专利名称：溪蟹金属硫蛋白基因及其转基因蓝藻以及金属吸附材料的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种溪蟹金属硫蛋白基因及其转基因蓝藻以及金属吸附材料的制备。
背景技术：
公知，目前有些工业废物、矿泥废物、城市废水、放射性废物、采矿废物等环境废物中含有大量的金属，如镉、汞、铅等，它们进入环境后不能被生物降解，大都参与食物链循环，并最终在生物体内累积，破坏生物体正常生理代谢活动，严重影响周围环境和人畜健康。因此，如何有效地处理含有有害金属的废物已成为人类共同关注的问题。目前，已开发应用的此类废物处理方法很多，较传统的方法有化学沉淀法、化学氧化还原法、活性炭吸附法、离子交换法、溶剂萃取法、物理法、膜分离法等，这些方法在一定条件下有效，但存在劳动强度大，效率低、操作复杂、对低浓度废水的处理较难等问题，而且还造成与对大量受污染废料的去除和处置相关的高昂费用等问题。
为了满足人们对环境质量的日益严格的要求，利用生物技术对金属污染进行微生物转化回收和生态恢复的研究在污染治理中具有不可替代的优势。生物修复是利用天然或人工改造的生物整体或组分来处理环境污染物的方法，具有投资少、效率高、可以原位处理低浓度环境有害污染物的特性，在环境治理中显示了极大的潜力，它还可以协调经济发展与环境保护之间的关系，实现社会的可持续发展。生物修复技术是替代物理化学修复的一种非常吸引人的方法，与物化技术相比，生物修复不止一个功能基团组起作用，并且结合生物代谢活性系统，生物修复具有更大的效用。
近年来研究表明，对环境造成污染的多种金属均能诱导生物体内肝脏、肾脏、脑等组织内金属硫蛋白(metallothionein)生物合成的增加。金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于生物体内、低分子量、富含半胱氨酸，能被多种金属诱导的金属结合蛋白，具有对金属的解毒作用，可以高效地从污水中吸附被污染的金属；参与微量元素的贮存、运输和代谢；消除体内自由基等功能，所有这些生理功能使金属硫蛋白成为环保业关注的、有潜在应用价值的重要分子。目前，人们称该方法为生物吸附法，具有投资少、操作成本低、高吸附率、高选择性、不产生二次污染等优点，越来越受到人们的重视。
目前，我国已有利用转MT基因蓝藻直接用于金属污染治理的报道，与传统的物化处理方法相比，具有治理效率高，成本低，没有第二次污染等优点，对部分具有经济意义的金属还可以用以回收。但是在实际工业使用中还存在以下缺陷一是由于自然界生物体某些物理性质例如颗粒小、密度低、机械强度低，难于固液分离等，导致获得的转基因蓝藻难以直接应用于金属的去除，从而限制了生物吸附技术的工业应用；二是现有所转用的MT基因多来自于哺乳类动物，如小鼠、家兔等，还未见有转无脊椎水生动物MT基因的报道。由于无脊椎水生动物MT生化结构、理化性质和生理功能的多样性，决定了其广泛的适用范围，无脊椎水生动物MT最显著的特点就是结合金属元素的种类及总量变化的多样性，一般，在无脊椎动物MTs中，每克分子MT结合6个或7个金属原子，针对不同金属有明显的结合顺序，可同时吸附污水中多种金属。所以利用充分的无脊椎动物资源，特别是在实际研究操作中的简便性，更是突显出其在实际应用中的优势，这一优势可在污水中存在的金属种类较多时造成生产的成本优势，而且处理效果会更加理想，所以无脊椎水生动物MT在金属吸附处理中的研究就更显现出其科学及实际意义。
发明内容
本发明为了解决现有哺乳类动物MT基因及其转基因蓝藻在含有金属的废物处理过程中很难直接用于吸附金属以及结合金属种类比较单一的问题，提供一种溪蟹金属硫蛋白及其转基因蓝藻以及金属吸附材料的制备。
