp2可能与病毒的细胞/组织嗜性和种属特异性、Nsp2/3和Nsp4-8的剪切、双脂膜囊泡(doublelipidmembranevesicles)禾口多蛋白病毒复制酶复合体(multiproteinviralreplicationcomplexes)的组装等有关。然而，除了B细胞表位以外，其它功能都未被证实。无论从核苷酸还是氨基酸水平上分析，Nsp2都是PRRSV变异性最大的区域之一。N印2基因的变异有点突变、插入和缺失突变，不仅在异型毒株之间出现，也常见于同型毒株之间(FangY,KimDY，RoppS，etal.HeterogeneityinNsp2ofEuropean—likeporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusesisolatedintheUnitedStates.VirusRes,2004,100(2):229235)。Nsp2的化学结构多样性与病毒的生物学功能以及临床特征有何关系尚不清楚。反向遗传技术为研究RNA病毒的复制、致病性、毒力差异的分子基础、蛋白功能、病毒与宿主的相互作用以及开发新型疫苗和病毒载体提供了一个崭新的技术平台。目前，已经有5株PRRSV毒株一~"LV、VR-2332、NVSLtt97-7895、P129和PL97-1的感染性克隆获得成功。然而，后续的研究几乎都集中于结构蛋白和非编码区的功能。陈小云等已构建了PRRSVBJ-4株全长cDNA分子(陈小云，杨汉春，郭鑫.猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株全长cDNA的构建.农业生物技术学报，2005,13(1):61-65)。
发明内容本发明的目的是提供一种降低PRRSVBJ-4株毒力的方法。本发明所提供的降低PRRSVBJ-4株毒力的方法，是连续缺失PRRSVBJ-4株基因组的N印2编码区中长度为69nt的核苷酸片段，得到毒力降低的毒株；所述69nt核苷酸片段的核苷酸序列如GenBankAccessionNumberAF331831的自5'末端第2795至2863位所示。为了便于在所得到的毒力降低毒株中插入外源基因，所述方法中，在所述连续缺失PRRSVBJ-4株的Nsp2编码区中长度为69nt的核苷酸片段的基础上，还可再在GenBankAccessionNumberAF331831的自5'末端第2795至2863位中插入限制性内切酶位点，如Hpal位点o上述任一种方法获得的毒株也属于本发明的保护范围。上述任一种方法获得的毒株可用于制备预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合征疫苗。本发明通过SP6启动子控制下的体外转录和脂质体介导的直接转染MARC-145细胞，不但获得了能稳定传代的野生型拯救病毒rV68，而且成功构建并获得了连续缺失PRRSVBJ-4株基因组的Nsp2编码区中长度为69nt的核苷酸片段的拯救病毒rV63。69nt缺失不但可以增加rV63容纳外源基因的能力，也使建立血清学鉴别诊断方法成为可能；引入的I唯一位点也使后续分子操作更加方便。所以rV63可成为PRRS标记疫苗和动脉炎病毒载体的理想候选对象。拯救的PRRSV克隆病毒rV63和rV68在体外具有良好的遗传稳定性。与亲本病毒PRRSVBJ-4相比，野生型克隆病毒rV68在MARC-145细胞上的复制和增殖有所迟滞，而拯救的缺失型克隆病毒rV63有所增强。表明rV63在MARC-145细胞上具有更强的适应和增殖能力。动物感染试验表明，rV68的致病性比亲本病毒PRRSVBJ-4低，而rV63的毒力有进一步的减弱。由该降低PRRSVBJ-4株毒力方法制备的病毒rV63的Nsp2缺失21个氨基酸，具有开发成标记疫苗的潜力，并可以缺失的多肽开发鉴别诊断方法。在开发疫苗过程中，可以利用已经建立的反向遗传技术平台对GP5的糖基化位点进行改造，克服影响中和表位的抑制性因素，以提高疫苗诱导的中和抗体水平。图1为引物P2327F和P2773R从质粒pGEM-A扩增到486bp的特异性片段图2为pTE-nsp2d63转化菌菌落PCR鉴定结果图3为pTE-nsp2d63的EcoT22I和HpaI单酶切鉴定结果图4为pGEM-Ara和pTE-nsp2d63m的fcori^I和yVs6I单酶切鉴定结果图5为pGEM-Ad63转化菌菌落PCR鉴定图6为pGEM-Ad63质粒中N印2编码区的部分缺失结果图7为pWSK-DCBAd63转化菌菌落PCR鉴定图8为pWSK-DCBAd63质粒中连接位点及其两侧部分测序结果图9为第5代克隆病毒与亲本病毒感染后3天引起的CPE(100X)图10为克隆病毒rV68和rV63的间接免疫荧光鉴定图11为克隆病毒rV68和rV63的遗传标记检测图12为克隆病毒rV68和rV63的负染克隆病毒粒子的电镜形态图13为rV63(第20代)与PRRSVBJ-4Nsp2编码区的部分序列比较图14为克隆病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上的生长曲线图15为拯救病毒感染仔猪的肺脏大体病变图16为拯救病毒感染仔猪的体温动态变化图17为拯救病毒感染仔猪的ELISA抗体动态变化图18为拯救病毒感染猪血清RT-PCR检测结果图19为rV68感染猪分离病毒遗传标记检测图20为rV68感染猪分离毒株遗传标记测序鉴定图21为标准质粒实时荧光定量PCR结果图22为拯救病毒感染猪体内病毒抗原的免疫组化检测具体实施方式实施例l、降低PRRSVBJ-4株毒力，得到拯救病毒rV63该实施例中所用的材料A、细胞与毒株MARC-145细胞(中国兽药监察所)，用DMEM培养基培养。PRRSVBJ-4株(中国农业大学)于1997年由杨汉春(杨汉春，管山红，尹晓敏，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与初步鉴定.中国兽医杂志，1997，23(10):9-10)等分离保存，其全基因组测序已经完成(杨汉春等，2001(杨汉春，黄芳芳，郭鑫，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒(PRRSV)BJ-4株全基因组序列测定与分析.农业生物技术学报，2001,9(3):212-218)(GenBank收录号为AF331831)。B、载体、菌株与PRRSVBJ-4cDNA重组质粒pGEM*-TEasyVectorkit购自Promega公司(PromegaCorporation,WI,USA)。重组质粒pGEM-A含有PRRSVBJ-4株1-4629nt的cDNA。pWSK-DCBA含有PRRSVBJ-4基因组全长cDNA，其中引入一个唯一的Ks/I位点作为遗传标记。以上两个重组质粒均由中国农业大学农业部预防兽医学重点开放实验室构建(陈小云，杨汉春，郭鑫.猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株全长cDNA的构建.农业生物技术学报，2005，13(1):61-65)。这两个重组质粒可从中国农业大学农业部预防兽医学重点开放实验室获得。PRRSVBJ-4全长cDNA序列测定为了确证pWSK-DCBA中PRRSVBJ-4全基因的完整性和可靠性，用通用引物和PRRSVBJ-4特异性引物进行全序列测定。测序结果显示pWSK-DCBA中的BJ-4基因组cDNA全长为15412bp(不含poly(A))，基因组5'上游存在一个噬菌体SP6RNA聚合酶启动子核心序列，启动子与病毒基因组第一个核苷酸之间多一个可以促进体外转录效率的外源G。基因组3'有43个poly(A)，比全长连接前(pGEM-D)少40个(陈小云，杨汉春，郭鑫.猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株全长cDNA的构建.农业生物技术学报，2005,13(1):61-65)。此外，与GenBankAccessionNumberAF331831中的序列相比，其Nsp2编码区有3个连续插入的核苷酸。