一种预测2型糖尿病易感性的方法及试剂的制作方法

专利名称：：一种预测2型糖尿病易感性的方法及试剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种预测2型糖尿病易感性的方法及试剂，具体地说是通过测定人血管紧张素II一1型受体(AngiotensinIIrec印tortype1，AGTR1)基因(G15950A)单核苷酸多态性(SNP)频率预测受试者对于2型糖尿病的易感性，该方法可用于疾病的治疗和新药开发、辅助诊断，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：2型糖尿病(T2DM)是一组由于胰岛素分泌缺陷及生物学作用障碍引起的以高血糖为特征的代谢性疾病，它不是一种单一疾病，是由多种遗传和环境因素引起的、增龄性的、慢性内分泌代谢异常综合征。该病的复杂发病机制，使得在人群中的患病率约为5%15%。糖尿病可以导致严重的合并症或并发症，致使死于T2DM各种并发症的人数仅次于心血管疾病和肿瘤的死亡人数，T2DM已成为威胁人类健康的第三大疾病(许曼音主编，《糖尿病学》上海科学技术出版社，上海，2003)。T2DM给患者带来沉重的经济负担、影响生活质量的同时，也给社会造成了巨大的压力。我国现有患者约3000多万，每个T2DM患者每月治疗费用为1000元，按次计算，因T2DM而给我国带来的经济损失是相当惊人的。但是，T2DM的确切病因迄今为止尚未阐明，而且还存在很强的遗传异质性。即往大量研究表明，T2DM在家系分析、双生子研究均呈现高度遗传一致性(ZimmetP,AlbertiKG,ShawJ.Globalandsocietalimplicationsofthediabetesepidemic.Nature,2001;414:782-787.)。遗传因素在发病机制中的重要性得到了很多人群证据的证明，如染色体2q(NIDDM1)位点是墨西哥美国人的相关位点，染色体12q(NIDDM2)是在芬兰人群中发现的，在Pima印第安人中常染色体基因组扫描发现了几个LOD分数较高的染色体区域(3q24,9q21和22ql2)(WalkerM.Genedetectionintype2diabetes.InternationalDiabetesMonitor,1998;10:14-15)。目前进行T2DM遗传病因研究，多采用SNPs作为基因组标志的关联分析方法，是有效的，已得到证明(HorikawaY，OdaN,CoxNJ，etal.Geneticvariationinthegeneencodingcalpain-10isassociatedbytype2diabetesmellitus.NatGenet,2000;26:163-175.)。SNP是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的频率需〉l。/。。SNPs是双等位基因标记，这种单碱基变化中有70.P/。为同型碱基之间的转换如G/A或T/C，29.P/。为发生在嘌呤和嘧啶之间的颠换。C(胞嘧啶)是人类基因组中最易发生变化的位点，因为大多数是甲基化胞嘧啶，能够自发脱氨基转换为T(胸腺嘧啶)，SNPs包含了已知多态性的80-90%,是最常见的遗传变异。由于生存的选择压力导致SNP在单一基因和整个基因组中的分布呈不均匀性。SNPs在基因非编码区的数量是编码区的4倍，总数可达3百万个(BrookesAJ.TheessenceofSNPs.Gene,1999;234:177-186.)。SNPs以其密度高，平均每lkb就有1个；代表性强，位于基因内部的SNPs可能直接影响蛋白质结构或表达水平；遗传稳定性好，同微卫星多态性比较而言；易于自动化分析，因SNPs在人群中为双等位基因标记，可简单以"+/-或1/0"直接分型，成为很好的遗传标志。(CollinsFS,BrooksLD,ChakravartiA.ADNApolymorphismdiscoveryresourceforresearchonhumangeneticvariation.GenomeRes,1998;8:1229-1231)。