专利名称：：人工合成的修饰型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒orf5基因及应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于动物病毒学与动物传染病学
技术领域：
。具体涉及一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株ORF5基因的修饰，利用该修饰后基因在制备繁殖与呼吸综合征病DNA疫苗中的应用。
背景技术：
：猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome'PRRS,下文简称PRRS)是近年发现的一种新的病毒性传染病，以母猪发热、厌食、早产、流产、死胎、弱仔等繁殖障碍及各种年龄猪的呼吸系统疾病和高死亡率为特征。该病最早于1987年报道于美国南部，不久即传播到了中西部，并在全美迅速蔓延。随后加拿大、德国、荷兰等一些国家也先后暴发了该病(BilodeauRetal,PorcinereproductiveandrespiratorysyndromeinQuebec.VetRec,1991，129:102-103;DeaS，BilodeauR，AthanassiousRetal.SwinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinQuebec:isolationofanenvelopedvirusseralogically-relatedtolelystadvirus.CanVetJ.1992,33:801-808);亚洲地区报道此病的时间相对较晚，中国台湾地区1991年出现此病(张志成等，台湾地区猪繁殖与呼吸道征候群I病毒鉴定，中华兽医杂志，1993,19(4):268-276);日本1994年暴发PRRS(HiroyoshiKuwaahara.AnoutbreakofPRRSinJapan.JVetMedSci,1994,56(50):901-909);中国大陆1996年报道此病开始流行，并分离到病毒(郭宝清等，从疑似PRRS流产胎儿分离猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究，中国畜禽传染病，1996，87(2):1-5)。上述文献显示猪繁殖与呼吸综合征给全球养猪业造成了巨大的经济损失，仅1991年欧洲PRRS的暴发就造成了100万头猪的死亡。2006年5月以来，我国暴发了由高致病性PRRSV引发的所谓"猪高热综合症"，该病以高热、皮肤潮红、呼吸急促、神经症状等临床症状为主要特征，存在高发病率、高死亡率和低治愈率等发病特点，对我国养猪业造成了极大的危害和重大的经济损失，严重影响了农民增收和猪肉消费市场稳定及养猪业的生产安全。同猪的其它病毒性传染病的防制一样，PRRS的防制也主要是免疫预防。目前用于预防PRRS的疫苗的主要是弱毒苗和灭活苗。尽管弱毒疫苗能提供较好的免疫保护，但存在毒力返强的危险，并且返强的机率相当高，这一点在几年前丹麦等国因广泛使用弱毒苗而导致该病大暴发中得以证实。与弱毒苗相比，灭活疫苗虽然安全，但往往需要反复多次的免疫接种，而且效果不稳定，还经常导致免疫失败。可以说，目前对该病的防制一直不尽人意，迫切需要更加安全、有效的疫苗来预防和控制该病的发生与流行。猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV,下文简称PRRSV)ORF5基因编码的搪蛋白GP5是PRRSV中最主要的保护性抗原，可诱导体液免疫和细胞免疫，而且目前确定的最主要的中和表位也位于其N端胞外区，因此是设计PRRS新型疫苗的首选目标基因(DeaS，GagnonCA,MardassiH.Currentknowledgeonthestructuralproteinsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus:comparisonoftheNorthAmericanandEuropeanisolates.ArchVirol,2000a,145:659-688)。1998年Pirzaden等(PirzadehB,DeaS.ImmuneresponseinpigsvaccinatedwithplasmidDNAencodingORF5ofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus.JGenVirol,1998a,79:989-999)用编码GP5的,真核表达质粒免疫猪，可使接种猪产生抗GP5的特异性抗体，接种猪可免于强毒攻击造成的全身性病毒血症和肺部病变，并使间质性肺炎和支气管肺泡炎明显减轻。1999年Kwang等(KwangJ,ZuckermannF,RossG,etal.AntibodyandcellularimmuneresponsesofswinefollowingimmunizationwithplasmidDNAencodingthePRRSvirusORFs4，5,6and7.vetSci,1999,67:199~201)用编码GP4、GP5、M、N4种结构蛋白的基因构建了4种DNA疫苗，免疫猪中，表达GP5的质粒激发的抗体具有最强的中和病毒的能力。