另外，在全长cDNA中有23个随机分布的点突变，其中ll个为同义突变(含引入I位点的突变)，其余12个导致氨基酸的置换，它们分别位于Nsp2、Nsp3、Nsp7和Nsp9的编码区以及0RF4和0RF5(表l)。表1pWSK-DCBA中的BJ-4基因组全长cDNA与PRRSVBJ-4基因组序列比较<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>a核苷酸位置指在PRRSVBJ-4序列中的位置(GenBank收录号AF331831)。bI为人工引入的遗传标记。C、主要分子生物学试剂EasyAhigh-fidelityPCRcloningenzyme、QuikChange*multisite-directedmutagenesiskit购自Stratagene公司(Stratagene，Aarhus，Denmark)。EndoFree*plasmidmaxikit购自QIAGEN公司(QiagenGmbH,Germany)。mMessagemMachine*HighYieldCappedRNATranscriptionkit禾口MEGA⑧clearkit购自Ambion公司(AmbionInc.,Texas,USA)。DMRIE-C(1,2-dimeyristyloxypropyl_3_climethyl_hydroxyethylammoniumbromideandcholesterol)禾口TRIzol"LS购自Invitrogen公司(Invitrogenlifetechnologies,CA,USA);GIBC00pti-MEM*IReducedSerumMedium购自Invitrogen公司(InvitrogeneCorporation,NY，USA)。WizarcTPlusMidiprepsDNAPurifationSystem、AMV反转录酶、蛋白酶K、KspI购自Promega公司。MtI、尸5eI、I以及T4DNA连接酶购自NEB公司(NewEnglandBiolabs(Beijing)Ltd,Beijing)。￡co72^I、A(s6I、//paI、15kbDNAmarker购自宝生物工程(大连)有限公司。RNaseA购自Amresco公司(AMRESC0Inc.，Ohio,USA)。DNA玻璃奶快速纯化回收试剂盒购自北京博大泰克公司。DTT、RNsin、dNTPs、100bpDNALadder和TaqDNA聚合酶购自北京天为时代公司。D、其它试剂PRRSVN蛋白McAbSD0W17(NelsonEA,Christopher—HenningsJ,DrewT,eta丄DifferentiationofU.S.andEuropeanisolatesofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusbymonoclonalantibodies.JClinMicrobiol,1993,31(12):3184-3189)。PRRSVBJ-4株GP5蛋白McAbF12F10由中国农业大学农业部预防兽医学重点开放实验室制备(姚建聪.猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株GP5单克隆抗体的研制[硕士学位论文].北京中国农业大学，2004)。Fluorescein(FITC)-conjugatedAffiniPurerabbitanti-mouseIgG(H+L)购自JacksonI隱unoResearchLaboratories公司IPTG、X-gal、DEPC、琼脂糖购自Sigma公司。饱和Tris酚购自北京鼎国细胞培养用溶液5XDMEM或RPMI-1640浓縮液将GIBC0DMEM或RPMI-1640(InvitrogenCorporation,NY，USA)粉剂按厂家说明书配制，过滤除菌，4。C保存，使用时进行5倍稀释。胎牛血清(FBS)Hyclone公司(HyCloneLaboratoriesInc.，UT，USA)产品，56°C水浴灭活30min，-2(rC保存备用。2X104U/mL青链霉素液(双抗)青霉素、链霉素各2X106U溶于100mL三蒸水中，过滤除菌，分装后，-2crc保存备用。7.5%NaHC037.5gNaHC03溶于100mL三蒸水中，经121。C高压灭菌15min，常温保存备用。生长培养基(10%FBS)于175mL三蒸水中加入50mL5XDMEM或RPMI-1640溶液，25mLFBS,2.5mL2X104U/mL青链霉素液，用7.5%NaHC03溶液调节pH值至7.2-7.4左右，4'C保存备用。维持培养基(2%FBS)于195mL三蒸水中加入50mL5XDMEM或5XRPMI1640溶液，5mLFBS，2.5mL2X104U/mL青链霉素液，用7.5%NaHC03溶液调节pH值至7.2-7.4左右，4'C保存备用。10XNa2EDTA-胰酶溶液(2.5%)Na2EDTA0.2g，NaCl8.0g，KC10.2g，N&HPCX12H202.89g，KH2PO40.2g，溶于90mL三蒸水中，再加入1:250胰酶(AmrescoInc.)2.5g，完全溶解后，加三蒸水补足至100mL,NaHCO:,调节pH至7.2-7.4，过滤除菌，分装，-2(TC保存备用，使用时1:10稀释。PBS(10mmol/L，pH7.4)NaCl8.00gKH2P040.24gNa2HP041.44gKC10.20g加900mL三蒸水，加热完全溶解后，定容至l000mL，121'C灭菌15min。LB/Amp液体培养基于LB液体培养基中，按终浓度100Ug/mL加入氨苄青霉素。LB/Amp固体培养基琼脂粉1.5g溶于100mL液体LB中，115。C高压灭菌20min，冷却至5(TC，加入氨苄青霉素至终浓度为100ug/mL，制备平板。LB/A卿/X-Gal/IPTG平板在制备好的LB/Amp平板上加40uLX-Gal(20mg/mL)和4ulIPTG(200mg/mL)，用灭菌L型玻棒均匀涂布于平板表面，37。C温育至完全吸收。NYZ+液体培养基称NAamine(caseinhydrolysate)10g，YeastExtract5g，NaCl5g，以双蒸水溶解，定容至l000mL，用NaOH调节pH至7.5。高压灭菌，冷却后无菌加入过滤除菌的1mol/LMgCl212.5mL、1mol/LMgS0412.5mL、20%(20g/100mL)葡萄糖20mL，混匀即可。本实施例在含有PRRSVBJ-4基因组全长cDNA的pWSK-DCBA中，缺失PRRSVBJ-4株基因组的N印2编码区中长度为69nt的核苷酸片段，得到重组载体pWSK-DCBAd63;所述69nt核苷酸片段的核苷酸序列如GenBankAccessionNumberAF331831的自5'末端第2795至2863位所示。转染试验证明非缺失的野生型质粒pWSK-DCBA和pWSK-DCBAd63具有感染性，可拯救出病毒。从pWSK-DCBA和pWSK-DCBAd63获得的拯救病毒分别命名为rV68和rV63。拯救的克隆病毒rV68和rV63与亲本病毒BJ-4—样，能在MARC-145上稳定传代20代以上，可引起PRRSV特征性的细胞病变(CPE)。缺失突变病毒rV63在MARC-145细胞上的生长动力学有所增强，达到最高增殖滴度的培养时间分别比亲本病毒PRRSVBJ-4和野生型克隆病毒rV68提前12h和24h。具体的实验方法和结果如下一、重组载体pWSK-DCBAd63的构建1、含有用于缺失Nsp2编码区69nt的486bp核苷酸片段Ad63的重组载体pTE-n印2d63的构建根据PRRSVBJ-4全序列(GenBank序列号AF331831)，用Oligo6.0软件设计克隆和检测引物(表2-l)，引物由上海生工生物工程公司合成。根据Proraega公司的pGEM-TEasy全序列(http:〃www.promega.com/vector/pgemtez.txt)禾口Stratagene公司突变弓l物设计说明书，用Stratagene公司提供的网络共享定点突变引物设计软件(http:〃labtools.stratagene.com/QC)，设计3条5'磷酸化引物(表2)，由上海博亚生物技术有限公司北京合成部合成。