抗口蹄疫病毒的单克隆抗体及其识别的抗原表位和应用的制作方法

专利名称：：抗口蹄疫病毒的单克隆抗体及其识别的抗原表位和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及单克隆抗体，尤其涉及抗亚洲1型FMDV的中和性单克隆抗体和抗O型FMDV的中和性单克隆抗体，本发明还涉及上述单克隆抗体所识别的中和表位，本发明进一步涉及所述的单克隆抗体和中和表位在预防口蹄疫中的应用，属于口蹄疫的防治领域。
背景技术：
：口蹄疫病毒(Footandmouthdiseasevirus,FMDV)属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属的成员，为单股正链RNA，其基因组RNA全长约8.5kb。口蹄疫是严重危害偶蹄动物的重要传染病之一，该病引起幼畜死亡、产奶量下降、肉食减少、肉品下降、动物的生产性能降低，导致巨大的经济损失。此外，由于贸易的限制和禁止而引起的损失更大，全世界每年由此造成的直接经济损失可达数百亿美元。2005年以来在我国江苏、山东、甘肃、北京、河北等地爆发了Asial型FMD(Asial/JS/CHA/05，GenBank登录号EF149009)，由于在我国江苏省首先分离，被称作Asial型江苏谱系。该谱系口蹄疫病毒在我国牛群中一经流行，传播趋势迅猛，造成的损失极为严重。本世纪初O型口蹄疫病毒泛亚谱系在中国(0/Tibet/CHA/99，GenBank登录号AJ539138)及周边国家甚至欧洲(MasonPWetal.JGenVirol.2003，84(Pt6):1583-93)均有流行，给许多国家造成巨大损失。因此，积极开展Asial型和0型口蹄疫(FMD)的研究，对我国FMD的防控具有重要的意义。口蹄疫病毒的抗原结构十分复杂，不同血清型、基因型和分离株的口蹄疫病毒其抗原表位和抗原位点都不尽相同，存在广泛的抗原变异。利用单抗逃逸突变株序列分析和交叉中和试验，已鉴定了一些不同血清型FMDV的抗原位点，相关的研究主要来自0、A、C和Asial型FMDV。中和性抗体在保护易感动物抵抗口蹄疫病毒感染过程中起主导作用，诱导机体产生中和性抗体的抗原位点主要位于各个血清型FMDV的VP1上，VP1的G-H环是病毒最重要的中和性抗原位点所在，该环中既存在线性表位，又存在构象型表位。在O型FMDV的VP1蛋白中，G-H环133-157aa和C_末端200_213aa的线性表位组成重要的抗原位点1。Saiz等报道，FMDVA5亚型有2个中和性抗原位点，一个是线性表位，位于VP1的C_末端，关键残基在198aa，另一个位于VP2的B_C环上，由2个表位组成，包括72aa和79aa。SantinaGraziolideng用大量单抗进一步确定，Asial型FMDV存在4个中和性抗原位点位点1位于VP1的142aa，与0型VP1的144aa相对应，在保守的RGD基序侧翼；位点2位于VP2的B-C环区，包括67、72、74、77和79aa等多位残基，而且与VP1的49aa和207aa相关联；位点4位于VP3的B-B结节上，关键残基为58aa和59aa，该位点与位点2相关联；位点5位于VP3的C-末端，作为一个新发现的独立位点被首次提出，218aa为关键性残基。国外这些研究是用单克隆抗体压力筛选或用合成肽扫描技术，只能确定表位相关氨基酸或肽段，不能精确确定表位的性质和位置。我国已有Asial型和0型FMDV中和活性单克隆抗体的文章发表，然而尚未见到中和表位的研究报道，因此，这些已发表中和性单克隆抗体的功能性和价值尚不清楚。
发明内容本发明目的之一是提供一株能分泌抗亚洲1型FMDV的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞系；本发明目的之二是提供一株能分泌抗0型FMDV的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞系；本发明目的之三是分别提供由上述中和性单克隆抗体所识别的亚洲1型FMDV中和表位氨基酸序列和0型FMDV中和表位氨基酸序列；本发明目的之四是将上述单克隆抗体或中和表位用于诊断或预防口蹄疫。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的—株能分泌抗亚洲1型FMDV的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其微生物保藏号是CGMCCNo.2692;保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期2008年10月08日；由该杂交瘤细胞系所分泌的抗亚洲1型FMD的中和性单克隆抗体，分类命名为3E11;—株能分泌抗0型FMDV的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其微生物保藏号是CGMCCNo.2691;保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期2008年10月08日；由该杂交瘤细胞系所分泌的抗0型FMDV的中和性单克隆抗体，分类命名为8E8;由单克隆抗体3E11所识别的亚洲1型FMDV构象型中和表位，该构象表位的关键性氨基酸残基是由亚洲1型丽的VP1蛋白上Ser140或Ser141、Gly144、Leu146和Leu149组成；进一步优选的，所述构象表位的模拟表位的氨基酸序列为GSLXXL(SEQIDNO:l)，其中，X选自任意一种氨基酸残基；由单克隆抗体8E8所识别的0型FMDV的VP1蛋白中的一段线性中和表位序列，其氨基酸序列为GDLNVRT(SEQIDNO:2)或者为其衍生序列；其中，所述的衍生序列是对GDLNVRT中的一个或多个氨基酸进行缺失和/或替换后所得到的任意一种的氨基酸序列，其中所述的缺失是将G缺失；所述的替换选自以下6种中的任意一种或一种以上进行的组合(1)G用W替换；(2)L用A替换；(3)N用Q、A或W替换；(4)V用I或T替换；(5)R用L、K或A替换；(6)T用A替换；经试验证实，上述的经过缺失和/或替换后所得到的衍生序列与GDLVRT均具有相同的性能与用途。