本发明是采用如下技术方案实现的一种溪蟹金属硫蛋白基因，该基因的核苷酸序列如下 5`ATGGATGATCCTTGCTGCACAGAAGGAACGTGCGAGTGTGCTGAGGGCAAGTGCAAGTCAGGGTGTAAGTGCTCCTCCTGTCGCTGTTCACCTTGCGAGTAATGCATTTCCGAGTGCTAGTGCAGCAATGCGGAGGAAAGCGCCAAGAACTGCTCGAAGCCTTGCTCCTGCTGCCCC 3`。该序列为溪蟹金属硫蛋白基因的正义链，其反义链可以根据碱基互补原则推测得到，这是本领域的普通技术人员很容易得到的。
将得到的溪蟹金属硫蛋白基因通过表达载体和穿梭表达载体转入蓝藻中，得到转基因蓝藻。表达载体优选pUC19，穿梭表达载体优选pRL-489。
将上述得到的转基因蓝藻和甲壳素以体积比3∶1的比例混合，然后再加入浓度为0.75mol/L、相当于转基因蓝藻和甲壳素混合液体积2-4倍的NaOH溶液，在50℃下加热10min，得到细胞泥；然后将1％～3％的海藻酸钠溶液和细胞泥以体积比1∶1混合均匀，用静电液滴法将得到的混合液注入浓度为0.05-0.2mol/L、体积为该混合液体积5倍的CaCl2溶液中，海藻酸钠溶液与氯化钙溶液反应生成海藻酸钙胶球，同时将转基因蓝藻包埋在海藻酸钙胶球中，固定化0.5-1h，然后用生理盐水洗脱，得到含有转基因蓝藻的包埋体，该包埋体即为金属的吸附材料。
上述过程中，所述细胞泥是泥状的转基因蓝藻和甲壳素的混合物；甲壳素、海藻酸钠溶液、生理盐水均为公知产品，很容易得到；静电液滴法也是本领域的普通技术人员很容易实现的。其中氢氧化钠的作用是提供一种弱碱性环境，利于甲壳素的溶解，使甲壳素与转基因蓝藻混合更均匀；生理盐水的主要作用是一方面在不破坏转基因蓝藻的情况下，洗脱其它反应物(比如过量的未反应的物质，沉淀，未被包埋的菌体等)，另一方面保证转基因蓝藻的活性。
与现有技术相比，本发明具有以下优点 1、所选溪蟹金属硫蛋白的独特性溪蟹类是低等指示生物在水体基底层代表性的物种，直接面对沉积在水体内的金属离子，而无脊椎水生动物MT最显著的特点就是结合金属元素的种类及总量变化的多样性，一般，在无脊椎动物MT中，每克分子MT结合6个或7个金属原子，针对不同金属有明显的结合顺序，可同时吸附污水中多种金属；所以本发明以无脊椎动物溪蟹的金属硫蛋白作为转化基因，由于无脊椎动物MT生化结构、理化性质和生理功能的多样性，决定了其作为金属生物吸附材料具有相当广泛的使用范围，可同时吸附含有金属的废物中多种金属，吸附能力较强；并且在实际试验设计中具有模式生物的诸多特点，操作上具有相当的简便性，可为我们提供大量的数据参考； 2、在转基因体的选择上具有充分的科学依据经过大量的实验室基础理论研究，科学的统计分析，选择表达性高、结合性强、易于繁殖、操作稳定性好的转MT基因体，即蓝藻，蓝藻是一门最原始、最古老的藻类植物，生长在海水、淡水和陆地阴湿的地方，其主要特征是具有植物型放氧光合作用的原核生物，结构简单、生长迅速、成本低、适应性强、部分种类具有天然转化系统和有效重组系统。蓝藻是分布最广泛的生物，具有很强的抵抗恶劣环境的能力，因为其结构简单，易于繁殖，所以转基因蓝藻是现代生物工程领域一个闪亮的热点。将水生物体的MT基因转移到蓝藻中，这样得到的转基因蓝藻经过大规模的培养后就可以与金属结合，然后进行降解或沉淀，这种处理方法成本大大降低； 3、在微生物固定技术上实现重大突破由于自然界生物体某些物理性质导致的缺陷，例如颗粒小、密度低、机械强度低，难于固液分离等，导致悬浮生物体难以直接应用于金属的去除，从而限制了生物吸附技术的工业应用，针对此技术限制，本发明采用了高效的转基因蓝藻固定技术，固定化材料与自由的悬浮细胞相比，具有提高生物体的稳定性，易于控制，易于进行固液分离，处理过程简单，固定化转基因蓝藻易于在不被破坏的情况下得到再生和重复利用等优点； 总之，本发明具有极大的发展潜力，具有成本低、效益高、不造成二次污染等优点，同时利用基因工程、分子生物学等技术的发展和应用，为生物技术的广泛应用提供了有利条件。整个操作过程在处理污染的同时不仅美化了环境，还可以获得相当的经济效益。