表2.用于PRRSVBJ-4Nsp2缺失构建和检测以及pGEM-TEasy载体定点突变引物序列及其位置<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>DetcMlGAACAAGTTTAAGGAGCTACAGAC8817-8841检测DetcM2ATTGGACCTGAGTTTTTCCCACAT9586-9610检测TE127mTCCCAACGCGTTGGATACATAGCTTGAGTATTCTAA109-143定点突变TE1632mTTCGCCAGTTAATAGTTTCCGCAACGTTGTTGCCA1613-1647定点突变TE2855mCGCCATTCAGGCTGGGCAACTGTTGGGAA2841-2869定点突变FlTCGGACGGTAAAAAGAAAAG3829-3848检测G2GCCAAAGAGAAACCAACAAC5404-5423检测a横线处为引入的限制性酶切位点(标于括号内)，加粗部分为突变的碱基，突变引物5'磷酸化。b克隆和检测引物位置是指在BJ-4基因组中的位置(GenBank序列号AF331831);定点突变引物的位置是指在pGEM-TEasy载体中的位置(Promega公司http:〃w冊.promega.com/vector/pgemtez.txt)。以pGEM-A质粒DNA为模板，用EasyAhigh-fidelityPCRcloningenzyme高保真DNA聚合酶和引物P2327F和P2773R(表l)进行。加入以下试剂，建立50uL反应体系。10XPCRbuffer5pLdNTPs(lOmmol/L,2.5mmol/Leach)2yLP2327F(25阔1/L)1uLP2773R(25umol/L)1pGEM-A(约O.2g/L)0.5uLddH2040pLEasyAenzyme(5U/uL)0.5uLPCR循环参数为94°C3min，94°C30s，58°C40s，72°C45s，30个循环后，72°C10min。取5uLPCR产物，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增结果。结果表明用引物P2327F和P2773R从质粒pGEM-A扩增到486bp的特异性片段，名称为Ad63(图1)，大小与设计相符。图1中，M:DNA分子量标准(lOObpDNALadder);1:P2327F和P2773R扩增。用P/。琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，切下目的条带，用玻璃奶回收试剂盒回收。将PCR产物与pGEM-TEasy连接，得到重组载体pTE-nsp2d63。将pTE-nsp2d63转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在LB/Arap/X-gal/IPTG平板上根据蓝白斑初筛重组转化菌。挑选白色菌落，采用前述反应体系(聚合酶换为普通TaqDNA聚合酶)和反应条件进行PCR扩增，取5uLPCR产物电泳检査。菌落PCR结果如图2所示，得到486bp的条带，所选白斑为阳性重组菌。图2中，1-6:pTE-nsp2d63转化菌落；7:阴性对照；8:DNA分子量标准(100bpDNALadder)。对该PCR阳性菌分别用fcoT22I和I进行单酶切鉴定。用1.2%琼脂糖凝胶电泳检查酶切结果。pTE-nsp2d63的酶切鉴定结果如图3所示，表明fcoT22I酶切pTE-nsp2d63得到一条线性化的条带，I酶切pTE-nsp2d63得到一条线性化的条带。图3中，1:pTE-nsp2d63(fcoT22I酶切)；2:pTE-nsp2d63(〃pal酶切)；3:pTE-nsp2d63(未进行酶切)；Ml:15kbDNA分子量标准；M2:100bp梯度DNA分子量标准。将pTE-nsp2d63送上海生工生物工程公司，采用载体通用引物对插入片段进行全序列测定。重组质粒pTE-nsp2d63的测序结果显示插入序列为BJ-4基因组序列的一部分，但在对应于BJ-4的2413位，有一个点突变(T—G),经与pGEM-A序列比较发现这一点突变在模板质粒中已经存在，并不是源于PCR过程。2、将pGEM-A和pTE-nsp2d63质粒的载体序列中的￡coT22I和yVWI破坏构建pGEM-Am和pTE-nsp2d63m经DNAMAN软件分析发现pGEM-TEasy多克隆位点两侧存在fcoT22I和Afe6I位点，妨碍下一步的亚克隆。因此，先用QuikChange8multisite-directedmutagenesiskit和突变引物(表1)将pGEM-A和pTE-n印2d63质粒的载体序列中的￡b。T22I和編I破坏。按如下顺序依次加入各种成分，建立25uL反应体系。混匀、瞬时离心后进行PCR扩增。定点突变的PCR循环参数为95°C1min，95°C1min，55°C1min,65°C15min，共30个循环。10XQuikChange②Multireactionbuffer2.5pLddH201yLQuikSolution0.75ds-廳template(100ng/uU1iiLTE127m(100ng/uL)luLTE1632m(100ng/yL)luLTE2855m(100ng/uL)luLdNTPs1uLQuikChange"MultienzymeblendluL双链模板DNA的消除。PCR反应结束后，将luLZ}otI(10U/yL)直接加入扩增反应管内，用微量加样器轻轻吹吸，充分混匀，瞬时离心，37'C水浴反应1h，消化双链模板DNA。从-80'C取出XLlO-Gold超级感受态细胞，置于冰上融化，混匀后分装到预冷的1.5mL无菌Eppendolf离心管，每支45yL。加入2uLP-ME，混匀后，冰浴10min，每2min轻轻混匀一次。向上述感受态细胞中分别加入1.5uL经Z5d"I处理的单链DNA，轻轻混匀后冰浴30min。42。C准确热激30s，立即冰浴2min。加入预热到42。C的NYr液体培养基500yL，37°C、225r/min震荡培养1h。取适量菌液涂布LB/Amp平板，37"C培养过夜(〉16h)。取pGEM-A和pTE-nsp2d63的突变质粒DNA，分别用fCOT22I、A(6I进行单酶切鉴定。用0.7%琼脂糖凝胶电泳检査酶切结果。将鉴定突变成功的两种质粒分别命名为pGEM-Am和pTE-nsp2d63m。pGEM-Am和pTE-nsp2d63m的酶切鉴定结果如图4所示，pGEM-Am分别经￡coT22I和Afe6I单酶切都得到一条单一线性DNA分子，pTE-nsp2d63m分别经fcoT22I和yViI单酶切都得到一条单一线性DNA分子，表明载体中的fcoT22I和yVWI位点已被破坏，各保留BJ-4cDNA片段中的唯一位点。图4中，1为pGEM-Am的fcoT22I单酶切，2为pTE-nsp2d63m的fcoT22I单酶切，3为pGEM-Am的/fe^I单酶切，4为pTE-nsp2d63m的A(sZI单酶切，Ml为15kbDNA分子量标准；M2:100bp梯度DNA分子量标准。3、含有用于缺失Nsp2编码区69nt的486bp核苷酸片段Ad63的重组载体pGEM-Ad63的构建将pGEM-Am和pTE-nsp2d63m分别进行fcoT22I酶切。将酶切混合物以1%的琼脂糖凝胶电泳显示酶切彻底后，加入5ixL3moL/L的NaAc(pH5.2)和2倍体积的冷乙醇，-20°C沉淀1h;4°C、12000r/rain离心10min，弃上清，沉淀用75%乙醇洗一次；风干后加入39nL灭菌ddH20溶解。将全部￡boT22I酶切产物进行Afe/;I酶切。将酶切产物以1%琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，按前述方法以玻璃奶进行纯化、回收。将pGEM-Am的回收产物(486bp)和pTE-nsp2d63m的回收产物(载体大片段)进行连接。将连接产物分别转化T0P10感受态细胞，涂布LB/Amp+平板，37'C温箱培养过夜。根据前述方法，各挑选若干菌落，以引物P2327F、P2997R(表l)和普通T叫DNA聚合酶进行菌落PCR筛选。