本发明技术方案的详细描述本发明用纯化的全病毒免疫BALB/c鼠制备抗Asial型FMDV江苏谱系Asial/YS/CHA/05株、0型FMDV泛亚谱系O/YS/CHA/05株的单克隆抗体，各获得一株具有强中和活性的单克隆抗体3E11和8E8。间接免疫荧光和Westernblot检测表明，3E11识别Asial型FMDV—个构象型优势中和表位，该单抗与一个亲本变异株(144位由G突变为S)无反应，由此推断VP1蛋白上144位Gly是单抗3E11识别表位的关键性氨基酸；8E8识别0型FMDV一个广谱的线性中和表位。本发明进一步利用噬菌体展示随机12肽库筛选上述两个单抗识别的模拟表位，发现一个表位基序GSLXXL(X代表20种氨基酸残基任意一种)与单抗3E11具有结合活性，而单抗8E8的模拟表位基序为GDLNVRT。鉴于两个单抗的特性，用合成肽对单抗3E11识别的模拟表位基序的4个保守性氨基酸残基进行定点突变分析确定，这些氨基酸均为关键性氨基酸；同时合成Asial/YS/CHA/05株VP1蛋白G-H环的136153aa序列，该十八肽包含GSLXXL基序所有4个关键性氨基酸，肽ELISA检测显示与单抗3E11同样具有结合活性，从而确定该构象表位的关键性氨基酸残基是由VP1蛋白上Ser140或Ser141、Gly144、Leu146和Leu149组成。单抗8E8模拟表位基序与0/YS/CHA/05株VP1蛋白的146152位氨基酸序列存在高度同源，因而将146GDLQVLT152序列及其截短肽序列与GST融合表达并进行Westernblot分析，确定147DLQVLT152是0型FMDVVP1上的一个线性B细胞表位；针对病毒VP1真实序列中146152aa肽(P-8E8)合成一系列定点诱变肽并进行竞争ELISA分析，结果显示，氨基酸残基D对于该表位活性最为关键，残基V、L148、L151、Q和T对于表位活性起重要作用，而且残基T不可缺失。鉴于上述两个单抗在体外具有很高的中和滴度，本发明进而用乳鼠保护试验在体内验证上述两个单克隆抗体对FMDV感染的免疫保护作用。试验结果表明，针对Asial型和0型FMDV的单克隆抗体3E11和8E8腹水的半数保护量(PD5。)分别为1995和2371;仅用8PD5。单抗3E11和11PD5。单抗8E8，就可完全保护乳鼠耐受致死剂量Asial型和0型FMDV的攻击。被动免疫的乳鼠在攻毒后体重增长的百分率随单抗浓度的升高而升高，而且随着单抗浓度的升高，乳鼠的起始死亡时刻后延、终点死亡时刻前移。通过体外中和试验和体内动物被动免疫保护保护试验说明，本发明的3E11单抗和8E8单抗具有良好的被动免疫效果，这两株单抗均能应用于口蹄疫的紧急预防，可以对口蹄疫的被动免疫起到良好的免疫效果；用这两个单抗所识别的FMDV血清型的保护性抗原表位可以进一步研究或开发出口蹄疫二价表位疫苗，对于口蹄疫的免疫预防将具有重要的意义。图1ELISA方法筛选单抗3E11特异性亲和的噬菌体；用相同蚀斑数的各噬菌体克隆加入用单抗3E11包被的微孔板中，并设同种抗体亚型的单抗4C6、含BSA的封闭液和原始月太库(PhageLibrary,PL)作为对照。图2合成肽P-S7及其突变肽与单抗3E11结合活性的检测；包被链酶亲和素，分别加入系列稀释的生物素化短肽P-S7和随机打乱肽P-S7-SCR，与3E11结合反应后，加入HRP标记的羊抗鼠二抗，显色并测定吸光值。图3合成肽P-S7及其突变肽与单抗3E11结合活性的检测；用合成肽P_S7竞争抑制单抗3E11与病毒抗原的结合包被lug病毒抗原，加入合成肽与单抗3E11预混液，最后加入羊抗鼠酶标二抗。图4合成肽P-S7及其突变肽与单抗3E11结合活性的检测；合成肽定点突变试验鉴定P-S7肽与单抗3E11相互作用的关键性氨基酸，以单抗3E11与未突变短肽P-S7反应的0D4。5值为100%，计算其它短肽的结合率。图5合成的18-aaG_H环十八肽与单抗3E11的结合活性；包被链酶亲和素，加入系列稀释的生物素化短肽AsialpG-H，与单抗3E11反应，加入HRP标记的羊抗鼠二抗，显色后测定0D,吸光值。图6ELISA方法筛选单抗8E8亲和的噬菌体；以相同蚀斑数的各噬菌体克隆加入包5被有单抗8E8的微孔板中，设同种抗体亚型的单抗5F7、含1%BSA封闭液以及噬菌体肽库(PhageLibrary,PL)作为对照。图7阳性噬菌体克隆的Westernblot分析。图8表位及其截短肽GST融合蛋白的SDS-PAGE(a)和Westernblot分析(b)。图9合成肽的竞争ELISA实验；用合成的突变肽竞争抑制单抗8E8与病毒结合。图10合成肽的竞争ELISA实验；肽浓度为lug/100ul，以P-8E8的抑制率为100%，计算各合成突变肽的相对抑制率。图11合成肽的竞争ELISA实验；用合成的突变肽竞争抑制单抗8E8与病毒结合。图12合成肽的竞争ELISA实验；肽浓度为lug/100ul，以P-8E8的抑制率为100%，计算各合成突变肽的相对抑制率。图13单抗3E11浓度与乳鼠存活率的关系；乳鼠经10LD5。Asial/YS/CHA/05攻击后，不同浓度的单抗3E11(即不同中和抗体半数保护量)导致乳鼠存活率的差异。图14单抗8E8浓度与乳鼠存活率的关系；乳鼠经10LD5。0/YS/CHA/05攻击后，不同浓度的单抗8E8(即不同中和抗体半数保护量)导致乳鼠存活率的差异。图15单抗3E11浓度与乳鼠存活时间的关系；乳鼠经10LDs。Asial/YS/CHA/05攻击后，不同浓度的单抗3E11导致乳鼠死亡时间的差异。图16单抗8E8浓度与乳鼠存活时间的关系；乳鼠经10LD5。0/YS/CHA/05攻击后，不同浓度的单抗8E8导致乳鼠死亡时间的差异。图17单抗3E11浓度与乳鼠体重增长百分率关系；乳鼠经10LD5。Asial/YS/CHA/05攻击后不同浓度的单抗3E11导致乳鼠体重增长百分率的的差异。图18单抗8E8浓度与乳鼠体重增长百分率关系；乳鼠经10LD5。