图1为溪蟹总RNA提取后的电泳图 图2为PCR体外扩增MT基因片段的电泳图 图3为酶切鉴定结果的电泳图 图4为重组穿梭表达载体Prl-MT酶切鉴定结果的电泳图 图5为转基因蓝藻的分子检测结果的电泳图
具体实施例方式 实施例1溪蟹金属硫蛋白基因的获得 1、溪蟹总RNA的提取 称取100mg(或200mg)组织置液氮中，加TRIZOLLS试剂，在匀浆器中快速匀浆至无可见组织，将液相转移到1.5mL eppendorf管内。室温静置5min，使核酸蛋白完全降解。加入0.2mL氯仿，颠倒混匀，静止2～15min。4℃，11500rpm离心15min，取上层水相于一新eppendorf管中。加入0.2mL异丙醇沉淀RNA。先在静置2～15min，4℃，11500rpm离心10min。弃上清，用75％乙醇(1‰DEPC水配制)洗涤沉淀，4℃，7400rpm离心5min。弃掉上清液，室温干燥沉淀10m in。用无RNA酶水溶解沉淀，加1u L(40u/u L)RNA酶抑制剂，置-20℃备用。
用甲醛变性电泳法测总RNA的完整性，如图1所示，1、2、3泳道分别对照和重复样品，结果显示稳定性较好，电泳结束检验时发现，在18S，28S处有明显的条带出现，证明有mRNA的存在，5sRNA非常容易丢失，所以不明显。
2、cDNA第一链的合成(反转录) 取RNA样品4μl，逆转录酶MLV(Promega)3μl，5×RT buffer缓冲液(Promega)10μl，dNTP 10μl，RNasin 2μl，用DEPC处理过的水配成50μl反应体系，经过70℃10min、0℃60min、42℃60min反应后，PCR检测产物。
3、PCR体外扩增溪蟹金属硫蛋白基因MT 根据文献报道的蟹类金属硫蛋白核苷酸序列，用BLAST程序将其与核苷酸序列数据库中的序列进行比较，确定与该核苷酸序列同源性较高的片段，作为引物设计的依据，然后再参考其他甲壳动物的核苷酸序列，设计PCR反应的简并引物如下表1 表1用于扩增蟹类金属硫蛋白cDNA的引物
*L2 and L4 are in antisense direction.**N＝A+C+G+T；R＝A+G；Y＝T+C；M＝A+C MT cDNA扩增采用RT-PCR；反应模板为3只溪蟹鳃总RNA的混合物；反应引物由上海生工生物工程有限公司合成，其序列见表1(No.1～4)，其中L1和L2序列相应于MT的开始的5位和最后的7位氨基酸残基的核苷酸序列，用于扩增MT cDNA片段；L3和L4用于巢式PCR的内引物。反应退火的温度使用全简并引物时为50℃，使用特异引物和部分简并引物时为55℃。
PCR体外扩增后，如图2所示，1泳道为对照；2、3泳道为重复样品；maker为DL2000。电泳结果显示获得大小约为170bp的片段，然后回收扩增产物，储存于-20℃，备用。
4、PCR回收产物与克隆载体的连接 PCR产物的连接参照Promega公司的pGEM-T Easy Vector System产品使用手册进行，体系如下表2。加入各组分之后于4℃连接24h； 表2连接反应体系 反应物体积(μl) pGEM-T Easy Vector1.0 PCR Product 7.0 10×Buffer 1.0 T4DNALigase1.0 总体积 10.0 5、大肠杆菌感受态细胞的制备 将宿主菌E.coli DH5a在LB培养基平板上划线，37℃过夜培养16-20h，从平板中挑出单菌落，移至5ml LB培养液中，37℃过夜培养。按1∶50的接种量转移到100ml的LB培养液中，37℃强烈震荡培养至OD600达0.3-0.6，即对数生长期或对数生长前期。将培养物置于冰上10min，然后转移至冰预冷的50ml离心管中，在4℃，8000r/min离心10min，收集菌体，然后加入10ml新鲜配制的用冰预冷的0.1mol/L CaCl2，置于冰上3h，使细胞致敏。4℃，8000r/min离心10min，收集菌体，每50ml原培养物加2ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2，悬浮细胞，按200ml/Eppendorf管分装细胞。未转化的加10％甘油于-80℃冻存。