但上述研究均发现表达GP5蛋白的DNA疫苗诱导的中和抗体不高(<1:8)。最近，Ostrouski等(OstrowskiM,GaleotaJA,JarAM，etal.IdentificationofneutralizingandnonneutralizingepitopesintheporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusGP5ectodomain.JVirol,2002,76:4241~4250)在采用噬菌体表面展示技术确定GP5中和表位时，发现与中和表位紧邻的上游存在一个非中和表位，此表位具有类似于HIV中覆盖表位的覆盖效应，也正是这一覆盖表位的覆盖效应，导致GP5中和表位无法充分暴露，从而难以激发很强的中和抗体。另外，高致病性PRRSV的GP5蛋白氨基端胞外域高度糖基化，推测具有5个N-糖基化位点(N30、N34、N35、N44禾DN51)。为了研究糖基化在PRRSV中和抗体反应中的作用，IsrarulH.Ansari等[10]利用PRRSV的反向遗传系统构建了一系列PRRSVGP5蛋白糖基化位点发生点突变的突变株，研究结果表明在中和表位两端的糖基化的突变既提高了病毒在中和试验中的敏感性，也增强了糖基化位点附近的抗原表位的免疫原性。蛋白的表达水平与其引起的免疫反应直接相关，而编码氨基酸密码子的摇摆性导致了不同物种的细胞在蛋白翻译过程中具有密码子使用的偏嗜性，哺乳动物细胞在蛋白翻译过程中与病毒蛋白氨基酸密码子使用频率存在着明显差异。很多文献也报道了基因改造成功的例子。基于这三个发现，申请人对ORF5基因进行了修饰，即将人工合成的编码辅助性T淋巴细胞表位的核苷酸插入ORF5的中和表位和覆盖表位间，将中和表位两端的糖基化位点(N30、N34、N35和N51)消除，并把ORF5基因的密码子改造为猪体嗜好的密码子，以DNA疫苗的方式比较了修饰与未修饰的ORF5基因的免疫原性与免疫反应。
发明内容本发明的第一个目的是人工合成高致病型猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF5基因，并对其进行修饰，以暴露其中和表位，提高蛋白的表达量从而诱发更有效的免疫应答，获得一种免疫原性更好的ORF5基因。本发明的另一个目的是制备一种表达高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒修饰的ORF5基因的DNA疫苗及其在制备猪繁殖与呼吸综合征DNA疫苗中的应用。本发明通过以下技术方案实施一种人工合成的修饰型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:l所示。一种人工合成的修饰型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因是将人工合成的编码辅助性T淋巴细胞表位的核苷酸序列插入GP5的中和表位和覆盖表位间，将中和表位两端的糖基化位点(N30、N34、N35和N51)消除，并把GP5基因的密码子改造为猪体嗜好的密码子而获得。所述的表达高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒修饰的ORF5基因的DNA疫苗是将修饰的ORF5基因插入真核表达载体.pcDNA3.1的KpnI与XhoI位点构建而成，含有该质粒的大肠杆菌^&c/!en'cWaco/ZZ)//5ff/pcDNA3.1-SynORF5，于2008年7月25日保藏在中国湖北省武汉市的武汉大学内中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCCNO:M208U2。本发明还包括上述修饰的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因在制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗上的应用。本发明的发明效果本发明与申请号为2004100'09838.3的主要技术特征和实施效果的比较分析如表1所示:表l3K发明与现有技术的主要技术差别<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>更详细的技术方案如下列步骤如《具体实施方案》所述。