0/YS/CHA/05攻击后不同浓度的单抗8E8导致乳鼠体重增长百分率的差异。具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。—、材料和方法1.病毒、细胞、菌株和实验动物口蹄疫病毒株Asial/YS/CHA/05属于Asial型FMDV江苏谱系，口蹄疫病毒0/YS/CHA/05株属于0型泛亚谱系；乳仓鼠肾细胞BHK-21、SP2/0骨髓瘤细胞为本实验室保存；质粒pGEX-6p-l和受体菌BL21由本实验室保存；清洁级雌性BALB/c小鼠、SPF级BALB/c乳鼠购于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。2.主要试剂融合剂PEG/DMS0(Mw，1450)、HAT盐(50x)、HT盐(50x)、HRP或FITC标记的羊抗鼠lgG、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；单克隆抗体亚类鉴定试剂盒购自SouthernBiotech公司；L-谷氨酰胺(glutamine)、甘氨酸购自Amresco公司；二甲基亚砜(DMSO)、邻苯二胺(OPD)、PEG6000购自Solarbio公司;Ph.D._12"1肽库试剂盒购自NewEnglandBiolabs公司；HRP标记抗的M13噬菌体抗体购自于GEHealthcare公司；限制性内切酶BamHI、XhoI、Pstl购自TaKaRa公司；T4DNA连接酶购自NewEnglandBiolabs公司；高糖DMEM干粉购自GIBC0公司；进口优级胎牛血清(PAA)购自西班牙Nalgene公司；96孔细胞培养板购自加拿大JETBiochemical公司。3.鼠免疫与单克隆抗体的制备(1)将Asial型、0型FMDV细胞适应毒接种于长满单层的BHK-21细胞，待75%以上细胞出现病变后收毒。将收获的细胞培养液反复冻融三次，初步裂解细胞，释放病毒。冻融后的病毒液以l:1000加入TritonX-100和4:10000加入甲醛裂解与灭活48h以上，取灭活过的病毒液lmL上BHK-21细胞盲传三代，检测是否灭活彻底。将经冻融裂解后的培养液作9000rpm(Beckman高速离心机，JA-10转子)、4。C离心90min，回收病毒液上清，弃去细胞沉淀。按病毒液上清的体积加入80g/L的PEG6000和40g/L的NaCl，室温搅拌2h至完全溶解，4。C过夜沉淀。次日将上清9000rpm、4。C离心90min，弃上清，回收沉淀。用NET缓冲液于低温下将沉淀轻轻重悬。将重悬的上清29000rpm、4t:离心2h，回收沉淀，于低温下用适量的NET缓冲液轻轻重悬沉淀，充分混匀后分装，_701:冻存备用。将提纯抗原用NET缓冲液进行10倍、100倍、1000倍稀释，用分光光度计测量蛋白质的浓度。(2)用纯化的Asial型、0型FMDV抗原200iig/200uL加等体积弗氏完全佐剂，充分乳化后经背部皮下注射6周龄雌性BALB/c小鼠；2周后进行第2次免疫，佐剂为弗氏不完全佐剂；间隔2周后，以不加佐剂的等量抗原进行第3次免疫。为剌激小鼠快速产生强烈免疫反应，于融合前3d采用尾静脉和脾脏注射相结合的免疫方式进行加强免疫，注射二倍量抗原。(3)细胞融合a)饲养层细胞的制备细胞融合前一天进行饲养层细胞的制备，眼科剪刀、眼科镊子、平皿等试验用具用前高温干热灭菌，HAT完全培养液做无菌检验。取2只BALB/c小鼠摘除眼球放血，按常规方法分离阴性血清。拉颈脱臼处死小鼠，将其浸泡于75%酒精中，10min后移入超净工作台。将小鼠腹部向上固定在鼠架上，用镊子提起腹正中部皮肤，眼科剪刀横向剪一小口，切勿剪破腹膜，用剪刀和镊子上下撕开皮肤，充分暴露腹膜。用镊子轻轻提起腹膜，将10mL注射器内吸取的8-10mLHAT完全培养液注入腹腔，切勿剌破脏器和肠道，注射器不要拔出，在腹腔内来回抽吸5-10次，然后用镊子按摩两侧腹部30秒左右，再进行抽吸，重复以上操作2-3次。用注射器回吸腹腔内液体。注意避开肠系膜及脂肪组织，以免堵塞针头。将从2只鼠中取出的腹腔细胞加入55mLHAT培养液中，吹散混匀细胞，分装于6块96孔培养板，100iiL/孔。置于37°C、5%C02培养箱中培养。b)骨髓瘤细胞的制备融合前36-48h，将骨髓瘤细胞扩大培养，使细胞处于对数生长期。融合当天，用15mLDMEM基础培养液将细胞从瓶壁上吹下，收集于50mL离心管中。1000rpm离心10min。将细胞沉淀重悬置20mLDMEM基础培养液中，混匀。取少量骨髓瘤细胞悬液，台盼兰染色计数，备用。c)免疫脾细胞的制备融合前摘除小鼠眼球采血，制备阳性血清。将小鼠拉颈脱臼致死，浸泡于75X酒精中，10min后放于超净台。无菌打开腹腔，分离结缔组织并取出脾脏，将脾脏放入装有灭菌尼龙网和盛有15mLDMEM基础培养液的平皿中，用灭菌玻璃注射器内芯研磨脾脏，使脾细胞全部通过网孔进入平皿中。将脾细胞溶液转入50mL离心管中，加DMEM基础培养液大约至30mL，混匀。lOOOrpm离心8min，弃上清。将细胞沉淀悬于10mLDMEM基础培养液中，混匀。取细胞悬液，台盼兰染色计数，备用。d)脾细胞与骨髓瘤细胞融合取65mLHAT培养液，15mL基础DMEM培养液和lmL50%PEG于37。C水浴中预热，另备盛有37。C水的200mL烧杯。按5份脾细胞数加1份骨髓瘤细胞数取相应细胞悬液量，加入50mL玻璃离心管中，补加DMEM基础培养液至30mL，混匀。1000rpm离心10min，弃上清，尽可能倒干。用手掌轻击离心管底部，使沉淀细胞松散均匀呈糊状。将离心管放入盛有37t:水的200mL烧杯中，一手均匀转动离心管，另一手用lmL巴氏吸管吸取37°C50%PEG溶液lmL，lmin内加完，静置2min。随后先慢后快地加入DMEM基础培养液终止反应，37t:水浴静置10min。1000rpm离心10min，弃上清，加入65mLHAT培养基，轻轻地吹散细胞，每孔0.lmL接种于已培养有饲养细胞的6块96孔培养板，置37°C、5%的C02培养箱中培养。