位于染色体3q21—25的AGTR1基因是人类编码AT1受体的基因，它属于G蛋白偶联受体家族，是RAS的三个关键基因之一，它主要分布在质膜，发挥受体活性，参与G蛋白信号转导，偶联IP3，提高胞浆钙离子浓度等产生一系列生物学效应。在组织水平，主要分布在血管细胞，肾脏和肾上腺。AGTR1基因全长约60kb，包含5个外显子和4个内含子，其中只有第五个外显子编码全部的359个氨基酸。Bonnardeaux等筛査了5号外显子和3，端区域，发现了五个常见多态T573C、A1062G、A1161C、G1517T和A1878G。其中，T573C编码第191位氨基酸，但是T>C多态并不改变氨基酸的编码。后来，Erdmann等、Takahashi等和Jin等分别在德国、日本和中国汉族人群中对AGTR1启动子区域进行筛查。在筛査到的SNP中，只有5210T等位基因在日本(14%)和中国汉族人群(18%)中的频率明显低于高加索人群(36%)，其余均没有显著性差异。法国的Ectim利用SSCP方法对AGTR1基因的外显子和启动子区域也进行了筛査，在4号外显子发现一个SNP(T55C)。目前，对AGTR1基因研究最多的多态位点是3'UTR区的1166A>C。近年来，有较多的研究报道该基因与2型糖尿病的并发症，如2型糖尿病合并高血压，糖尿病肾病等相关。但是该基因是否与2型糖尿病本身相关还未见报道。经过现有国内外文献检索，未见有AGTR1基因(G15950A)单核苷酸多态性，即SNP(rs2276736)位点与T2DM相关联的研究报道。
发明内容本发明的主要目的是提供一种预测2型糖尿病易感性的方法。本发明的第二个目的是提供一种预测2型糖尿病的试剂，包括PCR引物和含有该引物的试剂盒。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案-一种预测2型糖尿病易感性的方法，通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的AGTR1基因1号内含子第15950位碱基多态性位点的基因型，预测受试者对2型糖尿病的易感性AGTR1基因型为A/A纯合子时，受试者的易感性最低；AGTR1基因型为GX携带者(A/G+G/G)时，受试者的易感性最高。本发明提供了一种分离核酸，具有SEQIDNO:l所示的碱基序列，在第15950位为A/G复等位基因的SNP标记(SEQIDNO.1序列中用D表示)。在第15950位为A,其反义链为T。本发明提供了一组等位基因特异性的引物，具有SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的碱基序列，长度为19-22bp,而且可以特异性地扩增出SEQIDNO:1所示序列中第15950位的SNP的扩增产物。本发明提供了一种检测T2DM易感性的诊断试剂盒，其中含有本发明特异性扩增AGTRl基因的引物对和用于PCR扩增检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。检测扩增产物与正常AGTRl基因第15950位SNP相互对比是否存在变异时，所需的化学试剂还包括特异性内切酶等。本发明试剂盒中的全部组分、含量、来源和使用方法如下本发明试剂盒供IO人份检测应用，其组分、含量和来源包括20ul10XPCR缓冲液(Pharmacia)，6ul10mMdNTP混合液(Pharmacia),5ul(2unit/ul)TaqDNA聚合酶(Takara)，各2ul(50pmol/ul)Fl(SEQIDNO2)禾卩Rl(SEQIDNO3)引物(自制)，1.5ml纯水(自制)，10ul10X限制酶反应缓冲液(Fermentas)，3ul(2unit/ul)限制酶HpaII(Fermentas)。使用方法1)通过PCR扩增AGTRl基因，先制备混合液，加入基因组DNA溶液2ul、2ul10XPCR缓冲液、0.6ul10mMdNTP、0.5ulTaqDNA聚合酶、分别0.2ul的Fl和Rl为正义引物和反义引物。