序列表SEQIDNO:1是本发明修饰后的ORF5基因的序列图1:显示了高致病性PRRSV修饰的ORF5基因DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5和未修饰的ORF5基因DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5的结构2:显示了未修饰的ORF5基因DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5的酶切鉴定结果图3:显示了修饰的ORF5基因DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5的酶切鉴定结果图4:显示了高致病性PRRSVORF5基因DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5和pcDNA3.1-SynORF5免疫Balb/c小鼠后的ELISA抗体水平图5:显示了高致病性PRRSVORF5基因DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5和pcDNA3.1-SynORF5免疫Balb/c小鼠后的中和抗体水平，图5A显示针对高致病性PRRSV(JXA1)产生的中和抗体水平，图5B显示针对经典毒株(CH-la)产生的中和抗体水平图6:显示了高致病性PRRSVORF5基因DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5和pcDNA3.1-SynORF5免疫Balb/c小鼠后诱导的细胞免疫水平(脾淋巴细胞剌激指数)。图7:显示了高致病性PRRSVORF5基因DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5和pcDNA3.1-SynORF5免疫Balb/c小鼠启，用ELISA方法检测小鼠脾淋巴细胞被特异抗原刺激后分泌IFN-y的水平图8:显示了高致病性PRRSVORF5基因DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5和pcDNA3.1-SynORF5免疫Balb/c小鼠后，用荧光定量RT-PCR方法检测小鼠脾淋巴细胞被特异抗原刺激后IFN-y的mRNA相对水平。具体实施方式以下结合说明书附图对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明的保护范围。—、PRRSVORFS基因的修饰和表达修饰的ORF5基因的DNA疫苗的构建1、修饰的ORF5基因的人工合成该修饰的高致病性的猪繁殖与综合征病毒(简称PRRSV,下同)ORF5基因是将人工合成的编码辅助性T淋巴细胞表位的核苷酸序列插入ORF5的中和表位和覆盖表位间，将中和表位两端的糖基化位点(N30、N34、N35和N51)消除，并把ORF5基因的密码子改造为猪体嗜好的密码子而获得。该基因的上游引入KpnI酶切位点，下游引入XhoI酶切位点，改造后的基因序列全长为663bp，由宝生物工程(大连)有限公司协助合成。合成后的序列如下申请人将该修饰好的基因命名为SynORF5。2、表达修饰的ORF5基因的DNA疫苗质粒的构建将上述合成的基因产物SynORF5用Kpnl+Xho1酶切后，将纯化回收的酶切产物与用KpnI+XhoI酶切的pcDNA3.1真核表达质粒连接，获得表达修饰改造的ORF5基因的真核表达质粒pcDNA3.1-SynORF5,经KpnI、XhoI单酶切和Kpnl+XhoI双酶切鉴定证实构建正确。质粒的重组、制备、酶切分析均按常规方法进行(参见J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)。二、用于对比试验的表达未修饰的ORF5基因的DNA疫苗表达质粒pcDNA3.1-ORT5的构建设计一对可扩增高致病性PRRSVORF5完整编码区的引物PORF5F和PORF5R，上下游引物两端分别设计了Kpnl和Xhol位点。引物序列如下PORF5F:5，-GCCGGTACCACCATGTTGGGGAAGTGCTTGAC-3'PORF5R:5'-GCACTCGAGCTAGAGACGACCCCATAGTTC-3'提取高致病性PRRSVJXA1株((Tian等，2007，EmergenceofFatalPRRSVVariants:UnparalleledOutbreaksofAtypicalPRkSinChinaandMolecularDissectionoftheUniqueHallmark))总RNA为模板，进行RT-PCR扩增(参见(参见J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版))，扩增的片段大小为624bp。RT-PCR反应条件为50°C30min，94'C5min;进入PCR循环，94°C1min,57°C1min，72°Cmin,35个循环后，72。C延伸10min。反应结束后，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。纯化回收目的片段，纯化的扩增产物经Kpnl和Xhol双酶切后，直接克隆到真核表达载体pcDNA3.1的Kpnl和Xhol位点，获得的重组质粒pcDNA3.1-ORF5经KpnI、Xhol单酶切及Kpnl和Xhol双酶切与PCR鉴定证实构建正确，测序证实无碱基误配。质粒的重组、制备、酶切分析均按常规方法进行(J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002年)。三、质粒pcDNA3.1-ORF5、pcDNA3.1-SynORF5的大量制备(1)挑取含有质粒的菌落接种于75mL含终浓度为60ng/mL氨苄青霉素的LB培养液，37'C300r/min培养过夜，6000r/min5min，收集细胞沉淀，用3mL溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/LTris-Cl(pH8.0),高压灭菌后置4'C保存备用)悬浮(吹散或涡旋)。