5d后半量换液，8d后全换液，待克隆长至孔底面积1/4-1/3时取上清进行检测并换HT培养液。4.抗体检测ELISA用提纯的病毒抗原包被于微孔板中，加入100uL杂交瘤细胞培养上清，37t:温育lh后洗涤，加入l:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，洗涤后加入底物0PD避光显色10min，于波长492nm测定吸光值。5.间接免疫荧光微孔板培养BHK-21细胞至单层，接种口蹄疫病毒4X103TCID5。/well，出现CPE之前用冷无水乙醇进行固定，加入50uL杂交瘤细胞培养上清，37t:温育40min后PBS洗涤三次，加入l:200稀释的荧光素标记羊抗鼠IgG抗体，37t:温育40min，洗涤后在倒置荧光显微镜下观察，以+号数目记录荧光强度。6.微量细胞中和试验(1)病毒毒价的测定将病毒接种于单层细胞，37t:吸附lh后加入维持液，置温箱培养；逐日观察，待细胞病变(CPE)达75%以上，收获病毒悬液冻融3次，以3000r/min离心10min，取上清液，定量分装成lml小瓶置_701:保存备用，选用的病毒必须是对细胞有较稳定的致病力。取自_701:冰箱保存的病毒一瓶，将病毒在96孔培养板上作IO倍递进稀释即10—、10—2，10—11……，每孔病毒悬液量为50iU，每个稀释度作8孔，每孔加入100细胞悬液，每块板的最后一行设8孔细胞对照，制备细胞悬液的浓度以使细胞在24h内长满单层为度。把培养板置5%C02温箱37t:培养，从48-72h逐日观察细胞病变，记录结果。按Reed和Muench两氏法计算TCID5。。表1TCID50计算(接种剂量50ii1)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>距离比例=-56%-33%IgTCID5。=高于50%病毒稀释度的对数-距离比例X稀释系数的对数高于50%病毒稀释度的对数为_6，距离比例为0.26，稀释系数的对数为_1。IgTCID50=-6+0.26X(—1)=-6.3则TCID5。=10—63，50即病毒作10—6'3稀释，每孔接种50iU，可使半数组织细胞管发生病变。(2)中和试验动物腹水中，含有多种蛋白质成分对抗体中和病毒有辅助作用，如补体、免疫球蛋白和抗补体抗体等。为排除这些不耐热的非特异性反应因素，用于中和试验的血清或腹水须经加热56°C、30min灭活处理。取已灭活处理的单抗腹水，在96孔微量细胞培养板上，用不含血清的匿EM作一系列倍比稀释，使其稀释度分别为原腹水的1:4、1:8、1:16、1:32、1:64等等，每孔含量为50iU，每个稀释度作4孔。取-7(TC冰箱保存的病毒液，将原始毒价稀释至200TCID5。，50ul(与等量腹水混合，其毒价为100TCID5。)。如病毒价为10—63，50iU。所以应将病毒作2X10—43稀释。每孔加入50iU病毒液，封好盖，置于37t:温箱中和lh。在制备细胞悬液时，其浓度以在24h内长满单层为度血清与病毒中和lh后取出，每孔加入100iil细胞悬液。置5%0)237°〇温箱培养，自培养48h开始逐日观察记录，120h终判。为保证试验结果的准确性，每次试验都必须设置下列对照。阳性和阴性(sp2/0)腹水与待检腹水进行平行试验，阳性腹水对照应不出现细胞病变，而阴性腹水对照应出现细胞病变。每次试验每一块板上都设立病毒对照，先将病毒作0.1、1、10、100、1000TCID5。稀释，每个稀释度作4孔，每孔加50ii1。然后每孔lOOiU细胞悬液。0.1TCIDTCIDs。应不引起细胞病变，而且100TCID5。必须引起细胞病变，否则该试验不能成立。为检查被检腹水本身对细胞有无任何毒性作用，设立被检腹水毒性对照是必要的。即在组织细胞中加入低倍稀释的待检腹水(相当于中和试验中被检腹水的最低稀释度)。正常细胞对照即不接种病毒和待检腹水的细胞悬液L。正常细胞对照应在整个中和试验中一直保持良好的形态和生活特征，为避免培养板本身引起试验误差，应在每块板上都设立这一对照。当病毒回归试验，阳性、阴性、正常细胞对照相，腹水毒性对照全部成立时，才能进行判定，被检腹水孔出现100XCPE判为阴性，50X以上细胞出现保护者为阳性；固定病毒稀释腹水中和试验的结果计算，是计算出能保护50%细胞孔不产生细胞病变的腹水稀释度，该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。用Reed和Muench两氏法(或Karber法)计算结果。表2固定病毒_稀释血清法中和抗体效价计算<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>[OO73]用Reed和Muench两氏法(或Karber法)计算结果80%—50%距离比例=-=0.580%—20%IgPD5。=高于50%血清稀释度的对数-距离比例X稀释系数的对数IgPD50=-1.5—0.5X(—0.3)=_1.35则PD50=10—136，50ii1因10—135=1/22，S卩1:22的血清可保护50%细胞不产生病变，1:22就是该份血清的中和抗体效价。7.生物淘洗将腹水先经辛酸-硫酸铵法粗提，然后用NAbProteinGSpinPurificationKit(PIERCE)进行亲和层析纯化，经SDS-PAGE鉴定纯度后用于生物淘洗，用M13噬菌体展示随机线性十二肽库对单抗进行表位作图。生物淘洗参照试剂盒说明书进行第1轮淘洗于微孔板中包被10ug单抗，第2、3轮分别包被5ug、lug，4t:过夜；0.05%TBST洗涤后，用10g/LBSA封闭，加入1.5X1011pfu/100uL展示十二肽的M13噬菌体，室温轻摇lh，TBST洗涤10次后，用洗脱缓冲液将结合的噬菌体于室温轻摇10min洗脱下来，加入缓冲液中和洗脱的噬菌体，接种大肠杆菌ER2738进行扩增。对扩增后的噬菌体进行回收并测定滴度，取1.5X10"pfu噬菌体进入下一轮淘洗。第4轮淘洗采用ProteinG捕获法进行液相结合，单抗使用量为300ng。挑取单个噬菌体克隆进行扩增，用噬菌体亲和捕获ELISA鉴定其活性，最后对阳性噬菌体的单链DNA进行序列分析。