PCR循环参数为94°C3min，94°C30s，58°C40s,72°C45s，35个循环后，72°C10min。取5uLPCR产物，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增结果。结果连接产物扩增出约480bp的特异性片段，而pGEM-Am扩增出约550bp大小的片段(图5)。表明含有Nsp2编码区部分缺失的片段Ad63已成功替换pGEM-A中的相应序列。将PCR扩增出约480bp的特异性片段的重组质粒命名为pGEM-Ad63。图5中，1:100bp梯度DNA分子量标准；2:pGEM-A;3、阴性对照；4-7:pGEM-Ad63。为了进一步明确是否产生准确的缺失，将PCR鉴定的阳性重组质粒pGEM-Ad63进行部分测序鉴定。结果证明在pGEM-Ad63中的Nsp2编码区成功缺失掉69nt(GenBankAccessionNumberAF331831的自5'末端第2795至2863位)，同时引入一个/^al位点(GTTAAC)，实际比BJ-4少63nt(图6)。图6中，A:pGEM-A;B:pGEM-Ad63;7;数字指示核苷酸在BJ-4基因组中的位置。4、在含有PRRSVBJ-4基因组全长cDNA的pWSK-DCBA中，连续缺失PRRSVBJ-4株基因组的Nsp2编码区中长度为69nt的核苷酸片段，得到重组载体pWSK-DCBAd63质粒pWSK-DCBA和pGEM-Ad63先以I分别进行单酶切。酶切混合物以0.7%的琼脂糖凝胶电泳证实完全线性化以后，再分别进行AbtI酶切。将酶切混合物以0.7%的琼脂糖凝胶电泳，分别切下pWSK-DCBA经双酶切后得到的长片段条带和pGEM-Ad63经双酶切后得到的短片段条带，进行连接。将连接产物转化DH5a感受态细胞。挑选菌落，以引物Fl(位于A片段)、G2(位于B片段)(表l)和普通T叫DNA聚合酶进行菌落PCR筛选。PCR循环参数为95°C3min，94°C30s，56°C40s,72°C100s，35个循环后，72。C10min。取5uLPCR产物，用1%琼脂糖凝胶电泳检査PCR扩增结果。结果扩增出约1.6kb的特异性片段(图7)，表明Ad63替换掉pWSK-DCBA中的A片段，得到重组质粒pWSK-DCBAd63。图7中，1-2:pWSK-DCBAd63;3:DNA分子量标准(100bpDNALadder);4:阴性对照。将PCR筛选阳性的菌落，接种3mLLB/A卿液体培养基，28。C条件下150r/min震荡培养过夜。之后，按1/500的比例接种至100mLLB/A即液体培养基，28'C条件下150r/min扩大培养12h。以Wizard8PlusMidipr印sDNAPurifationSystem提取和纯化质粒DNA。按说明书方法进行。将纯化的质粒送上海生工生物工程公司，对两个连接位点及其两侧序列和Nsp2编码区进行部分测序。pWSK-DCBAd63中覆盖两个连接位点及其两侧部分序列测序结果(图8)，和Nsp2部分测序结果证实，pWSK-DCBAd63在pWSK-DCBA的基础上，连续缺失PRRSVBJ-4株基因组的Nsp2编码区中长度为69nt的核苷酸片段，而且连接位点和缺失序列附近都未引入新的突变。所述69nt核苷酸片段的核苷酸序列如GenBankAccessionNumberAF331831的自5'末端第2795至2863位所示。二、从pWSK-DCBA和pWSK-DCBAd63分别获得拯救病毒rV68和rV63将从线性化质粒pWSK-DCBA、pWSK-DCBAd63、pWSK-DCBAdl17体外转录而来的RNA用脂质体直接转染MARC-145细胞。由于第一代均未出现CPE，培养5天后，取转染上清接种MARC-145细胞单层连续传代，每代5-7天。直到第4代，仍然未观察到CPE。由pWSK-DCBA和pWSK-DCBAd63转录而来的RNA转染的细胞上清传至第5代时，MARC-145细胞出现明显的CPE，最初呈现局灶性细胞聚集、变圆、皱缩，逐渐脱离细胞单层，最后崩解、脱落(图9)。在感染后5-6天，整个细胞单层完全破坏，大部分细胞脱落。为进一步证实有无病毒低水平复制，对其培养上清进行RT-PCR检测。结果仅从第l代中检测到病毒核酸，而用DetcMl反转录PCR时，却未检测到病毒负链RNA，提示并没有病毒复制。表明，构建的pWSK-DCBAd63具有感染性，可拯救出病毒。从pWSK-DCBA、pWSK-DCBAd63获得的拯救病毒分别命名为rV68和rV63。具体的实验方法如下1、RNA体外转录与纯化将pWSK-DCBA和pWSK-DCBAd63分别用&力I内切酶消化，使闭环质粒DNA完全线性化。将酶切产物进行0.7%的琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果表明pWSK-DCBA和pWSK-DCBAd63分别完全线性化。根据Ambion公司的mMessagemMachine②HighYieldCappedRNATranscriptionkit说明书进行体外转录。根据Ambion公司的MEGA"clearkit说明书进行RNA纯化。2、转染选择形态正常、生长旺盛的MARC-145细胞，胰酶消化后，以约106个/mL的细胞密度转入六孔细胞培养板，每孔2mL。37'C、5%C02、饱和湿度下培养过夜，直至形成80%左右的细胞单层。小心吸出细胞培养上清，每孔加2mL平衡至室温的Opti-MENflReducedSerumMedium洗涤1-2。向无RNase的1.5mL印pendorf管中加入1mL平衡至室温的Opti-MEM"IReducedSerumMedium。将DMRIE-C脂质体涡旋混匀，取10nL加入各管中，并混匀。向各管中分别加入5ugRNA，轻微地短暂地涡旋混匀。立即将脂质体-RNA混合物转入细胞单层，同时设Opti-MEM*IReducedSerumMedium和DMRIE-C脂质体对照。C(X培养箱37'C培养4h后，小心吸出转染液，加入2mL生长培养基。培养5天后，均未出现CPE，取培养上清接种形成80y。单层的MARO145细胞，连续传代，每代5_7天，并逐日观察细胞病变效应(CPE)。直到第4代，仍然未观察到CPE。由pWSK-DCBA和pWSK-DCBAd63转录而来的RNA转染的细胞上清传至第5代时，MARC-145细胞出现明显的CPE，最初呈现局灶性细胞聚集、变圆、皱縮，逐渐脱离细胞单层，最后崩解、脱落(图9)。在感染后5-6天，整个细胞单层完全破坏，大部分细胞脱落。3、克隆病毒的间接免疫荧光鉴定取第5代(出现CPE的第1代)细胞培养上清，接种MARC-145细胞，3天后固定，用针对PRRSVN蛋白和GP5蛋白的特异性单克隆抗体按照参照文献(杨汉春，黄芳芳，张旭，等.用单克隆抗体鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株.中国兽医杂志，1998，23(4):3-5;姚建聪.猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株GP5单克隆抗体的研制[硕士学位论文].北京中国农业大学，2004)的方法进行间接免疫荧光检测，同时以亲本病毒作对照。结果表明，在两个克隆病毒rV63和rV68以及亲本病毒PRRSVBJ-4感染细胞的胞浆内都呈现出特异性荧光，而对照细胞(未转染的MARC-145细胞)无特异性荧光(图IO)，由此表明pWSK-DCBA和pWSK-DCBAd63转染细胞内有PRRSV特异性N、GP5蛋白合成，确定从构建的全长cDNA获得了感染性病毒粒子。图10中，A:N蛋白McAbSD0W17染色，B:GP5McAbF12F10染色；a:rV63;b:rV68;c:BJ-4;d:正常细胞对照(200X)。4、克隆病毒的遗传标记检测由于在构建感染性cDNA时，在特定序列中引入了特异性的遗传标记一KspI和〃paI酶切位点，而在亲本毒株PRRSVBJ-4的相应序列中不存在该标记。从第5代细胞培养上清中提取病毒RNA，分别以引物DetcMl和DetcM2(覆盖克隆病毒中的bpI位点)和P2327F和P2997R(覆盖缺失病毒中的I位点)(表2)进行RT-PCR及特异性遗传标记的酶切鉴定。