接着，加入纯水，使总体积为20ul。反应在94'C5分钟，95°C45秒，6rC30秒，72'C40秒，72。C7分钟，进行30个循环。反应完成后，将3ul每种PCR反应液在8X的聚丙烯酰胺凝胶上电泳检测，如扩增了282bp的片段，获得了单一条带，即为扩增成功。2)通过用限制酶处理PCR反应产物测定AGTRl基因l号内含子内15950bp处的多态性。往10ul上述扩增的PCR反应产物中加入lul限制酶反应缓冲液、3U限制酶Hpa11，并在37'C水浴中消化过夜。之后，在8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳。3)多态性定型用限制酶HpaII处理片段，为AA基因型时，仅出现282bp—个条带。GG基因型时，出现258bp和24bp的两条带。AG基因型时则有282bp、258bp和24bp三条带。本发明的测定方法测定了来源于人的基因组DNA，样品没有限制如，体液(如血液、腹水和尿液)、组织细胞(如肝组织)等。通过提取和纯化这些样品可制备基因组DNA。从基因组DNA中，可扩增含AGTR1基因突变点的DNA片段，以获得用于测定的大量样本。这种通过扩增含AGTR1基因突变点的DNA片段获得的样品，特别适于用作测定材料。例如，可按PCR方法，使用引物进行扩增，此引物经合理设计以便仅扩增含AGTR1基因多态性的部分。这种引物可经常规方法制备。待扩增区的碱基长度不受限制。在一般情况下，碱基长度约100bp至500bp。当按本发明所述制备引物时，可获得适宜的测定样品，其作为扩增的DNA片段，并具有特异性长度。进行PCR-RFLP方法时，欲扩增的DNA被设计成含有能适用于此后RFLP方法的特异性酶切位点。对此设计无限制，只要用酶切割DNA区获得的片段长度在突变基因、野生型基因和杂合型基因的情形中均不同。可使用通过AGTR1基因的突变产生或丢失的限制酶位点。因此，根据PCR方法扩增的所需DNA片段，通过上述合理选择的限制酶得以设计。酶切产生的片段通过电泳证实，它们显示特定的条带。根据在上述方法中获得的带型，可测定AGTR1基因(G15950A)单核苷酸多态性。在进行本发明的基因诊断时，优选使用用于测定根据AGTR1基因(G15950A)单核苷酸多态性的突变类型存在的诊断试剂，诊断试剂包括作为必要成分的特定试剂，其对应于用于测定AGTR1基因(G15950A)单核苷酸多态性突变类型的方法。特定的试剂按采用的测定方法来适当地选择。试剂的特征是，组成测定由AGTR1基因(G15950A)单核苷酸多态性定义的突变类型的手段是必要的，如，DNA片段或作为用于测定的特异限制酶。试剂，例如特定制备的用于PCR扩增步骤的引物，该步骤用于包含AGTR1基因(G15950A)单核苷酸多态性的突变点的特定扩增片段，不被认为是本发明诊断试剂的必要成分，它们也包含于本发明的诊断试剂之中。本发明的优点是本发明首次阐明了AGTR1基因(G15950A)单核苷酸多态性位点与T2DM的相关性，提供了一种预测T2DM易感性的方法，该方法可用于T2DM的辅助诊断。下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步叙述，以使公众对
发明内容有更深入的了解，并非对本发明的限制。图1为位于3q21—25的AGTR1基因结构及其多态性变异位点的示意图，附图中包含有5个外显子，4个内含子，其中rs2276736位点标在AGTR1基因图中内含子1的相应位置。图2为AGTR1基因rs2276736(G15950A)的基因分型电泳图。图谱中上方1-15为电泳泳道，其中，4、5、6、7、8泳道为AA基因型的基因分型结果；2、3、9、10泳道为AG基因型的基因分型结果；1、11、12、13、14泳道为GG基因型的基因分型结果；15泳道为分子MarkerSDOll，指示碱基(bp)的分子数量(图右侧)。图左侧，对应的为1号内含子内G15950A处，等位基因G被A代替，形成限制性内切酶HpaII的酶切位点。