8.噬菌体亲和捕获ELISA于96孔聚乙烯酶标板中包被100ng单抗(每孔100uL，0.1M碳酸氢钠pH8.6)，4°C过夜，设立重复孔，同时设立识别不同表位的来源于同一只小鼠制备的单克隆抗体，1%BSA封闭液为对照。室温封闭2h后，用0.1%TBST稀释噬菌体克隆至10fu/100uL，加入每孔，室温轻摇反应lh，用O.1XTBST洗六次后，加入1:5000稀释的HRP标记的鼠抗M13噬菌体抗体，用底物ABTS[2，2，-azinobis(3-ethylbenzthiazolinesulfonicacid)]显色后于405nm测吸光度，以P/N>2.1作为待检样品的阳性结果判定标准。9.噬菌体单链DNA模板的制备与测序在第3、4轮淘洗后，随机挑选噬菌体克隆，分别接种到含lmL1:100稀释的ER2738对数中期培养物，于37。C震荡培养4.5h。12000rpm离心10min，各取500uL上清到新管中，每管加入200uLPEG/NaCl，混匀后，静置10min，12000rpm离心10min，沉淀溶于100uL碘化钠缓冲液中，再加入250uL无水乙醇，室温静置10min，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤，自然干燥后，用30uL纯水溶解，即可作为测序模板。测序由上海生物工程有限公司完成，测序引物为-96glII，序列为5'-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3'。10.肽ELISA各种多肽由北京中科亚光有限公司合成，经HPLC和MS分析鉴定，纯度^95X。肽的生物素化采用PIERCE公司的生物素化试剂盒进行。包被250ng链酶亲和素的孔中分别加入200ng、100ng、50ng、25ng、12.5ng、6.25ng、3.125ng、l.56ng的生物素化肽，封闭后加入3Ell单抗100ng/100ul/孔，室温轻摇反应lh，0.05XTBST洗四次后加入1:5000稀释的HRP标记羊抗鼠二抗(SIGMA)，用底物ABTS显色后于405nm测吸光度。11.肽竞争抑制ELISA酶标板中包被病毒抗原lug/well，预先使系列稀释的合成肽与单抗在封阻液中混合，37t:lh后4t:过夜，再加入各孔，37t:温育20min，洗涤后加入羊抗鼠酶标二抗，用底物ABTS显色后于405nm测吸光度。12.表位肽的GST融合表达人工合成编码表位和截短表位DNA的两条互补寡核苷酸链，上游引入BamHI粘性延伸末端，下游引入终止密码子以及Xhol粘性延伸末端，根据大肠杆菌密码子偏好对该表位基因进行密码子优化，序列见表3:表3表位及其截短突变体编码DNA的互补寡核苷酸链<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(方框部分为引入的BamHI粘性末端，下划线为引入的Xhol粘性末端)。将两条互补链直接退火形成带粘性末端的双链DNA，插入pGEX-6p-l的BamHI和XhoI之间，转化BL21感受态细胞，用Pstl酶切鉴定重组质粒，分别命名(表l)。挑取单个阳性菌落过夜培养并测序验证，然后1:100稀释接种于新鲜的液体LB培养基中，37t:震荡培养至0D6。Qnm=0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度为lmmol/L，37。C继续培养5h，收集菌体并用适量的PBS重悬，融合蛋白分别命名为GST-p7、GST-p7-lossG、GST-p7-lossT、GST-p7-lossLT和GST-p7-lossVLT。13.SDS-PAGE电泳和Westernblot检测SDS-PAGE电泳(15%Tris-glycine)分离GST-p7、GST-p7-lossG、GST-p7-lossT、GST-p7-lossLT和GST-p7-lossVLT融合蛋白，转印至硝酸纤维素滤膜上(90V，45min)，用5%脱脂乳-PBS封闭液于4t:封闭过夜，与单抗8E8于37t:温育lh，与HRP标记的羊抗鼠IgG于室温作用lh，DAB(6mg/10mL)显色。14.FMDVLD50检测4日龄乳鼠5-7窝，每窝4-6只，母鼠1只用于哺乳。用灭菌的PBS将Asial型和0型FMDV分别10倍梯度稀释成10—\10—2、10—3……，每个稀释度的FMDV于颈背部皮下注射乳鼠一窝，200u1/只，同时设PBS对照组。每天观察，记录乳鼠发病和死亡情况，按Reed-Muench方法计算口蹄疫病毒的毒力。表4WOO]LD5。的计算(接种剂量为0.2ml)病毒稀接种活鼠数死鼠数积累总计死亡比死亡率释度鼠数活鼠死亡(%)10"450501515/15100l(T550501010/1010010-6514155/68310-7541511/61710-85501000/100IO-95501500/150LD5。的计算按Reed和Muench氏法计算。高于50%的死亡分数-50%83%-50%距离比例=-=-=0.5高于50%的死亡百分数-低于50%的死亡百分数83%_17%LD5。的对数=高于50%病毒稀释度的对数+距离比例X稀释系数的对数本例高于50%病毒稀释度的对数_6，距离比例为0.5，称释系数的对数为-1。代入上式LgLD50=-6+0.5X(-1)=-6.5则LD5。=10—65，0.2ml，即该病毒作10—"稀释，接种0.2ml能使半数乳鼠发生死亡。15.乳鼠免疫保护试验Asial型、0型单抗的被动保护试验分别用5-8窝乳鼠，每窝含乳鼠4_6只，母鼠1只用作哺乳。3E11、8E8单抗腹水用灭菌PBS分别做2倍梯度稀释，每个稀释度腹腔注射乳鼠4-6只，200ul/只。间隔1小时后每组乳鼠分别在颈背部皮下注射致死剂量(10LD5。)的Asial型和0型FMDV(200u1/只)，同时设立单抗对照和PBS对照。注射后每天观察乳鼠的发病、死亡情况。[cmo]二、试验结果(—)3E11单克隆抗体的制备及其识别表位的鉴定1.