结果用引物DetcMl和DetcM2从拯救病毒(rV63和rV68)和亲本病毒中均可扩增到793bp大小的片段，而且从拯救病毒(rV63和rV68)获得的产物可被fe/I切成540bp和253bp两条带，但亲本病毒的PCR产物不能被fepl消化(图11中A)。用引物P2327F和P2997R从野生型克隆病毒rV68和亲本病毒BJ-4的培养上清中均可扩增到695bp大小的片段，其产物不能被^psI切割；而从缺失型克隆病毒rV63可扩增到632bp大小的片段，可被^aI切成471bp、161bp两条带(图11中B)。图11中A为引物DetcM2和DetcMlRT-PCR产物的I酶切鉴定；图11中B为引物P2997R和P2327FRT-PCR产物的处sI酶切鉴定。将PCR产物纯化后进行直接测序表明，拯救的克隆病毒rV63、rV68的遗传标记以及rV63Nsp2编码区的缺失(连续缺失PRRSVBJ-4株基因组的Nsp2编码区中长度为69nt的核苷酸片段，该69nt核苷酸片段的核苷酸序列如GenBankAccessionNumberAF331831的自5'末端第2795至2863位所示)确实存在。上述结果进一步证明了拯救的2株克隆病毒(rV63和rV68)源自感染性cDNA，排除了亲本病毒PRRSVBJ-4污染的可能性。5、克隆病毒的形态学观察对出现CPE的克隆病毒体外连续稳定传5代(即第10代)，超速离心后，用PRRSV抗血清(将PRRSV细胞毒经O.OP/。甲醛，37'C过夜灭活。选择SPF猪1头，间隔二周免疫一次，共免疫4次。初次免疫加入弗氏完全佐剂，剂量为lmg。以后每次递增0.5mg。第二次免疫加入弗氏不完全佐剂。颈部皮下和肌肉分点注射。第4次免疫后10天采血，分离血清，得到PRRSV抗血清)，按照文献(PetitMA,Li6vreM，PeyrolS，ets丄EnvelopedparticlesintheserumofchronichepatitisCpatients.Virology,2005，336:144-153)描述的方法进行免疫电镜检测。表明，拯救的克隆病毒粒子呈PRRSV的典型形态特征，即有囊膜的球形病毒粒子，大小为60-80nm(图12)。图12中，A:rV68;B:rV63;比例尺50nm(60万倍)。6、拯救的克隆病毒培养特性分析(1)TCID幼测定按照文献(殷震，刘景华.动物病毒学(第二版).北京科学出版社，1997,329-331)方法，取不同代次的克隆病毒，在MARC-145细胞上测定病毒的毒价。具体方法如下将MARC-145细胞消化后，以1(f个/mL的密度转入96孔细胞培养板，每孔100uL。37°C、5%C02、饱和湿度下培养过夜，形成80%左右的细胞单层，小心吸弃上清。加入PBS小心洗涤一次。将病毒以维持培养基进行10倍连续递增稀释，取10—4-10—8稀释度的病毒接种MARC-145细胞单层，每个梯度4孔，每孔IOOuL，0)2培养箱37'C吸附1h。小心吸弃上清，PBS洗涤一次后，加入IOOUL维持培养基继续培养。2天后，逐日观察CPE，直至感染后5天，记录各个梯度CPE的孔数。根据Reed-MUench法计算TCIDs。。(2)遗传标记的稳定性分析将在MARC-145细胞上培养的第20代病毒，按步骤4的方法进行RT-PCR、酶切鉴定以及测序，检测遗传标记是否稳定存在。(3)生长曲线测定参照文献(YuanS,MickelsonD,MurtaughMP,e"人Erratumto"Completegenomecomparisonofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusparentalandattenuatedstrains".VirusRes,2001，79(1-2):189-200)方法，取第13代亲本病毒和克隆病毒进行。具体方法如下将种毒反复冻融3次，4°C、3000r/min离心30min，弃细胞碎屑，收集上清备用。在MARC-145细胞上测定上清的毒价，以PBS(0.01mol/L，PH7.2)稀释为105TCID5。/mL。将培养过夜(约80%单层)的小瓶(25cm2)MARC-145细胞用PBS洗涤后，分别加入lmL稀释的病毒，37'C吸附1h。弃去接种病毒液，以PBS洗涤后，各加5mL维持培养基继续培养。于不同时间取出200uL培养上清，并向细胞瓶里补加相同量的维持培养基。测定各个时间点培养上清的TCID5。值，绘制生长曲线。在MARC-145细胞上的传代结果表明，2株克隆病毒rV68、rV63在MARC-145细胞上连续传20代，细胞病变稳定。自第6代以后，rV68产生典型CPE的时间一直在感染后84h左右，比亲本病毒PRRSVBJ-4晚24h;而rV63引起典型CPE的时间约在感染后60h，与亲本病毒相似。在显微镜下观察，亲本病毒PRRSVBJ-4和rV63在MARC-145所致的病变比rV68略为严重，细胞脱落的时间早，脱落的面积大。为了解克隆病毒在MARC-145细胞上连续传代后毒价的变化，对第5、9、13、19代培养物进行TCIDs。测定，重复3次，平均毒价如表3所示。除第5代以外，每个克隆病毒不同代次之间的毒价没有显著差异("0.05)。虽然rV63各代毒价比相应的rV68毒价略高，但经t检验进行统计学分析发现除了第5代以外，其它各代之间差异不显著(A0.05)。表明克隆病毒在MARC-145细胞上连续传代毒价稳定，增殖滴度无明显变化。表3不同代次克隆病毒的毒价(LoglOTCID5。/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>对拯救的克隆病毒第20代毒进行RT-PCR及其产物的酶切和序列分析(图13)，结果表明，2个克隆病毒中相应的遗传标记以及rV63中缺失依然存在，表明人为引入的突变能随病毒体外传代而稳定遗传。图13中，加粗部分为^^I位点；短横表示相同；圆点表示缺失。对克隆病毒的第13代培养物在MARC-145细胞上的殖增动态进行了测定，并与亲本病毒进行了比较，结果(图14)表明，Nsp2缺失突变拯救病毒rV63感染MARC-145细胞后，48h可达到最高增殖滴度，且在第36h、48h、60h的培养上清的病毒滴度高于亲本病毒PRRSVBJ-4，具有显著性差异(代0.05)，二者的生长曲线十分相似，但亲本病毒达到最高增殖滴度的时间为60h。而rV68在感染后72h以前，收集的培养上清，其病毒滴度均显著低于rV63和亲本病毒PRRSVBJ-4(代0.05)，达到滴度峰值的时间也比亲本病毒PRRSVBJ-4和rV63分别延迟约12h、24h，说明拯救的克隆病毒rV68在MARC-145细胞上的增殖速度有所迟滞。rV63、PRRSVBJ-4和rV68的平均最高滴度分别为10947TCID5。/mL、10892TCID5。/mL、10852TCID5。/mL，没有统计学差异(，.05)。虽然rV63Nsp2的可变区缺失21个氨基酸，但是与rV68和亲本病毒相比，其在MARC-145细胞上的生长有所增强。从生长曲线可知，虽然rV63与其余两株病毒的最高毒价没有显著性差异(/^>0.05)，但是时间提前12h以上。这些结果表明rV63比BJ-4和rV68更加适应MARC-145细胞。三、拯救的PRRSV克隆病毒rV68和rV63对仔猪的致病性分析猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)的变异现象比较普遍。N印2是最具变异性的蛋白之一，氨基酸置换、缺失和插入都在自然分离毒株中出现，且不同分离毒株之间的毒力存在差异。为了分析拯救的缺失突变病毒与亲本克隆病毒对仔猪的致病性，将克隆病毒rV68和rV63接种仔猪，记录和观察临床表现、大体病变、日增重、病毒血症、血清抗体动态变化、鼻腔排毒和病毒抗原分布情况。两株病毒都只引起轻微的体温升高、上呼吸道炎症和间质性肺炎；未检测到鼻腔排毒；三组动物的平均日增重没有显著差异(&0.05)。感染组在14DPI有50%的动物ELISA抗体转阳，21DPI时全部转阳，二者的抗体水平没有显著差异(/^>0.05);试验期间没有检测到中和抗体。