(2)加6mL溶液n(0.2mol/LNaOH,1%SDS，现配现用)，冰浴7-10min。(3)加4.5mL溶液III(3mol/L乙酸钾，冰醋酸调pH值至4.8),冰浴7-10min。4。C10000r/min10-15min。(4)取上清，加0.6倍体积的异丙醇，混匀，-20°C30min或室温5min。室温，10000r/min6-15min。(5)弃上清，用75%乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加1.5mLTE(10.0mmol/LTris-HCl,l.Ommol/LEDTA)悬浮(洗壁20min左右)。(6)力Q1.5ml即1倍体积冰预冷的5mol/LNH4Ac,混匀。4°C10000r/min10min。(7)将上清转移至7mL的离心管，加l倍体积(3mL)的异丙醇混匀，-2(TC作用30min。12000r/min15min。(8)弃上清，用75%乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加500nLTE悬浮(洗壁20min左右)，并转移至1.5mL的离心管。(9)加入适量的RNase,37°Clh,去RNA。(10)力[]l倍体积的13。/。的PEG8000(含1.6mol/LNaCl),混匀，-20°C30min(可以过夜)。离心，弃上清，用400nLTE重溶。(11)加等体积酚氯仿异戊醇抽提2次，氯仿异戊醇抽提l次。(12)力Q100nl10mol/LNH4Ac,充分混匀后，加入2倍体积的无水乙醇，-20。<:沉淀30min。4'C12000r/min离心5-10min。(13)弃上清，用75%乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加50nLTE或H2O重溶，置-20'C备用。四、DNA疫苗的生产工艺疫苗生产工艺的主要流程质粒的转化、质粒的大量提取、质粒浓度的测定与稀释。1、质粒的转化将DNA疫苗表达质粒pcDNA3.1-ORF5和pcDNA3.1-SynORF5(氨苄抗性)分别转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。具体操作是1)取100nl感受态细胞悬液转移到无菌的1.5mlEP管中，加入10^1连接产物，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min。2)将离心管放到预先加温到42'C的循环水浴中热沖击90秒。3)快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却l2min。4)每管加400WLB培养基。用水浴将培养基加温至37'C,然后将离心管转移到37'C摇床上，温育45min,使细菌复苏。为达到有效转化，复苏时转速不宜超过225转/分。5)取100nl转化的感受态细胞转移到含终浓度为60pg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平皿上，用一无菌弯头玻棒将转化的细胞均匀地涂布到琼脂平板表面。6)将平皿置37'C培养，直至液体被吸收，然后倒置平皿培养，12-16h可出现菌落。2、质粒的大量提取同本说明书的"三、质粒pcDNA3.l-SynORF5的大量制备"的方法(制备步骤同上述"三")。3、质粒浓度的测定、稀释利用分光光度计测定大量制备的质粒的浓度，用磷酸盐缓冲液(8.0gNaC1,0.2gKC1,2.9gNa2HP04'12H20，0.2gKH2P04加ddH20至lOOOmL)(PBSpH7.4)将其稀释到lug/u1，即可用于动物注射。五、疫苗的免疫效力检验疫苗对Balb/c小白鼠的免疫效力试验将DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5和pcDNA3.1-ORF5分别经后腿肌肉注射6周龄的Balb/c小鼠，每组6只，每只小鼠100nl(含100吗质粒)，共免疫2次，间隔3周；同时用空白质粒载体pcDNA3.1作为核酸免疫的阴性对照。于首次免疫后3、6周经尾静脉负压采血，分离血清，检测ELISA抗体和中和抗体，结果表达修饰的ORF5基因的DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5诱导的ELISA抗体和中和抗体均明显高于表达未修饰的ORF5基因的DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5(详见实施例2)。实施例1:含有本发明修饰的基因的质粒和含有对照基因的质粒的制备1、表达未修饰的ORF5基因(对照)的真核表达质粒pcDNA3.1-ORF5的构建提取高致病性PRRSVJXAl(Tian等，2007，EmergenceofFatalPRRSVVariants:UnparalleledOutbreaksofAtypicalPRRSinChinaandMolecularDissectionoftheUniqueHallmark)总RNA为模板，PORF5F禾口PORF5R为引物RT-PCR扩增ORF5基因。