—株针对Asial型FMDV构象型中和表位单克隆抗体的筛选和鉴定免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合的杂交瘤细胞培养上清，用间接ELISA检测和IFA验证，阳性判定标准为，以杂交瘤培养上清对FMDV抗原的0D492光吸收值与正常BALB/c小鼠血清、SP2/0细胞上清对FMDV抗原0D492值之比均大于2.1，且杂交瘤细胞上清对正常BHK-21细胞的免疫荧光结果为阴性，判为阳性杂交瘤细胞。经筛选和三次有限稀释法克隆，获得3株阳性杂交瘤细胞，分别命名为1F5、3E11和4C6。用杂交瘤上清鉴定3株杂交瘤细胞分泌抗体的免疫球蛋白亚类，结果显示，1F5重链类型为IgG2b，3E11和4C6重链类型为IgGl，3株单抗轻链均为k类型(表5)。与Asial/YS/CHA/05病毒株的中和试验显示单抗1F5和4C6都未能达到1:32的稀释比，判定为无中和活性；而3E11具有很强的中和活性，中和效价达到l:1024(表5)。我们对各株单抗进行了全病毒Westernblot分析，均未见特异性反应条带，因此认为，所获得的3株单抗均识别构象型表位。在研究中发现一个病毒抗原变异株，其VP1蛋白在144位由G突变为S，基因组其它序列与亲本株完全相同，此单一氨基酸残基的突变却导致单抗3E11与突变株失去反应性(IFA和微量细胞中和试验均验证)，由此推断，VP1蛋白144位氨基酸G是单抗3E11识别表位的一个关键性氨基酸。单抗3E11与Asial型FMDV江苏谱系毒株均产生特异性荧光，而且中和滴度都很高，说明该表位是Asial型FMDV保守的中和表位。表5.抗Asial型口蹄疫病毒单克降抗体生物学特性鉴定单抗抗体亚类间接免疫荧光试验中和试验Westernblot1F5IgG2b/K++++1:16-3E11IgGl/K++++1:1024—4C6IgGl/K++++1:4-2.单抗3E11识别的模拟表位基序为GSLXXL为鉴定单抗3E11识别的构象表位，本发明人利用一个展示随机线性十二肽的噬菌体文库对纯化的单抗3E11进行4轮生物淘洗，在第3、4轮共挑取42个噬菌体克隆进行扩增，用噬菌体亲和捕获ELISA鉴定其反应活性，设立同一只鼠制备的同种抗体亚型的单抗4C6和封闭液BSA作为对照，以排除抗体恒定区以及BSA的干扰，最终获得8个针对抗体可变区的阳性噬菌体克隆(图1)，其中噬菌体克隆S7、S12、S2、Sl和S6具有较高的亲和力。对这些阳性噬菌体克隆的单链DNA进行序列分析，获得8条不同的12肽序列(表6)。序列比对显示，亲和力较高的前4个噬菌体克隆均含有一个特征性序列GSLXXL(X代表20种氨基酸残基任意一种)，将其暂定为单抗3E11识别的构象型中和表位的基序。在该基序结构13中有两个亮氨酸(L)，它们之间的固定间隔为两个氨基酸残基，对其形成表位空间结构可能起关键性的骨架支撑作用，虽然间隔氨基酸的种类尚无规律可循。将各噬菌体阳性克隆与3E11单抗进行Westernblot分析，均不呈现反应条带，该结果结合噬菌体ELISA检测结果表明，这4个展示在噬菌体表面的线性12肽在非变性的液相中能够模拟形成单抗3E11所识别的构象型表位，而在变性的线性状态下则不能被识别。在阳性噬菌体克隆S6，其3E11单抗识别表位基序中的第一个亮氨酸(L)被异亮氨酸(I)取代，虽然两者均为性质相近的疏水性脂肪族氨基酸、在侧链上仅有一个甲基位置不同，然而这样的替换还是使得该肽与3E11的结合能力有所下降(图l)。在另外3个阳性噬菌体克隆(S11、S18和S10)，没有发现上述3E11识别的表位基序，也没有找到明显一致的序列，它们与单抗3E11结合的因素尚不清楚。上述研究表明，单抗3E11所识别的模拟表位是含有基序GSLXXL的短肽。为进一步鉴定GSLxxL基序的结合性和功能性，选取亲和力最高的S7噬菌体展示肽序列合成一系列突变肽并进行结合活性分析。在肽ELISA试验中，单抗3E11与链酶亲和素捕获的生物素化肽P-S7呈现剂量依赖性结合，而氨基酸打乱的生物素化肽(P-S7-SCR)无结合活性(图2)，这表明模拟肽S7与单抗3E11的结合是序列特异的；在竞争ELISA试验中，结合P-S7肽的单抗不再与抗原结合，而且这种抑制作用表现为剂量依赖方式，而打乱的P-S7-SCR肽不具有这种抑制活性(图3)，这从免疫学角度证明了模拟肽S7与3E11结合的特异性；为确定3E11表位基序中每个保守氨基酸残基对于表位活性的作用，用合成的突变肽进行ELISA分析(图4)，结果表明，在此模拟表位基序的4个保守氨基酸残基对于该表位的抗原抗体识别均是关键性的，其中任何替换都会使P-S7肽失去与单抗3E11的结合活性。上述结果推测，在单抗3E11存在的情况下，这些线性肽段在溶液中可形成一定的构型，使关键性氨基酸残基在合适的空间位置与识别构象型表位的单抗3E11发生相互作用；构象型表位基序GSLXXL每个关键性氨基酸的改变都使得该肽段不能形成相应构型，从而失去结合活性；该表位基序两个亮氨酸之间的2个氨基酸残基的种类和性质虽然可以变更，但其间距不变，说明这两个亮氨酸残基的空间结构对于线性肽的构象表位形成是非常重要的。表6.阳性噬菌体模拟表位肽的序列测定噬菌体克隆氨基酸序列a频率S7HEIGSLAGLAMRS12AHFNGSLRSLTQS2IINTGSLLSLAHSlDTGSLVWLSqRSS6bHNHGSISALMHLSllDHDRLIRRTAqi1S18FHTLDNNIRNVN1S10FHDTSLLSHHLA114a基序氨基酸残基用加粗和下划线标出。b阳性噬菌体克隆S6与其它基序的不同是I取代了L，这两种氨基酸之间的侧链相似，在某些情况下可替换。表7.