用Real-timeFQ-PCR方法从rV68感染组4DPI(3/4)、7DPI(3/4)、14-28DPI(4/4)血清以及肺(4/4)和脾脏(4/4)中检测到病毒核酸，并从血清中分离到病毒；而仅从rV63感染组4DPI(2/4)、7DPI(3/4)、14DPI(3/4)21-28DPI(4/4)血清以及肺(3/4)和脾脏(4/4)中检出病毒核酸，没有从血清中分离到病毒；rV68感染组血清和组织中的病毒载量始终高于rV63感染组，其中14DPI、21DPI和28DPI血清具有显著差异(尸<0.05)，肺组织具有极显著差异(尸<0.01)。IHC检测病毒抗原主要分布于肺、胸腺、脾脏、扁桃体和肺门淋巴结。结果表明，N印2缺失病毒rV63对仔猪的毒力有所降低，具有进一步开发成标记疫苗的潜力。1、材料(1)病毒rV68和rV63经在MARC-145细胞上培养，第13代病毒用于动物感染试验。(2)实验动物21-25日龄断奶的英系大白猪购自天津兵种部种猪场，连续5年监测结果表明该场为PRRS阴性，试验猪经血清抗体和病毒核酸检测PRRSV、PCV2均为阴性。"彩虹牌4075"乳猪配合饲料购自天津彩虹饲料有限公司，"补克博士8199抗菌乳"7-15kg仔猪前期配合饲料购自台湾大成集团北京汉亚饲料营养科技有限公司。(3)主要试剂猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒(PRRS2XR)购自美国IDEXX公司。服P-conjugatedAffiniPureGoalairti-mouseIgG(H+L)购自JacksonImmunoResearchLaboratories公司。山羊血清、马血清、多聚赖氨酸、HRP标记山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。DAB显色试剂盒购自博士德生物工程有限公司。TRIz。rLS购自Invitrogen公司(Invitrogenlifetechnologies,CA,USA);AMV反转录酶、K邵I购自Promega公司。DNA玻璃奶快速纯化回收试剂盒购自北京博大泰克公司。DTT、RNsin、dNTPs、100bpDNALadder和TaqDNA聚合酶购自北京天为时代公司。SYBR*GreenRealtimePCRMasterMix购自日本T0Y0B0公司。DEPC、琼脂糖购自Sigma公司。其他化学试剂均为国产分析纯产品。(4)引物表4RT-PCR引物引物名称引物序列(5'—3')位置-目的基因片段大小308FbCAAATAACAACGGCAAGCAG1489M4910N308bp308RbAAACTCCACAGCGTAACTTATC15177~15198NP2327F'ACCGCCTTTTCACTGGCTAACTAC2327-2350Nsp2695bp(rV68)632bp(rV63)P2997R'CCGCCGAACTCAATCTTTTCACCT2997~3020Nsp2DetcMldGAACAAGTTTAAGGAGCTACAGAC8817-8841Nsp9793bpDetcM2dATTGGACCTGAGTTTTTCCCACAT9586~9610Nsp9a:指在BJ-4基因组中的位置(GenBank登录号AF331831);b:用于PRRSV阴性动物筛检及实时荧光定量PCR;c:扩增片段包括rV63的Nsp2缺失区；d:扩增片段包含克隆病毒中的KspI遗传标记。(5)主要仪器设备DNAEngine0pticon*2ContinuousFluirescenceDetector(荧光定量PCR仪)购自美国MJResearch公司。550microplatereader(酶标仪)购自美国BI0-RAD公司。MICROMSTP-120旋转式组织处理机购自德国MICR0M公司。BMJ-1生物组织包埋机购自天津航空机电公司。MICROMHM315轮转切片机购自德国MICROM公司。PHY-III型病理组织漂烘仪购自常州市中威电子仪器厂。2、方法和结果(1)动物实验设计、临床观测与采样动物分组随机分组，共3组(rV68感染组、rV63感染组、对照组)，每组4头。各组单独隔离饲养，防止人员、饲料、用具等交叉。词养管理维持动物房温度在2(TC左右，防止室温变化过大。给予动物充足的饮水和饲料，保证正常营养水平。感染将克隆病毒的MARC-145细胞培养物以及正常的MARC-145细胞反复冻融3次，5000r/min离心15min除去细胞碎屑，收集上清，用MARC-145细胞测定TCID5。。rV68感染组和rV63感染组分别经鼻腔缓慢滴入接种5mLX10e'68TCID5/mL(rV68)和5mLX10700TCIDM/mL(rV63)，每个鼻孔2.5mL，对照组同样方法接种5mLMARC-145细胞上清。临床观察接毒前(0DPI)和实验结束前，逐一称量体重，计算各组平均日增重。每日下午14-16时，逐一测量直肠体温，计算各组每日平均体温，绘制体温变化曲线。接毒后逐日详细观察每头猪的临床症状，主要包括精神、被毛、皮肤、体况、呼吸频率、咳嗽、鼻腔分泌物、食欲、排泄物等情况。试验结束后，剖杀所有猪，逐一观察大体病变。采样分别于感染后O、4、7、14、21、28天(0DPI、4DPI、7DPI、14DPI、21DPI、28DPI)以及剖杀后进行。其中，DPI是感染后天数(dayspostinfection)的縮写。经前腔静脉采血5mL，无菌分离血清，-S(TC保存备用。将灭菌棉签于灭菌PBS(含2000U/mL青霉素和2000Ug/mL链霉素)中浸湿后，深入每头猪鼻腔中后部捻转一圈(两侧鼻孔都进行)，再将棉拭子置于0.5mL灭菌PBS中，于-8(TC保存备用。实验结束时，剖杀所有猪，采集心、肝、脾、肺、肾、扁桃体、胸腺、肺门淋巴结、颌下淋巴结、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、睾丸、回肠，立即以4%多聚甲醛固定。并取固定部位的肺组织(右肺膈叶末端)、脾脏组织(末端)，单独于-80'C保存备用。(2)临床症状与大体病变通过鼻腔接种克隆病毒后第4天开始，rV68感染组和rV63感染组猪陆续出现打喷嚏，以4-7天为重，持续到14天。之后，个别猪偶尔出现。在感染后4-ll天，rV68感染组4头和rV63感染组4头猪鼻腔出现少量的浆液性或黏液性分泌物。rV68感染组有2头猪(90309、90313)出现短暂(3-5DPI)和轻度的精神不振、厌食、喜卧、不活跃等症状。rV68感染组有3头猪(90309、90313、90601)、rV63感染组有1头猪(90407)分别于3-5DPI(感染后3-5天)和6-7DPI(感染后6-7天)出现一过性的轻度腹泻。此外，未见其他明显的异常，体况及其它外观表现与对照组没有明显区别。对照组一切正常。感染后32天剖检，rV68感染组和rV63感染组猪均出现间质性肺炎的大体病变(图15)。此外，未见其它明显的病变。对照组正常(图15)。图15中，A:对照组；B:rV63感染组；C:rV68感染组。(3)日增重根据实验期间每头猪增加的体重除以实验天数计算每头猪的日增重，经计算rV68感染组、rV63感染组和对照组的平均日增重分别为(0.416±0.054)kg、(0.414±0.078)kg和(0.409±0.068)kg。经t检验进行统计学差异性分析，感染组都与对照组没有显著差异(/^0.05)，rV68感染组与rV63感染组之间也没有显著差异(/^0.05)。(4)体温变化感染后7天，rV63感染组有1头猪体温升高到40'C;感染后9天，rV68感染组有3头猪体温升高到40。C以上(40°C、40.2°C、40.2°C)，之后虽然总体上感染组表现体温轻微升高的趋势，但是就个体而言并不稳定。整个实验期间，感染组个体体温超过4CTC的分别有18头次(rV63感染组)和17头次(rV68感染组)，最高体温都为40.3°C;而对照组个体体温超过40'C的只有3头次。实验期间，各组猪的平均体温动态变化(图16)表明，从感染后9天到21天，感染组的平均体温一直高于对照组，其中以9-15DPI(感染后9-15天)(rV68感染组)、9-16DPI(rV63感染组)的平均体温绝对值为高。