6、用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 将5μl待转化的连接产物加入到100μl的保存于-80℃的大肠杆菌感受态细胞DH5a中，温和混匀，置于冰上30min。42℃热休克50s，速置冰上2min。加入800μl无抗生素的LB培养基，37℃温浴15min，转到摇床中温和震荡培养60min，让细菌表达抗性蛋白。
7、阳性重组质粒的筛选 将上述得到的菌液在12000转离心30s，去除800μl上清，取200μl剩余菌液，均匀涂布于预先涂有100μl IPTG(诱导物)和20μl X-Gal(生色底物)的LB固体培养基(含0.1mg/ml氨苄青霉素)上，37℃培养约12h。由于所用载体pGEM-TEasy的多克隆位点在其β-半乳糖苷酶a肽链的编码区内，外源DNA片段的插入会导致该肽段无法合成，因此也就不能分解生色底物而形成蓝色菌落。平板在4℃冷却后，挑取白色单菌落，分别接种于5ml LB液体培养基(含0.1mg/ml氨卞青霉素)中，37℃，250r/min振荡培养过夜。
8、重组质粒的提取 重组质粒提取使用上海华舜生物公司的“小量质粒提取试剂盒”，其提取方法是本领域的技术人员熟知的，在此不作详细描述。
9、重组质粒的双酶切鉴定 通过酶切分析和PCR扩增的方法来确定所得质粒是否带有插入片段。在pGEMT-Tasy载体外源基因插入区域两端各有一EcoRI限制酶的酶切位点 酶切体系Plasmid 4.0μl ddH2O 4.0μl 10×Buffer1.0μl EcoRL 1.0μl 将重组质粒用EcoRI酶切后，在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳，与PCR扩增后回收纯化的片段为对比，找出插入片段大小合适的重组子。
在筛选中选择了七个单菌落，酶切过程中2号与4号克隆在酶切中出现于预期位置相近的条带，酶切鉴定结果如图3，1-6泳道为酶切结果，其中2、4泳道在预测位置有目的条带出现，7为maker DL2000。最后进行DNA测序，得到溪蟹金属硫蛋白基因，结果如下所示， 5`ATGGATGATCCTTGCTGCACAGAAGGAACGTGCGAGTGTGCTGAGGGCAAGTGCAAGTCAGGGTGTAAGTGCTCCTCCTGTCGCTGTTCACCTTGCGAGTAATGCATTTCCGAGTGCTAGTGCAGCAATGCGGAGGAAAGCGCCAAGAACTGCTCGAAGCCTTGCTCCTGCTGCCCC 3`。
实施例2转基因蓝藻的获得 1、引物设计和目的片段的PCR扩增 根据实施例1所得的序列设计引物，上游P1 AAGGATCCGGAGAGCGTCATGCCTGATC CTTGCTGC，引入一个BamHI位点，下游P2CCCCCCGAATTCGGGGCAGCAG，引入一个EcoRI位点。并在ATG前添加上适合于蓝藻表达系统表达的SD序列。
扩增时退火条件采用56℃，退火1min；5个循环后60℃，退火1min，30个循环；经PCR扩增得到特异性片段，琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段为254bp，与理论推测相一致。将纯化后的PCR产物(254bp)，BamHI和EcoRI进行双酶切后，将MT基因插入克隆载体pUC19的多克隆位点上，得到MT基因的重组克隆质粒pUC-MT。