用于定点诱变研究的合成肽序列多肽名称多肽序列eP-S7.........................H-E-I-G-S-L-A-G-L-A隱M-RP-S7-G-Sa..................H-E-I陽g-S-L-A-G-L陽A隱M-RP陽S7-S-A...................H-E-I-G-A-L-A-G-L-A-M陽RP-S7-1L-A..................H-E-I-G-S陽A-A-G-L陽A-M-RP陽S7-2L-A..................H-E-I-G-S-L-A-G-A-A-M-RP-S7-SCR...................L-A-G-M-I-A-S-E-R-L隱H-GAsialpG-Hb................Y-G-E隱E-S-S-R-R-G-D-L-A隱A-L-A-R隱R-Va根据RGD突变株的变异而设计的G—S替换，其它基序氨基酸分别用丙氨酸(A)替换。bAsial/YS/CHA/05株VP1蛋白G-H环中的18-aa肽(136153aa)，包含3E11模拟表位所有的关键性氨基酸残基。e合成肽突变位点氨基酸均加粗并加下划线标出，经过HPLC和MS分析验证，纯度均>95%。3.G-H环合成肽及其结构模拟确定单抗3E11的识别表位如上所述，用FMDVRGD突变株已经将3E11识别的构象表位定位在病毒VP1蛋白G-H环中的RGD周围，6144是该表位的一个关键氨基酸残基。随后，利用噬菌体展示随机肽库技术结合合成肽定点诱变技术，确定了3E11识别的模拟表位基序为GSLXXL(图1，图2，图3，图4，表6，表7)。将该基序氨基酸序列与病毒原序列比对发现，在G-H环中该位置对应的序列是GDLXXL，而不是GSLXXL。因此我们在G_H环中寻找S的踪迹，发现在140、141位有连续两个S，据此合成Asial/YS/CHA/05株VP1蛋白G-H环136153aa十八肽。用肽ELISA对系列稀释的该十八肽G-H环(AsialpG-H)进行结合活性检测(图5)，结果表明，短肽AsialpG-H以剂量依赖方式显示其与单抗3E11的结合活性，说明该18-aa肽包含所有单抗3E11识别表位的关键性氨基酸。考虑到G-H环本身具有一定的可动性或柔韧性，所以Ser14°或Ser141均有可能是单抗3E11识别表位的必需氨基酸；该十八肽包含的GxLXXL结构与鉴定的表位基序在结构上基本吻合，该表位的Ser氨基酸残基可能是通过折叠靠近其它三个氨基酸残基，形成该构象表位。根据以上研究结果和分析确定，单抗3Ell识别的Asial型FMDV构象型中和表位的关键性氨基酸残基为Ser14°或Ser141、Gly144、Leu146和Leu149。(二)8E8单克隆抗体的制备及其识别表位的鉴定1.—株针对O型FMDV线性中和表位单克隆抗体的筛选和鉴定FMDV0/YS/CHA/05株病毒免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，杂交瘤细胞培养上清用间接ELISA检测和IFA验证，阳性判定标准为，以杂交瘤细胞培养上清对FMDV抗原的0D492光吸收值与正常BALB/c小鼠血清、SP2/0细胞培养上清对FMDV抗原0D492值之比均大于2.1，且杂交瘤细胞上清与正常BHK-21细胞不产生荧光反应，判为阳性。抗体阳性杂交瘤细胞经3次有限稀释法亚克隆，获得1株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞，命名为8E8。免疫球蛋白亚类鉴定显示，重链类型为IgGl，轻链为k类型。微量细胞中和试验表明，8E8具有很高的中和活性，腹水中和效价高达1:1024。用单抗8E8对全病毒进行Westernblot分析，出现明显的特异性反应条带，由此认为，单抗8E8识别0型FMDV的一个线性表位。为确定中和性单抗8E8的血清型特异性和抗原反应谱，用间接免疫荧光试验和微量细胞中和试验分析8E8与FMDV各分离株的反应性，结果表明，单抗8E8与0型FMDV三个基因型的分离株均产生特异性荧光，而且中和滴度都很高，说明该表位广泛存在于0型FMDV的各种基因型毒株中，是0型FMDV保守的中和表位；相反，单抗8E8与Asial型FMDV无免疫荧光反应，也不能中和Asial型FMDV毒株，说明单抗8E8识别的表位在Asial型分离株中不存在。鉴于中和性单抗在研究FMDV生物学特性中的重要作用，本发明应用噬菌体展示随机肽库进行生物淘洗，旨在鉴定单抗8E8所识别的中和表位。2.单抗8E8识别的模拟表位基序为GDLNVRT用展示随机线性12肽的噬菌体文库对纯化的单抗8E8进行4轮生物淘洗。在第3、4轮淘洗后共挑取24个噬菌体克隆进行扩增，用噬菌体亲和捕获ELISA检测其反应活性，同时设立同一只鼠制备的同种抗体亚型的单抗5F7、含0.1%BSA的PBS封闭液、噬菌体肽库PhageLibrary(PL)作为对照(图6)。在排除与抗体恒定区及BSA结合的噬菌体克隆后，最终获得7个特异性针对单抗8E8可变区的阳性噬菌体克隆。通过单链DNA序列分析，获得6条不同的噬菌体展示的12肽序列，其中有一条序列重复出现一次(表8)。对此6条序列的噬菌体克隆进行Westernblot检测显示，单抗8E8与各噬菌体克隆均发生结合反应(图7)，由此确定，单抗8E8识别的表位为线性表位。对此6条12肽进行序列比对(表8)显示，氨基酸残基G(Gly)在6条序列中出现4次；残基D(Asp)在6条序列中均展示，推测是单抗8E8识别表位的一个关键性氨基酸残基；残基L(Leu)在6条序列中出现5次；残基N(Asn)在6条序列中也出现5次，噬菌体P23在此位置展示一个具有相同酰胺基侧链的Q(Gln)，在理论上Q可替换N而不影响表位氨基酸的化学性质；残基V(Val)在6条序列中出现3次，而噬菌体P14在该位置展示一个具有相似侧链的I(lie)，一般可以替换而不影响其功能；残基R(Arg)在6条序列中出现3次，性质相似的K(Lys)在此位置出现两次，因此将该位置的氨基酸残基定为R;残基T(Thr)也是6条序列均展示的氨基酸残基。综合以上分析认为，一个以GDLNVRT为基序的特征性序列是单抗8E8识别的模拟表位。表8与单抗8E8结合的噬菌体展示肽序列16<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>a0型O/YS/CHA/05株FMDVVPl的140160氨基酸序列。b各噬菌体展示肽所包含的单抗8E8识别基序的保守性氨基酸残基均用底纹标出。3.