专利名称：一种微量dna检测的方法
技术领域：
本发明属核酸检测领域，特别是涉及一种通过乙醇沉淀回收PCR扩增后的原始DNA 模板重复利用的核酸检测方法。
技术背景在法医学、古生物学、产前诊断遗传学检测与疾病基因组学的研究等方面，常因为样 本DNA含量极其有限，以致无法进行有效的检测。因此，微量模板DNA的检测是这个领 域迫切需要解决的一个难题。为了解决这个难题，很多研究者尝试采用多种方法来改进检测手段，以增加检测的灵 敏度。从目前的研究来看，几乎所有的相关研究均采用以聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)为基础的一系列方法。总揽目前的研究状况，不外乎两个基本策略，即增 加一次检测所能获得的信息量，或者对要研究的DNA区域普遍扩增之后再进行遗传信息的 研究。对于增加一次检测所能获得的信息量这个策略来说，目前比较成功和有代表性的是多 重PCR(multiplexPCR)。它通过一系列的优化组合，可以在一次PCR反应和随后的分析中， 做到对多个遗传信息的分析，是一种高通量的分析技术。但多重PCR扩增技术存在系统优 化困难、多对引物延伸时相互影响、产物分析时信号相互干扰等问题，还需考虑避免检测 时片段的交叉、染色体定位、靶基因的大小以及基因连锁等困难(JSocBio1，2003, 197: 351-359)。所以在一个多重PCR扩增系统中， 一次实际能检测的位点数是有限的，常常难 以达到微量DNA检测的目的，即使检测成功，也往往耗尽样本，失去复检的条件，使得结 果可靠性降低。对于对要研究的DNA区域普遍扩增之后再进行遗传信息的研究这个策略来说，目前比 较有代表性的是巢式PCR技术和全基因组扩增技术。巢式PCR (nested PCR)技术的基本原 理是先扩增较长的DNA片段，然后再对位于此片段内的较短DNA序列进行二次扩增分析， 从而极大的提高对某些要检测DNA片段检测能力的灵敏度和特异性，但此方法仅限于单一 位点分析，无法满足多位点复合扩增的需要(J Forensic Sci, 1998,43:696-700)。全基因组 扩增技术(whole genome amplification, WGA)则是最近几年逐步发展起来的一种技术方 法，可以有效的解决多重PCR和巢式PCR的不足。WGA是一组对全部基因序列进行非选择 性扩增的技术，其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA的总量。基本思路是 通过对微量组织，甚至单个细胞的整个基因组DNA扩增，再将扩增的产物分为多份，作为模板，进行后续分析，进而完成多位点、多基因以及全基因组DNA组成的多次研究需要(Genome Research, 2003,13:954-946 )。虽然此方法已被广泛的用于法医学、单基因遗 传病的诊断及疾病基因的分析等领域研究，并取得了良好的效果，但以目前的报道来看， 仍需要解决以下问题WGA技术不能达到对全基因组的100c/。扩增，只能尽量接近，所以 必须致力于寻找尽可能达到最大范围扩增的方法技术；任何扩增都存在一定程度的选择性 扩增和错误扩增产物，在只有极微量、甚至几个细胞作为模板的情况下，这种现象的发生 可能会产生致命性的错误；WGA仅是一类技术的总称，它包含了许多具体的技术，针对不 同样本，采用的WGA技术可能不同，所以在实际应用中，采用哪一项具体的WGA技术、 解决哪一类特定的样本问题，都需要进行探索性研究。 发明内容本发明的目的是提供一种微量DNA检测的方法，该检测方法通过回收原始DNA模板 来重复利用，既克服了法医鉴定、古生物学、产前诊断遗传学检测与疾病基因组学的研究 等方面用于鉴定的模板不足的难题，又从源头上解决了 WGA中存在的保真性问题。整个 检测方案操作过程简单，不需要专业人员，特异性高，并且灵敏度与PCR效率都很高，在 实际应用中有广泛的应用前景。