PCR扩增和酶切后结果表明纯合突变型AA不含酶切位点，仅有一条282bp的片断；野生型GG被HpaII完全消化，形成258bp和24bp的两条片断；杂合型AG则有282bp、258bp和24bp三条片断。因24bp片断太短，条带已经泳出，电泳图上见不到，所以电泳图仅见AA基因型有一条282bp的片断；GG基因型有一条258bp的片断；AG基因型有两条282bp、258bp的片断。具体实施方式用于下列实施例中表示试剂的英文縮写如下。需要时，用高压锅(12(TC，20分钟)灭菌EDTA:乙二胺四乙酸二钠SDS:十二垸基硫酸钠TE:10mMTris—HC1(pH7.5)，lmMEDTA(pH8.0)IOXPCR缓冲液100mMTris—HCl(pH8.3)，500mMKCl，15mM氯化镁(MgC12)0.01X(W/V)白明胶dNTP:脱氧核苷三磷酸甲酰胺颜料95%去离子甲酞胺，0.05%葡聚糖蓝APS:过硫酸铵—10XTBE:Tris(108g)，硼酸(55g)，EDTA2Na(9.3g),溶于纯水中，总体积为1升。实施例1:血液样本收集和基因组DNA的提取一.病例选择按WHO(1999)标准明确诊断入选病例，须经空腹8-12小时口服溶入300ral温水中的75g无水葡萄糖，2小时后检测其血浆葡萄糖值^11.1mmol/L，共计收集来自中国北方的无亲缘关系T2DM患者182例，男性90例、女性92例。所有受检者均为汉族，且签署知情同意书，这一研究也得到了本单位伦理委员会批准。二.制备基因组DNA在抗凝剂EDTA存在下，将收集的10ml人外周血在2500rpm，离心分离30分钟除去血清。接着加入0.2XNaCl溶液，使总体积为50ml。轻轻振荡溶液5-6次，并使其放置于冰上15分钟。此后，在2500rpm离心分离30分钟，借此收集沉淀物。用0.2X的NaCl溶液，以类似于前面的方式再进行洗涤。在如此获得的沉淀物中，加入10raMTris-HCl(pH8.O)和10mMEDTA(4ml)，以悬浮该沉淀物。将10%SDS，25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入悬液中，其加入量分别为4ml、16ul和20ul，接着上下颠倒悬液轻轻混合。然后，在37X:过夜温育悬液。过夜后，加入4ml酚/Tris溶液，上下颠倒混合物混合所得的混合物。以3000rpm进行离心分离IO分钟除去水层。将水层和4ml酚/氯仿溶液混合，接着逆混合并以3000rpm离心分离IO分钟。除去水层。最后，用氯仿提取两次，以获得水相，往其中加1/10，3MNaAC(pH5.2)，两倍量的冷无水乙醇，使DNA沉淀。用70X的乙醇洗涤以获得基因组DNA。使这样获得的DNA，基因组DNA溶解于TE中，然后定量测定混合物在260nm的吸收率。DNA工作液浓度校正至30ng/ul，置-2(TC冰箱保存。实施例2:SNP的识别确定本发明采用PCR-RFLP和PCR测序技术同时对AGTR1基因的1号内含子的第15950位SNP位点(其等位位点对为A/G)进行检测。一.引物的确定定位在AGTR1基因1号内含子内15950bp处，全长282bp(SEQIDNO:1)，确定了正义链(-ll--+86)和反义链(222—242bp)特异性引物如下Fl:5'—CAGCAGTTTTCTTTAATGTGTCACC3'(SEQIDNO:2)Rl:5'—AGAACACTGCTCAAAGGAATCA3'(SEQIDNO:3)二.通过PCR扩增AGTR1基因的1号内含子部分片段，简言之，制备混合液，加入上述实施例1制备的基因组DNA溶液2ul、2ul10XPCR缓冲液、0.6ullOmMdNTP、0.5ulTaqDNA聚合酶和0.2ul上述步骤1)叙述的每种引物。接着，加入纯水，使总体积为20ul。反应在94。C5分钟，95。C45秒，61。C30秒，72。C40秒，72。C7分钟，进行30个循环。反应完成后，将10ul每种PCR反应液在8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳获得了单一的条带，观察在BioRad成像仪，应用GelDoc2000程序。三.