纯化的扩增产物经KpnI和XhoI酶切后，直接克隆到真核表达载体pcDNA3.1的Kpnl和XhoI酶切位点，获得的重组质粒pcDNA3.1-ORF5，其结构见附图l,酶切与PCR鉴定结果见附图2(Kpnl、Xhol单酶切均只有一条约6000bp的带、Kpnl和XhoI双酶切产生一条约600bp和一条约5400bp的带)。2、表达修饰的ORF5基因的真核表达质粒pcDNA3.1-SynORF5的构建将人工合成的SynORF5基因用Kpnl和XhoI酶切，回收纯化后，同时与用Kpnl和Xhol酶切的真核表达载体pcDNA3.1连接，获得表达修饰后的ORF5基因的真核表达质粒pcDNA3.1-SynORF5，结构见附图1,酶切鉴定结果见附图3(Kpnl、.Xhol单酶切均只有一条约6000bp的带、Kpnl和Xhol双酶切产生一条约660bp和一条约5400bp的带)。实施例2:本发明的DNA疫苗和对照疫苗对小鼠免疫效力的生物学实验1、Balb/c小鼠的免疫程序将Balb/c小鼠分为3组，每组6只，釆用后腿肌肉注射，每只小鼠100nl(含100ng质粒)，共免疫2次，间隔3周，同时用空白质粒载体pcDNA3.1作为核酸免疫的阴性对照。在首免后3、6周经尾静脉负压采血，分离血清，检测ELISA抗体和中和抗体。于首免后6周，通过颈椎处死所有免疫小鼠，无菌取出脾脏，利用淋巴细胞分离液(购自天津TBD公司)分离脾淋巴细胞，进行细胞免疫(包括脾淋巴细胞刺激增殖指数禾tlIFN-Y的mRNA转录、分泌水平)检测(Xiao等ComparisonofimmuneresponsesandprotectiveefficacyofsuicidalDNAvaccineandconventionalDNAvaccineencodingglycoproteinCofpseudorabiesvirusinmice.Vaccine.2004'22,345-351)。2、ELISA抗体水平采用大肠杆菌表达和纯化的GP5蛋白作抗原，检测血清中的ELISA抗体水平，结果显示经修饰改造后的DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5免疫组诱导的ELISA抗体水平要明显高于未经修饰的DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5免疫组(P<0.05,t-test),表明修饰后的ORF5具有更好的免疫原性，结果如附图4。3、中和抗体水平采用Yoon等(YoonIJ,JooHS,GoyalSM.Amodifiedserumneutralizationtestforthedetectionofantibodytoporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinswinesera.JVetDiagnInvest,1994,6:289-292)报道的改良的中和抗体检测方法，检测血清中的中和抗体水平。用高致病性PRRSV毒株与经典PRRSV毒株进行的中和试验，结果都与ELISA抗体结果一致，未经修饰的DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5免疫组的中和抗体水平不高，并且上升得较为缓慢，而修饰改造后的DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5免疫组的中和抗体快速上升，个别免疫小鼠的中和抗体于第6周达到了l:32，与pcDNA3.1-ORF5免疫组相比差异极显著(P0.01,t-test),试验结果如附图5。4、脾淋巴细胞剌激增殖指数检测采用MTT法测定小鼠脾淋巴细胞的刺激指数(SI)(沈关心等主编.现代免疫学实验技术.湖北科学技术出版社，1998年版)。结果本发明经修饰改造后的DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5免疫组的刺激增殖指数要显著高于未经修饰的DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5免疫组(P<0.01,t-test)。试验结果如附图6。5、ELISA方法检测脾淋巴细胞分泌的IFN-y水平采用ELISA方法(龙振洲，医学免疫学(第2版).北京人民卫生出版社,2000年版)检测小鼠脾淋巴细胞被特异抗原刺激后分泌IFN-y的能力。结果本发明经修饰改造后的DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5免疫组分泌IFN-y水平要显著高于未经修饰的DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5免疫组(P<0.01,t-test)。试验结果如附图7。6、荧光相对定量RT-PCR方法检测淋巴细胞被特异抗原刺激后IFN-Y的mRNA水平采用荧光相对定量RT-PCR方法(参见章静波等.细胞生物学实验技术.