本发明的一种微量DNA的检测方法，是通过乙醇沉淀回收PCR扩增后的原始DNA 模板，然后用回收得到的模板继续进行后续的检测，大大提高了检测的效率，具体步骤包 括(1) 待检样本DNA的抽提；(2) 以步骤(1)中的DNA为模板，进行第一次PCR反应；(3) 反应结束后，取出一部分步骤(2)中PCR反应液留待后面的检测实验；(4) 将步骤(2)中产物的剩余部分利用乙醇沉淀、纯化回收原始用于检测的DNA模板；(5) 以步骤(4)回收得到的原始DNA作为初始模板，进行第二次PCR反应；(6) 根据需要重复(3)、 (4)、 (5);(7) 第一、二次PCR反应产物进行巢式PCR (nested PCR)，再分析结果。所述样本DNA的抽提可以采用常规酚-氯仿抽提法，或用试剂盒抽提。 所述第一次PCR反应和第二次PCR反应为单重或多重PCR，其第一次PCR反应与第二次PCR反应的区别在于扩增的目的片段不同，第二次PCR反应对第一次PCR反应没有扩增的基因进行扩增。所述步骤(4)中乙醇沉淀、纯化回收是通过加入无水乙醇-20。C沉淀，12000转/分离心5分钟，去上清，再用100 pl 75%的无水乙醇洗涤沉淀下来的模板DNA。 本发明的有益效果(1) 微量模板重复利用，克服模板不足的问题；(2) 特异性高、灵敏度高；(3) 成本低；(4) 整个检测方案操作过程简单，不需要专业人员。
图1是用乙醇沉淀回收PCR扩增后的原始DNA模板的示意图，按照图示所标记，(A) 为取出第一次PCR反应一小部份产物后，剩余的产物；(B)为往(A)中加入100fil的无 水乙醇，-20。C沉淀，并12000转/分离心5分钟，去上清；(C)为用100 pl 75%的无水 乙醇洗涤(B)中沉淀下来的模板DNA，并12000转/分离心5分钟，去上清(D)为往 (C)中加入新的反应体系，进行第二次反应。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。实施例1乳腺癌穿刺活检组织检测。(1) 常规酚-氯仿抽提法提取患者乳腺癌穿刺活检组织基因组DNA。(2) 设计三对引物扩增BRCA1基因上的三个片段，引物序列如下Pl上5'AATGGAAA GCTTCTCAAAGTA3'， Pl下5'ATGTTGGAGCTAGGTCCTTAC 3'; P2上5'CTAAC CTGAATTATCACTATC 3'， P2下5'GTGTATAAATGCCTGTATGCA 3'; P3上5'AA TTCTTAACAGAGACCAGAAC 3'， P3下5'AAAACTCTTTCCAGAATGTTGT 3'，并将这 些引物各稀释为10p/mo1。(3) 取组织提取的DNA、引物P1上和P1下、高温聚合酶0.5U、高温聚合酶缓冲液混合反 应，反应条件为95。C15分钟 (94。C30秒，55。C45秒，72。C45秒)35循环72°C 10 分钟。(4) 取出步骤G)中少量PCR反应液用于后面的nestedPCR,剩余部分产物用乙醇沉淀 回收组织提取的DNA:乙醇沉淀，12000转/分离心5分钟，75%乙醇洗涤，获得初始模板。(5) 取引物P2上和P2下、高温聚合酶0.5U、乙醇沉淀重回收模板(步骤4获得)、高温聚 合酶缓冲液混合反应，反应条件为95。C15分钟(94。C30秒，55。C45秒，72。C45秒) 35循环 72°C IO分钟。(6) 取出步骤(5)中少量PCR反应液用于后面的nestedPCR，剩余部分产物用乙醇沉淀 回收组织提取的DNA:乙醇沉淀，12000转/分离心5分钟，75%乙醇洗漆，获得初始模板。(7) 取引物P3上和P3下、高温聚合酶0.5U、乙醇沉淀重回收模板(步骤6获得)、高温聚 合酶缓冲液混合反应，反应条件为95。C15分钟(94。C30秒，55。C45秒，72。C45秒) 35循环 72。C10分钟。(8) 把PCR扩增的片段P1、 P2、 P3稀释1000倍，以此为模板用引物分别进行nestedPCR进行检测。实施例2口腔粘膜脱落细胞线粒体多态性分型检测。(1) 采集50名志愿者的口腔棉拭子，并用试剂盒抽提DNA。