2、穿梭表达载体的构建 将BamHI单切克隆载体pUC-MT得到的3.3kb大小的片段，与BamHI单切pRL-489后得到的9.0kb左右的大片段，分别电泳回收后，连接，构建重组穿梭表达载体。用含有15μg/mL氨苄青霉素和10μg/mL卡那霉素的双抗平板可以得到重组质粒。BamHI单酶切后连接，将导致外源基因从正和反两个方向插入到启动子pPSBA的下游。正连重组中MT位于pPSBA启动子的下游，能有效表达；而反连重组中MT距离启动子较远，使得外源MT基因不能得到表达。利用pPSBA启动子上游和MT基因3’端的EcoRI位点，单酶切筛选正反重组穿梭表达载体。BamHI单切重组载体得到9.0kb左右的大片段和3.3kb大小的小片段，表明MT基因及克隆载体插入到在pRL-489的两个BamHI位点之间。经EcoRI单酶切得到1.0kb的小片段，如图4所示，为重组穿梭表达载体的鉴定图谱。1为pRL-489/BamH I；2为pUC-MT/BamH I；3为λ/HindIII；4为pRL-MT/BamH I；5为pRL-MT/EcoRI；6为pRL-489/EcoRI，表明MT基因插入正向连接的重组穿梭表达载体pPSBA启动子的下游。
3、蓝藻的培养 蓝藻一般培养于液体培养基中，置于光照冷却旋转培养箱中摇振培养，定期更换一次培养液，传代按一定比例接种。
纯化藻种时可采用划线分离和涂布分离的方法。在含有琼脂的固体培养基平板上，取藻种样品稀释不同剃度，涂布或划线，倒置照光培养，待出现单藻落后，光镜下确认藻种，重复划线纯化。固体平板更适于蓝藻藻种的保存。将平板置于弱光下，室温可保存几个月。液体培养物静置于室温弱光下，定期更换培养液。收集蓝藻培养物，加入灭菌甘油，-70℃可长时间保存。从平板上挑取单藻落，接种至含培养液的试管中，待培养物变绿，再逐步扩大培养，也可在大体积的容器中通气培养。
4、用三亲接合转移的方法进行蓝藻的转化 (1)E.coli预处理在含有相应抗生素的LB培养液中，分别接种含有穿梭表达载体的大肠杆菌及含有RP4接合质粒和pRL542辅助质粒的HB101大肠杆菌，37℃下培养，离心收菌，重新悬于LB培养液中，等体积混合两种菌液备用。
(2)蓝藻的准备取对数生长早期蓝藻培养物离心收集细胞，用培养液洗涤两次，再以适当体积的培养液悬浮藻细胞。蓝藻细胞数的粗略计算公式(ElhaiJ等，1988)为蓝藻细胞浓度(cells/ml)＝O.D.665x 4.5x10′C2 (3)接合转移将收集的藻细胞与细菌按一定比例混合均匀，轻轻地将其涂于无抗生素的BG-11固体培养基上的纤维素脂滤膜上(0.45μm)，尽量使滤膜上的混合液均匀。待液体完全渗入培养基中。光照培养数天后，使蓝藻表达抗性。小心地转移滤膜到含有相应抗生素的平板上，继续光照培养，直到出现阳性克隆，表明得到转基因蓝藻。
(4)转基因蓝藻的筛选与纯化将阳性单藻落接种到含有相应抗生素的培养液中，抗生素的浓度由低到高逐渐增加。也可以将整个滤膜投入含抗生素的培养液中，待转基因藻生长稳定后，在平板上划线得单藻落。除去转基因藻中细菌的方法是在培养液中加入蔗糖，离心收集沉淀。
5、转基因蓝藻的分子检测 提取转基因蓝藻的DNA作为模板，通过PCR扩增检测穿梭表达载体在转基因蓝藻中的存在，进行PCR扩增，扩增电泳结果如图5显示，1泳道为对照；2为1.pRL-MT PCR扩增(模板为转pRL-MT载体的鱼腥藻质粒)；3为pRL-489PCR扩增(模板为转化空质粒的鱼腥藻质粒)；4为pRL-489PCR扩增(模板为转化空质粒的大肠杆菌质粒)；5为pRL-MT PCR扩增(模板为转化空质粒的大肠杆菌质粒)；6为maker DL2000，由图上可知在转基因蓝藻中有目的基因即溪蟹金属硫蛋白基因存在。
实施例3包含转基因蓝藻的金属吸附材料的制备方法 将上述得到的转基因蓝藻和甲壳素以体积比3∶1的比例混合，然后再加入浓度为0.75mol/L、相当于转基因蓝藻和甲壳素混合液体积2-4倍的NaOH溶液，在50℃下加热10min，得到细胞泥；然后将1％～3％的海藻酸钠溶液和细胞泥以体积比1∶1混合均匀，用静电液滴法将得到的混合液注入浓度为0.05-0.2mol/L、体积为该混合液体积5倍的CaCl2溶液中，海藻酸钠溶液与氯化钙溶液反应生成海藻酸钙胶球，同时将转基因蓝藻包埋在海藻酸钙胶球中，固定化0.5-1h，然后用生理盐水洗脱，得到含有转基因蓝藻的包埋体，该包埋体即为金属的吸附材料，可直接用于不同领域的金属吸附。