通过用限制酶处理PCR反应产物测定AGTR1基因，简言之使用Fl和Rl分别为有义引物和反义引物进行PCR。结果，扩增了282bp的片段。往10ul上述扩增的PCR反应产物中加入lul限制酶反应缓冲液、3U限制酶Hpa11，并在37'C消化过夜。此后，在8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳。多态性的测定为用限制酶HpaII处理片段，为AA基因型时，仅出现282bp—个条带。GG基因型时，出现258bp和24bp的两条带。AG基因型时则有282bp、258bp和24bp三条带。因24bp片断太短，条带已经泳出，电泳图上见不到，所以电泳图仅见AA基因型有一条282bp的片断；GG基因型有一条258bp的片断；AG基因型有两条282bp、258bp的片断。见图2，电泳图谱。实施例3:AGTR1基因(G15950A)单核苷酸多态性与T2DM的相关一.统计方法利用STATA8.0和SPSS11.0软件中Yates卡方检验计算AGTR1基因(G15950A)单核苷酸多态性的等位位点，携带者频率，Hardy-Weinberg平衡检测(HWE)，进行连续校正和单侧渐近概率分析，统计学的显著性水平设定为P〈0.05。采用单因素Logistic回归分析计算T2DM的患病风险OR值及其95%可信区间(CI)。二.结果1.健康人AGTR1基因(G15950A)单核苷酸多态性分布按实施例1和2的方法测定了309个健康人的基因多态性。170人在第15950位碱基有G多态性，发现31人有G的纯合子(10.04%)，139人有G和A的杂合子(44.98%)，139人有A的纯合子(44.98%)。经检验，对照中的HWE=0.191，P=0.662，表明该SNP在一般人群中的分布符合H-W平衡。2.T2DM病人AGTR1基因(G15950A)单核苷酸多态性分布按实施例1和2的方法测定182个T2DM病人的基因多态性。123人在第15950位G碱基有多态性，发现59人有A的纯合子(32.42%)，112人有A和G的杂合子(61.54%)，11人有G的纯合子(6.04%)。3.T2DM病例和健康对照组比较T2匿病例和健康对照组比较其AGTR1基因上的rs2276736(G15950A)，其等位位点对为A/G多态性的频率分布，详见表l。表1AGTR1基因rs2276736位点的(G15950A)单核苷酸多态性(SNP)频率风险性在T2匿和健康正常人群中的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表l可见，AGTRl基因第15950位的常见SNP位点(rs2276736)的A等位位点，即在其DNA互补链上为T等位位点，当突变为G，互补链上为C时，在患者群体中的分布频率大大高于在健康正常人群中的频率，相差约12%，有显著性差别(P=0.0026)。而且OR值反映突变位点C的频率在T2DM中高出正常人2.46倍，95%"下限〉1，均表明这是T2DM患病的一个较高风险的等位基因。与T2DM显著相关的SNP(rs2276736)位点，位于内含子l靠近外显子l的剪切点侧，在功能上可能通过影响DNA的空间结构，而影响了DNA的转录和剪切。实施例4:检测试剂盒本试剂盒供10人份检测应用，保存温度为-20°C,包括20ul10XPCR缓冲液(Pharmacia),6ul10mMdNTP混合液(Pharmacia),5ul(2unit/ul)TaqDNA聚合酶(Takara)，各2ul(50pmol/ul)Fl(SEQIDN0.2)和Rl(SEQIDN0.3)引物(自制)，1.5ml纯水(自制)，10ul10X限制酶反应缓冲液(Fermentas)，3ul(2unit/ul)限制酶HpaII(Fermentas)。引物序列为Fl:5'-CAGCAGTTTTCTTTAATGTGTCACC隱3'(SEQIDNO:2)Rl:5'-AGAACACTGCTCAAAGGAATCA-3'(SEQIDNO:3)本试剂盒经PCR-RFLP检测后，可轻易检测出第15950位的A—G的SNP。