由上述数据可知，两株克隆病毒感染仔猪后可引起体温升高，但是感染组之间没有明显差异。图16中，Mock表示对照组。(5)血清抗体检测根据猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒(PRRS2XR)试剂盒说明书进行ELISA抗体检测。结果表明，2个感染组均于14DPI(感染后14天)，2/4(4头中有两头)猪抗体转阳，感染后21天4头全部转阳(4/4)，而对照组在整个实验期间一直保持ELISA抗体阴性。ELISA抗体的平均S/P比值动态变化如图17。由图可见，感染组的抗体水平在感染后14天以后呈直线上升，各个时间点的平均S/P比值(S/P-样品PRRS孔与NHC孔之差/阳性PRRS孔与NHC孔之差)虽然互有高低，但是经t检验显示rV68感染组与rV63感染组之间没有显著差异(P>0.05)。图17中，Mock表示对照组。采用固定病毒稀释血清法(殷震，刘景华.动物病毒学(第二版).北京科学出版社，1997)用PRRSVBJ-4进行中和试验，对收集到的所有血清进行检测，结果均未检测到中和抗体。分别用与感染猪同源的克隆病毒进行中和试验，仍然没有检测到中和抗体。(6)病毒血症利用表4中的引物对(P2327F和P2997R)不同时间采集的血清进行RT-PCR检测，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增结果。结果如图18，表明rV68感染组在感染后7天，有1头猪开始检测到病毒核酸，感染后14天、感染后21天分别有1头和3头猪为病毒核酸阳性(695bp)，感染后28天全部转为阴性；而rV63感染组只有一头猪在感染后14天、感染后21天检测到病毒核酸(632bp)，感染后28天转为阴性。rV68感染组的病毒血症比rV63感染组早出现7天，持续时间比后者长，病毒检出阳性率也明显高于后者。图18中，A:7DPI;B:14DPI;C:21DPI;1:分子量标准；2:rV68;3:rV63;4:阴性对照；5-8:rV68感染组；9-12:rV63感染组；13-16:对照组。将无菌采集的血清样品用MARC-145细胞分离病毒，结果从rV68感染组的感染后7天、感染后14天血清中分离到病毒。对分离到的病毒培养物以引物DetcMl和DetcM2进行RT-PCR，扩增到唯一一条793bp的目的带。该目的带能被I切割成540bp和253bp两条带，而亲本病毒PRRSVBJ-4的扩增产物不能被fepI切开(图19)。图19中，1:分子量标准；2:BJ-4RT-PCR扩增产物经K印I酶切结果；3_4:分离病毒RT-PCR扩增产物经fepI酶切结果。对分离病毒的RT-PCR产物纯化后进行序列测定，结果(图20)证实fepl依然存在。上述试验结果表明克隆病毒在猪体内复制后，其基因组内人为引入的遗传标记能够稳定地遗传。对两份分离到病毒的血清样本进行TCID5。测定，结果rV68和rV63毒价分别为104M"TCID5。/mL和103秘7TCIDs。/mL。(7)血清和组织中的病毒载量为了进一步对病毒血症以及组织中的病毒载量进行定量分析，对不同时间收集的血清以及动物试验结束后的肺和脾脏组织进行实时荧光定量PCR检测。具体方法如下用TE缓冲液将标准质粒一PRRSV重组质粒(施开创.猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪圆环病毒2型共感染对猪免疫功能影响的细胞与分子机制[博士学位论文].北京中国农业大学，2006)进行10倍连续递增稀释，取10—8(即6.19X101Q-6.19X104copies/PL)作为模板，以便制作标准曲线。取出以oligo(dT)18反转录的cDNA4wL(血清)、2yL(组织)以及标准质粒1uL，建立20uL反应体系，每个样品重复两次。SYBR"GreenRealtimePCRMasterMix10uL308F(25pmol/tiL)0.5iiL308R(25pmol/yL)0.5ixL模板1-4uLH208-5uLReal-timeFQ-PCR循环参数为95°C5min,94°C20s，55°C20s,72°C30s，84.8°C读板ls，40个循环后，72°C5min。最后，于65°C~95°C之间，每O.2°C读板1次，每次1s。用软件MJOpticonmonitoranalysissoftwareVer3.1分析和计算结果。最后，取扩增产物电泳，验证扩增的特异性。由标准质粒的结果(图21A)获得了标准曲线(图21B)，建立了直线回归方程(y=-0.2881x+13.99)，其相关系数(r2)达到0.995。单一的熔解峰(图21C)和单一扩增产物(图21D)表明检测结果具有很强的特异性。图21中，A:数据图；B:标准曲线；C:熔解曲线；D:琼脂糖凝胶电泳。样品检测结果(表5)显示两个感染组可从4DPI以后的血清以及肺和脾脏组织中检出病毒核酸，但rV63感染组4DPI、7DPI、14DPI的血清以及肺组织的检出率比rV68感染组低；而且rV68感染组14DPI、21DPI、28DPI血清和肺组织中病毒的载量显著或极显著高于rV63感染组。对照组的血清和组织中都没有检测到病毒。表5血清及组织中病毒核酸阳性率及其载量(Logl。c叩ies/ml或Log,。c叩ies/g)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>(8)鼻腔排毒对采集的所有鼻腔拭子进行RT-PCR，都没有检测到病毒核酸。鼻拭子洗液上清在MARC-145细胞上连续盲传5代，未分离到病毒。(9)组织中的病毒分布在试验结束后，扑杀猪，取每头猪的心、肝、脾、肺、肾、扁桃体、胸腺、颌下淋巴结、肺门淋巴结、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结、回肠、睾丸组织，以N蛋白McAbSD0W17为一抗进行免疫组化检测病毒抗原分布。结果在试验组的肺、肺门淋巴结、胸腺、脾脏、扁桃体、腹股沟淋巴结检测到病毒抗原，而对照组的所有组织和试验组的其它组织都没有检测到病毒抗原(图22)。图22中，A-F:感染组；G-L:对照组；A、G:肺；B、H:肺门淋巴结；C、I:胸腺D、J:脾；E、K:扁桃体；F、L:腹股沟淋巴结(感染后32天，200X)两个感染组之间的病毒抗原分布以及各种组织的检出率没有明显差异(表6)。表6感染猪组织中病毒抗原的分布及阳性比例<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>(10)rV68感染组和rV63感染组的主要差别对rV68感染组和rV63感染组的各项检测指标进行统计，主要差别见表7(表7rV68感染组和rV63感染组的主要差异<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>总结理想的感染性克隆病毒应该保持与亲本病毒在遗传上的完全一致，但实际上这是很难做到的事情。不仅仅是因为PRRSV本身的"准种"特征(Goldbergetal,2003;Rowlandetal.etal，1999)、难以准确测定的5'端碱基和3，Poly(A)，还有DNA聚合酶以及噬菌体RNA聚合酶的保真性问题(Brachoetal，1998;Clineetal,1996)。事实上在构建BJ-4和其它毒株的感染性克隆过程中都发现有突变现象，甚至导致有的克隆病毒的生物学特性发生一定程度的变化(Nielsenetal,2003;Truongetal，2004)。因此，全面评价克隆病毒的生物学特性成为研究工作的重要环节。来自于野生型感染性cDNA克隆的病毒rV68，以较大剂量(5X106.667TCID50)感染断奶仔猪后表现轻度的上呼吸道炎症，轻度短暂腹泻、精神沉郁和厌食，体温轻度升高等症状；大体病变主要是间质性肺炎；病毒抗原局限性分布于肺、脾、胸腺、扁桃体和个别淋巴结；用常规RT-PCR检测，病毒血症首次出现于7DPI，28DPI完全消失，并从两头猪的血清中分离到病毒，但血清中的病毒滴度较低；14DPI产生ELISA抗体，且在试验期间平均抗体水平持续升高；平均日增重未受明显影响；也未检测到鼻腔排毒。