化学工业出版社，2006年版)检测小鼠脾淋巴细胞被特异抗原刺激后IFN-Y的mRNA水平。小鼠脾淋巴细胞在体外经特异抗原(紫外线照射灭活的PRRSV)刺激后，提取总RNA,利用oligodT将mRNA体外转录成cDNA。利用引物p-actins:5，-CACTGCCGCATCCTCTTCCTCCC-3',(3-actinr:5'-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3，扩增小鼠看家基因(3-actiib并将其作为相对定量RT-PCR的内参；引物IFN-ys:5'-TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA-3',IFN-丫r:5，-TGGCTCTGCAGGATTTTCATG-3，，扩增小鼠IFN-y基因。荧光定量PCR反应体系(25^1)包括IFN-y和P-actin上下游引物各0.5pl(lO)aM),2xSYBR⑧GreenRealtimePCRMasterMix(包括反应缓冲液、dNTP、Mgcl2、SYBRGreenI、Taq酶)(购自ToYoBo公司，上海)12.5pi,双蒸水11.0pl，cDNA样品0.5|al。每个样品做三个重复。反应扩增条件为50°C2min,94°C预变性lOmi，进入PCR循环94°C变性15s和60°C退火与延伸1min,共40个循环。整个反应过程中的荧光信号的变化由ABIPrism7500实时荧光定量PCR仪(购自美国AppliedBiosystems公司)检测。结果本发明经修饰改造后的DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5免疫组IFN-y的mRNA水平要明显髙于未经修饰的DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5免疫组(P<0.01，t-test)。试验结果如附图8。附录术语定义英文名称中文名称pcDNA3.1空白质粒载体pcDNA3.1-ORF5表达未修饰的ORF5基因的DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5表达修饰型的ORF5基因的DNA疫苗序列表<110>华中农业大学<120>人工合成的修饰型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5基因及应用<130><141>2008-08-04<160>2〈170>Patentlnversion3.1<210〉1〈211>663<212〉DNA〈213>猪(Susscrofa)<220><221>gene<222>(1)..(663)<223><220><221>CDS<222>(10)..(657)<223>〈400〉1gccggtaccaccatgctgggcaagtgcctgacegcctgctgttgcteccgc51ThrMetLeuGlyLysCysLeuThrAlaCysCysCysSerArg1510ttgctgttcctgtggtgtategtgcccttctatctggccgtgctggtg99LeuLeuPheLeuTrpCyslieValProPheTyrLeuAlaValLeuVal15202530gccgcctecgccaagttcgtggetgcctggaccctgaaggetgccget147AlaAlaSerAlaLysPheValAlaAlaTrpThrLeuLysAlaAlaAla354045aacgccgcctegteccacatecagctgatetacaacctgaccctgtgt195AsnAlaAlaSerSerHislieGinLeulieTyrAsnLeuThrLeuCys505560gagctggccggcaccgactggctggcccagaagttcgactgggccgtg243GluLeuAlaGlyThrAspTrpLeuAlaGinLysPheAspTrpAlaVal657075gagaccttcgtgatettccccgtgctgacccacategtgtectacggc291GluThrPheValliePheProValLeuThrHislieValSerTyrGly808590gccctgaccaccteccacttcctggacaccgtgggcctggccaccgtg339AlaLeuThrThrSerHisPheLeuAspThrValGlyLeuAlaThrVal95100105110tecaccgccggctactaccacggccgctacgtactgtectecatetac387SerThrAlaGlyTyrTyrHisGlyArgTyrValLeuSerSerlieTyr115120125gccgtgtgcgccctggccgccctgatetgcttcgtgatecgccttgcc435AlaValCysAlaLeuAlaAlaLeulieCysPheVallieArgLeuAla130135140aagaactgcatgtectggcgctacagetgtacacgctacaccaacttc483LysAsnCysMetSerTipArgTyrSerCysThrArgTyrThrAsnPhe145150155ctgctggacaccaagggccgcctgtaccgctggcgcagecccgtgate531LeuLeuAsp160gtggag肌gVaiGluLys17533gCgCgtgLysArgValtecgccgagSerAlaGluThrLysggcggcGlyGlygtgctgValLeu195ctgtggLeuTrp210<210>2<211〉214〈212〉PRT<213>猪(Susscrofa)〈400>2ThrMetLeuGlyArg165aaggtgLysVal180gacggcAspGlyggccgcGlyArg1PheLeuSerAlaAlaSer50AlaGly65PheValGlyLysCysLeu5TrpLys35SerCys20PhelieValProValAlaAlaHislieGinThrAspTrpliePheThrThrSerAlaGlyCysAla130CysMet145Tyr115LeuHis100TyrPro85PheLeu70ValLeu55AlaLeuLeuAspHisGlyArgAlaAlaLeuSerTrpArgTyr150lie135SerLeuTyrArggaggtggagGluValGlutecgccgccSerAlaAla200ctgtagetcLeuLeu215TrpArg170ggccacGlyHis1853CCcccThrProgagtgcSerProVallieThrAlaCys10PheTyrLeu25TrpThrLeu40lieTyrAsnGinLysPheThrHislie90ThrValGly105TyrValLeu120CysPheValCysThrArgCysCysAlaValLysAlaLeuAsp75VallieTyr155Ctg3tCg3CLeulieAspctgacccgcLeuThrArg205Thr60TrpSerLeuAlaSerSerArg140ThrctgLeu190gtgValSerArgLeu15LeuValAla30AlaAlaAsn45LeuCysGluAlaValGluTyrGlyAla95ThrValSer110lieTyrAla125LeuAlaLysAsnPheLeuLeuAlaAlaLeuThr80LeuThrValAsnLeu160579627663AspThrLysGlyArgLeuTyrArgTrpArgSerProVallieValGlu165170175LysGlyGlyLysValGluValGluGlyHisLeulieAspLeuLysArg180185190ValValLeuAspGlySerAlaAlaThrProLeuThrArgValSerAla195200205GluLeuTrpGlyArgLeu210权利要求1、一种人工合成的修饰型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示。2、包含人工合成的修饰型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5基因质粒的大肠杆菌^sc/en'c力/acoiZW5ff/pcDNA3.1-Syn0RF5，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO:M208112。3、包含人工合成的修饰型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5基因质粒的大肠杆菌的DNA疫苗，所述的大肠杆菌是￡c/en'c/u'aco7/ZW5tz/pcDNA3.1-SynORF5，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO:M208112。4、权利要求1所述人工合成的修饰型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5基因在制备猪繁殖与呼吸综合征DNA疫苗中的应用。全文摘要本发明属于动物病毒学与动物传染病学
技术领域：
，具体涉及一种人工合成的修饰型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆及作为疫苗的应用。特征是，将人工合成的编码辅助性T淋巴细胞表位的核苷酸序列插入ORF5的中和表位和覆盖表位间，将中和表位两端的糖基化位点(N30、N34、N35和N51)进行消除，并把ORF5基因的密码子改造为猪体嗜好的密码子而获得，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示。该修饰基因包含在真核表达质粒pcDNA3.1-SynORF5中，含有该质粒的大肠杆菌EscherichiacoliDH5α/pcDNA3.1-SynORF5，保藏在CCTCC，保藏号为CCTCCNOM208112。本发明还公开了该基因在制备猪繁殖与呼吸综合征DNA疫苗中的应用。文档编号C12R1/19GK101392261SQ200810048768公开日2009年3月25日申请日期2008年8月12日优先权日2008年8月12日发明者方六荣,彬李,江云波,肖少波,陈焕春申请人:华中农业大学