本发明具有实用性的例证1.本发明的AGTR1基因(G15950A)单核苷酸多态性的检测方法，可用于分析人常染色体3q21—25区的AGTRl基因上的常见SNP(rs2276736)的A等位位点，即在其DNA互补链上为T等位位点，应用在对T2DM的辅助性诊断和对个体是否有多大的T2DM患病风险进行评估。以利于开展T2DM的早期干预和治疗。2.利用本发明阐述AGTR1基因第15950位碱基变异，作为生物标志物之一，可用作药物设计的分子靶标的筛选，以帮助寻找具有调节AGTR1表达的活性分子，促进T2DM新药开发。3.本发明建立的检测AGTR1基因(G15950A)单核苷酸多态性的核酸序列和T2DM相关位点，可高灵敏度，特异性地应用于T2DM基因诊断用的试剂盒。如上所述，得出结论，AGTR1基因(G15950A)单核苷酸多态性在第15950位碱基的多态性与T2DM具显著相关性。因此，根据本发明，测定此多态性可用于进行基因诊断。本发明叙述了AGTR1基因与T2DM相关的新突变点，并提供了一种测定AGTR1基因(G15950A)单核苷酸多态性的方法。而且，根据本发明，只需要少量DNA样品就足以测定AGTR1基因(G15950A)单核苷酸多态性的多态性。结果，本发明提供了一种测定T2DM相关基因多态性的基因诊断方法。序列表〈110〉卫生部北京医院<120〉一种预测2型糖尿病易感性的方法及试剂<130>〈歸3〈170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉282〈212>腿<213>人属，人禾中(Homosapiens,human)<400〉1cagcagttttctttaatgtgtc已gc目gtgggg卿gcgcaaaaacccacacacaccatta60tcttgtgaaag已已gt已gagga3gc3g3as3taatgaaatcccagtgttaccacatcccct120ccaatatacag3tta已g已gcgtttgtatttatatggttttaaacataaataacatcagaa180ttactaagctatttccattcatgtactgata已tgaatcatgtg卿鄉tcctttggcaa240ggactccacatggccac鄉tgattcctttgagcagtgttct282〈210>2<211>25<212>DNA〈213〉人工合成<400〉2cagcagttttctttaatgtgtcacc25〈210〉3〈211〉22<212>DNA〈213〉人工合成<400>3agaacactgctcaaaggaatca2权利要求1.一种预测2型糖尿病易感性的方法，其特征在于该方法通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的AGTR1基因1号内含子非编码区，第15950位碱基多态性位点的(G15950A)单核苷酸多态性，预测受试者对2型糖尿病的易感性AGTR1基因型为A/A纯合子时，受试者的易感性最低；AGTR1基因型为GX携带者(A/G+G/G)时，受试者的易感性最高。全文摘要本发明公开了一种预测2型糖尿病易感性的方法及试剂，属于医学生物
技术领域：
。本发明通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的AGTR1基因1号内含子非编码区，第15950位碱基多态性位点的(G15950A)单核苷酸多态性，预测受试者对2型糖尿病的易感性AGTR1基因型为A/A纯合子时，受试者的易感性最低；AGTR1基因型为GX携带者(A/G+G/G)时，受试者的易感性最高。本发明的优点是本发明首次阐明了AGTR1基因(G15950A)单核苷酸多态性位点与T2DM的相关性，提供了一种预测T2DM易感性的方法，该方法可用于T2DM的辅助诊断。文档编号C12Q1/68GK101230392SQ20071017889公开日2008年7月30日申请日期2007年12月6日优先权日2007年12月6日发明者史晓红,雷唐,亮孙,宁张,静张,朱小泉,泽杨,王晓霞申请人:卫生部北京医院