与亲本病毒BJ-4感染仔猪的结果(郑洁.PRRS病毒持续性感染对细胞因子RNA转录的影响及病毒核酸分布动态[硕士学位论文].北京:中国农业大学，2002)相比，二者在体温、呼吸道症状等方面无明显差异，但是病毒血症差异明显。BJ-4感染的仔猪，从1DPI、2DPI、4DPI、7DPI的血清中都检测到病毒核酸，一直持续到21DPI;而rV68感染后，直到7DPI才有一头(1/4)猪的血清出现病毒核酸。另外，BJ-4感染后，出现腹股沟淋巴结、髂淋巴结、肩前淋巴结和肠系膜淋巴结明显的肿大，是rV68感染所不具有的大体病变。而且本试验中rV68的感染剂量是BJ-4的10倍以上表明野生型克隆病毒rV68对仔猪的致病性比亲本病毒BJ-4低。说明野生型克隆病毒rV68对仔猪的致病性比亲本病毒BJ-4低。出现这种差异可能是克隆病毒基因组中存在的23个点突变所造成的。因为在构建感染性克隆过程中，这23个点突变未回复，其中12个造成氨基酸置换，可能影响了病毒在体内的复制能力，也可能其中的部分关键氨基酸本身与病毒毒力密切相关。其中以前一种可能性为高，因为前面的试验表明rV68在MARC-145细胞上的增殖比亲本毒BJ-4略微迟缓，与体内试验结果比较吻合。有的克隆病毒在体内、体外的试验结果并不一致，如美洲型原型毒株VR-2332，尽管其克隆病毒在体外的生长滴度低于亲本毒，但仍然保持亲本病毒对易感动物的高致病力(Nielsenetal，2003)。这可能是自然宿主体内更有利于病毒增殖的环境克服了某些抑制克隆病毒体外增殖的因素，使其保持高致病力。另外，也不排除一些不利突变随病毒在体内复制而得以回复突变的可能性。N印2缺失21个氨基酸的rV63以相似剂量(5X107.。。。TCID5。)感染仔猪后，除了未见明显的精神沉郁和厌食外，在临床症状、大体病变、血清抗体动态变化、病毒抗原分布、鼻腔排毒以及日增重等方面与rV68感染组没有明显差异。但是，病毒血症的差异明显。用常规RT-PCR检测，rV63感染组只有一头猪在14DPI、21DPI时检测到病毒核酸，28DPI消失。病毒血症的阳性率和持续时间明显低于或短于rV68感染组。用实时荧光定量PCR检测，rV68感染组4DPI、7DPI、14DPI的血清以及肺组织中的病毒阳性率高于rV63感染组，而且前者14DPI、21DPI、28DPI的血清和肺组织中的病毒载量显著或极显著高于后者。整个试验期间，也没有从rV63感染组分离到病毒，而从rV68感染组的血清中分离到两株病毒。由上述结果可知，rV63的致病性比rV68低。然而体外试验显示rV63在MARC-145细胞上具有比rV68更强的生长特征，似乎与体内实验结果相反。其实，这也不难理解。首先，传代细胞内的微环境与自然宿主的机体环境有很大区别。其次，病毒在细胞上的适应能力并不能代表其对宿主动物的毒力。就PRRSV而言，有两个方面的证据。一是不同毒力的分离株之间无论对PAM还是传代细胞的适应性都呈现一定的差异性，特别是一些强毒株不能适应传代细胞培养(Bautista"ai,1993;Mengelingeta,1995);另一方面，有的弱毒疫苗对传代细胞表现高度的适应性，而对猪只显示出毒力的减弱(Allende"W,2000;Yuan"a,2001)，甚至有报道传代细胞高度适应的毒株丧失了对自然靶细胞PAM的感染性(B0tnereta〗，1999)。实验表明PRRSV感染猪后，中和抗体产生比较晚，文献报道的时间也不一致，早的可在8DPI就检测到，晚的要到56DPI才能检出，大多数实验的首次检出时间在14-35DPI之间(Batistas,2004;Diazet2005;Ubarque2000;Takikawaetai，1997;Yooneta,1995)。本研究中，用亲本病毒PRRSVBJ-4作为指示病毒在MARC-145细胞上测定克隆病毒感染猪的血清中和抗体，直至28DPI都没有检测到，改用rV68、rV63重检仍然没有检出。但是没有检测到中和抗体，并不表明动物体内没有产生中和抗体。因为最新的研究结果显示感染动物的血清中不是没有中和抗体产生，而是指示病毒GP5上的N糖基化严重钝化中和试验的敏感性，另外GP5的糖基化也严重抑制体内中和抗体的产生(Ansari"W，2006)。而在PPRSVBJ-4及其克隆病毒GP5的中和表位附近存在4个N糖基化位点。没有检测到中和抗体可能与此有关。从rV68感染组血清样本中分离到病毒，经RT-PCR和酶切鉴定以及序列分析，显示引入的遗传标记依然存在，表明克隆病毒在体内稳定复制。小结A、两株拯救的克隆病毒经鼻腔途径大剂量感染仔猪，不引起明显的临床疾病发生，主要表现打喷嚏，体温轻度升高等临床症状。剖检病变仅限于间质性肺炎，病毒血症持续时间短，总体阳性率低，没有检测到鼻腔排毒，病毒抗原主要分布于肺、脾、胸腺、扁桃体和少数淋巴结，平均日增重与对照组没有显著差异，表明克隆病毒rV68和rV63对仔猪的致病性降低。B、用常规RT-PCR检测，rV63感染组只有1头猪在14DPI和21DPI检测到病毒核酸，而rV68感染组有3头猪出现病毒血症，其中1头从7DPI持续到21DPI;用real-timeFQ-PCR检测，rV68感染组血清和组织中的病毒含量高于rV63感染组，而且14DPI、21DPI、28DPI血清及肺脏中的含量具有显著或极显著差异，表明Nsp2部分缺失的rV63的毒力进一步降低，可以作为开发标记疫苗的候选毒株。C、rV63和rV68感染组均于14DPI产生ELISA抗体，21DPI时全部转阳，但直至28DPI仍然没有检出中和抗体，有可能是受到病毒蛋白糖基化的干扰。D、从rV68感染组血清样本中分离到病毒，其遗传标记完好保留，表明克隆病毒在猪体内复制具有遗传稳定总之，动物感染试验表明，rV68的致病性比亲本病毒低，而rV63的毒力有进一步的减弱。因为rV63的Nsp2缺失21个氨基酸，具有开发成标记疫苗的潜力，并可以缺失的多肽开发鉴别诊断方法。在开发疫苗过程中，可以利用己经建立的反向遗传技术平台对GP5的糖基化位点进行改造，克服影响中和表位的抑制性因素，以提高疫苗诱导的中和抗体水平。权利要求1、一种降低PRRSVBJ-4株毒力的方法，是连续缺失PRRSVBJ-4株基因组的Nsp2编码区中长度为69nt的核苷酸片段，得到毒力降低的毒株；所述69nt核苷酸片段的核苷酸序列如GenBankAccessionNumberAF331831的自5′末端第2795至2863位所示。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述连续缺失PRRSVBJ-4株的Nsp2编码区中长度为69nt的核苷酸片段的基础上，再在GenBankAccessionNumberAF331831的自5'末端第2795至2863位中插入限制性内切酶位点。3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述限制性内切酶为HpaI。4、由权利要求1至3中任一所述的方法获得的毒株。5、权利要求4所述的毒株在制备预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合征疫苗中的应全文摘要本发明公开了一种利用Nsp2基因缺失构建PRRSV基因缺失疫苗毒株的方法及其应用。本发明的降低PRRSVBJ-4株毒力的方法，是连续缺失PRRSVBJ-4株基因组的Nsp2编码区中长度为69nt的核苷酸片段，得到毒力降低的毒株；所述69nt核苷酸片段的核苷酸序列如GenBankAccessionNumberAF331831的自5′末端第2795至2863位所示。由该降低PRRSVBJ-4株毒力方法制备的病毒rV63的Nsp2缺失21个氨基酸，具有开发成标记疫苗的潜力，并可以缺失的多肽开发鉴别诊断方法。在开发疫苗过程中，可以利用已经建立的反向遗传技术平台对GP5的糖基化位点进行改造，克服影响中和表位的抑制性因素，以提高疫苗诱导的中和抗体水平。文档编号C12N7/04GK101220351SQ200710178930公开日2008年7月16日申请日期2007年12月7日优先权日2007年12月7日发明者冉智光,杨汉春,盖新娜,鑫郭,陈小云申请人:中国农业大学