(2) 设计六对引物扩增线粒体上的六个片段，引物序列如下Pl上 5'CTCCACCATTAGCACCCAAAGC3'， Pl下5'CCTGAAGTAGGAACCAGATG3'; P2上 5'GGTCTATCACCCTATTAACCAC3'， P2下5'GTTAAAAGTGCATACCGCCA3'; P3上 5TGGCCCAACCCGTCATCTAC3'， P3下5'GGAATGCGGTAGTAGTTAGG3'; P4上5' TGACAAAAACTAGCCCCCAT3'， P4下5'GCGATGAGTGTGGGGAGGAA3'; P5上5' GACGGCATCTACGGCTCAACA3'， P5下5'TCGAAGCCGCACTCGTAAGG3'; P6上5' GAGTGCGGCTTCGACCCTATAT3'， P6下5'TTCGCAGGCGGCAAAGACTA3';并将这些 引物各稀释为10p/mol。(3) 取口腔棉拭子抽提的DNA、引物P1上、Pl下、P2上、P2下、P3上、P3下、高温 聚合酶0.5U、高温聚合酶缓冲液混合反应，反应条件为95°C 15分钟 (94°C 40秒，60°C 60秒，72。C60秒)35循环 72。C10分钟。(4) 取出少量第一次PCR反应的产物用于后续检测，剩余部分产物用乙醇沉淀口腔棉拭 子提取的DNA:乙醇沉淀，12000转/分离心5分钟，75%乙醇洗涤，获得初始模板。(5) 取引物P4上、P4下、P5上、P5下、P6上、P6下、高温聚合酶0.5 U、乙醇沉淀重 回收模板(歩骤4获得)、高温聚合酶缓冲液混合反应，反应条件为95°C 15分钟 (94°C 30秒，55。C45秒，72。C45秒)35循环72。C10分钟。(6) 把第一次反应的PCR产物与第二次反应的PCR产物稀释IOOO倍，以此为模板用引物分别进行nested PCR，并将nested PCR的结果进行测序检测，根据测序结果的信息，对 线粒体进行多态性分型。
权利要求
1.一种微量DNA检测的方法，步骤包括(1)待检样本DNA的抽提；(2)以步骤(1)中的DNA为模板，进行第一次PCR反应；(3)反应结束后，取出一部分步骤(2)中PCR反应液留待后面的检测实验；(4)将步骤(2)中产物的剩余部分利用乙醇沉淀、纯化回收原始用于检测的DNA模板；(5)以步骤(4)回收得到的原始DNA作为初始模板，进行第二次PCR反应；(6)根据需要重复(3)、(4)、(5)；(7)第一、二次PCR反应产物进行巢式PCR，再分析结果。
2. 根据权利要求1所述的微量DNA检测的方法，其特征在于所述样本DNA的抽提是 采用常规酚-氯仿抽提法或用试剂盒抽提。
3. 根据权利要求1所述的微量DNA检测的方法，其特征在于所述第一次PCR反应和 第二次PCR反应为单重或多重PCR，其第一次PCR反应与第二次PCR反应的区别在于扩 增的目的片段不同，第二次PCR反应对第一次PCR反应没有扩增的基因进行扩增。
4. 根据权利要求1所述的微量DNA检测的方法，其特征在于所述步骤(4)中乙醇沉 淀、纯化回收是通过加入无水乙醇-20。C沉淀，12000转/分离心5分钟，去上清，再用100 ^ 75%的无水乙醇洗涤沉淀下来的模板DNA。
全文摘要
本发明涉及一种微量DNA检测的方法，一种通过利用乙醇沉淀回收PCR扩增后的原始DNA模板来重复利用，以克服模板不足的方法，可用于法医学、古生物学、产前诊断遗传学检测与疾病基因组学的研究等这些DNA样本比较少的领域。与以往检测微量DNA的方法相比，本发明从起始模板的角度来解决微量DNA的检测，且整个检测方案操作过程简单，不需要专业人员，特异性高，并且灵敏度与PCR效率都很高，在实际应用中有广泛的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK101250586SQ20081003446
公开日2008年8月27日 申请日期2008年3月11日 优先权日2008年3月11日
发明者于明辉, 凯 李, 王剑晖, 肖君华, 范忠鹏, 炯 陆 申请人:东华大学