SEQUENCE LISTING
<110>山西九龙湾农林科技开发有限公司
<120>溪蟹金属硫蛋白基因及其转基因蓝藻以及金属吸附材料的制备
<160>1
<210>1
<211>177
<212>DNA
<213>Sinopotamon yangtsekiense
<221>1-177
<400>1
atggatgatc cttgctgcac agaaggaacg tgcgagtgtg ctgagggcaa gtgcaagtca 60
gggtgtaagt gctcctcctg tcgctgttca ccttgcgagt aatgcatttc cgagtgctag 120
tgcagcaatg cggaggaaag cgccaagaac tgctcgaagc cttgctcctg ctgcccc 17权利要求
1、一种溪蟹金属硫蛋白基因，其特征是该基因的核苷酸序列如下
5`ATGGATGATCCTTGCTGCACAGAAGGAACGTGCGAGTGTGCTGAGGGCAAGTGCAAGTCAGGGTGTAAGTGCTCCTCCTGTCGCTGTTCACCTTGCGAGTAATGCATTTCCGAGTGCTAGTGCAGCAATGCGGAGGAAAGCGCCAAGAACTGCTCGAAGCCTTGCTCCTGCTGCCCC 3`。
2、利用如权利要求1所述的溪蟹金属硫蛋白基因获得的转基因蓝藻，其特征是将得到的溪蟹金属硫蛋白基因通过表达载体和穿梭表达载体转入蓝藻中，得到转基因蓝藻。
3、根据权利要求2所述的利用溪蟹金属硫蛋白基因获得的转基因蓝藻，其特征是表达载体优选pUC19，穿梭表达载体优选pRL-489。
4、利用如权利要求2或3所述的转基因蓝藻制备金属吸附材料的方法，其特征是将上述得到的转基因蓝藻和甲壳素以体积比3∶1的比例混合，然后再加入浓度为0.75mol/L、相当于转基因蓝藻和甲壳素混合液体积2-4倍的NaOH溶液，在50℃下加热10min，得到细胞泥；然后将1％～3％的海藻酸钠溶液和细胞泥以体积比1∶1混合均匀，用静电液滴法将得到的混合液注入浓度为0.05-0.2mol/L、体积为该混合液体积5倍的CaCl2溶液中，海藻酸钠溶液与氯化钙溶液反应生成海藻酸钙胶球，同时将转基因蓝藻包埋在海藻酸钙胶球中，固定化0.5-1h，然后用生理盐水洗脱，得到含有转基因蓝藻的包埋体，该包埋体即为金属的吸附材料。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种溪蟹金属硫蛋白基因及其转基因蓝藻以及金属吸附材料的制备，解决现有哺乳类动物MT基因在含有金属的废物处理过程中很难直接用于吸附金属以及结合金属种类比较单一的问题，该基因的核苷酸序列如下5`ATGGATGATCCTTGCTGCACAGAAGGAACGTGCGAGTGTGCTGAGGGCAAGTGCAAGTCAGGGTGTAAGTGCTCCTCCTGTCGCTGTTCACCTTGCGAGTAATGCATTTCCGAGTGCTAGTGCAGCAATGCGGAGGAAAGCGCCAAGAACTGCTCGAAGCCTTGCTCCTGCTGCCCC 3`，本发明具有极大的发展潜力，具有成本低、效益高、不造成二次污染等优点，同时利用基因工程、分子生物学等技术的发展和应用，为生物技术的广泛应用提供了有利条件。整个操作过程在处理污染的同时不仅美化了环境，还可以获得相当的经济效益。
文档编号C12R1/89GK101298614SQ200810054598
公开日2008年11月5日 申请日期2008年3月5日 优先权日2008年3月5日
发明者马小军, 峰 赵, 涛 颜 申请人:山西九龙湾农林科技开发有限公司