单抗8E8识别的真实表位是147DLQVLT152单抗8E8具有很强的中和活性，因此它所识别的表位应该位于病毒的中和抗原位点。在已鉴定的0型口蹄疫病毒中和性抗原位点中，最重要的均位于VP1蛋白的G-H环。据此我们将6条噬菌体展示序列与O/YS/CHA/05毒株VPl蛋白的氨基酸序列进行比对，发现噬菌体展示的模拟表位基序GDLNVRT与病毒G-H环中的146GDLQVLT152序列存在高度的同源性；同时，我们对此7肽模拟表位的氨基酸排列(表8)做进一步的分析发现，在PI噬菌体克隆展示的模拟表位中G被W置换，P3噬菌体展示的模拟肽从D147开始、G146位出现空缺，但两者与单抗8E8都具有高水平的结合活性(图6)，由此我们推测，VP1蛋白上的^DLQVLT1526肽是单抗8E8识别的病毒表位基序的最小单位。为验证这一假设，我们将146GDLQVLT152、147DLQVLT152、146GDLQVL151、146GDLQV15°和146GDLQ149序列与GST在大肠杆菌中融合表达，获得GST-p7、GST-p7-lossG、GST-p7-lossT、GST-p7-lossLT和GST-p7_lossVLT，经SDS-PAGE电泳和Westernblot活性检测(图8)表明，单抗8E8与GST_p7、GST-p7-lossG发生特异性结合，而与其它融合肽以及GST对照不反应。这些结果显示，G^对于表位与单抗8E8的识别和结合不是需要的，而1152对于该表位的活性是必需的，由此确定，1470LQVL1~152是单抗8E8识别的最短序列，是0型FMDVVPl蛋白的一个线性中和表位。4.单抗8E8识别表位的关键氨基酸为了进一步深入了解单抗8E8识别表位中各个氨基酸残基在与单抗结合过程中所起的作用，针对病毒VP1蛋白真实序列中146152aa肽(P-8E8)合成一系列定点诱变肽，P-8E8作为阳性对照，其随机打乱肽(P-8E8-SCR)作为阴性对照，详见表9。定点诱变肽是将P-8E8分别用两种疏水性氨基酸和一种亲水性氨基酸进行替换，疏水性质的氨基酸包括侧链较短的丙氨酸(A)和空间阻位较大、侧链为芳香基团的色氨酸(W);亲水性质的氨基酸为精氨酸(R)。采用竞争ELISA方法测定这些突变肽与单抗8E8的结合活性，用0D舰吸光值绘制曲线(图9，图11)，当合成肽的使用浓度为lug/100ul时，以P-8E8的抑制率为100%，计算每条突变肽针对0型FMDV抗原的相对于P-8E8的抑制率(图10，图12)，通过计算各突变肽在此浓度下抑制率的变化评价这些氨基酸残基在表位活性中所起的作用。对噬菌体展示的6条模拟肽序列进行比对分析可见，在单抗8E8识别表位的基序中，氨基酸残基D、Q和T相对保守(表8)。为深入分析这3个氨基酸残基在8E8识别表位构成中所起的作用，我们首先合成了3条突变肽P-8E8-D-A、P-8E8-Q-A和P-8E8_T_A(表9)，分别用A(Ala)置换这3个保守的残基。竞争ELISA结果(图9)显示，与合成肽P-8E8结合的单抗8E8不再与0型FMDV抗原结合，这种抑制作用呈现剂量依赖方式，而突变肽P-8E8-D-A与随机打乱肽P-8E8-SCR—样几乎不具有抑制活性。这表明，8E8识别表位的氨基酸残基D对于抗原-抗体的识别和/或结合作用是绝对需要的。突变肽P-8E8-Q-A和P-8E8-T-A仍与单抗发生结合(图9)，但两者的抑制率均有下降(图10)，突变肽P-8E8-Q-A抑制率(46.4%)的变化程度大于P-8E8-T-A(75.4%)，说明残基Q和T均为该表位的重要氨基酸。虽然丙氨酸(A)可以模拟苏氨酸(T)的大部分功能，致使突变肽P-8E8-T-A仍与单抗8E8结合，但缺失突变分析(图8)表明，在T被删除后表位的活性完全丧失，说明该表位中残基T或该位置其它残基的存在对于该表位的活性是必需的。在上述定点诱变分析的基础上，本发明进一步合成了6条突变肽，包括P-8E8-G-W、P-8E8-V-W、P-8E8-Q-W、P-8E8-L148-A、P-8E8-L151-A和P-8E8_L151-R(表9)。竞争ELISA结果(图11)显示，突变肽P-8E8-G-W同P-8E8—样，以剂量依赖方式与单抗结合，该结果结合上述的G"6缺失突变分析(图8)结论性地表明，该表位的活性无需甘氨酸(G)的存在。突变肽P-8E8-V-W几乎不具有抑制活性，其抑制率与随机打乱肽P-8E8-SCR的抑制率一样在接近零的水平上；可是，在筛选模拟肽(表8)时，V的出现频率仅为3/6，与V性质相似的I出现1次(1/6)，而与V性质不同的T出现2次(2/6)，这提示V在该表位中是重要的氨基酸残基，虽然用W替换后表位活性完全消失，但用I和T替换对表位活性无重要影响，说明V与D残基不同，对于该表位不是绝对需要的。突变肽P-8E8-Q-W同P-8E8-Q-A—样也保留部分活性与单抗结合，两者的抑制率分别为39.2%和46.4%。突变肽P-8E8-L148-A和P-8E8-L^-A虽然仍保留与单抗8E8的结合活性(图ll)，但二者的抑制率明显下降(图12)，突变月太P-8E8-L148-A为32.3%而P-8E8_L151-A为30.9%，说明残基L148和L151与Q一样也是该表位的重要氨基酸。与残基L148和L151突变肽相比较，突变肽P-8E8-Q-A、P-8E8-Q-W和P-8E8-T-A的抑制率(46.4%、39.2%和75.4%)较高(图10，图12)，说明该表位中氨基酸残基Q(无论用A或W替换)和T对表位活性的影响相对于氨基酸残基L148和L151较小，两个疏水性氨基酸残基L148和L151在表位中与单抗的结合能大于两个亲水性氨基酸残基Q和T提供的结合能。突变肽P_8E8-L151-R能够模拟P-8E8的全部功能与单抗结合，说明在单抗8E8识别的模拟表位基序中R可完全代替L151发挥作用。概括起来，本发明鉴定的单抗8E8识别表位为六肽147DLQVLT152，其中残基D147为关键氨基酸，残基V、L148、L151、Q149和T152为重要氨基酸，并且该表位中T152位置的氨基酸残基对于表位活性是必需的。表9用于本发明的合成肽及其氨基酸序列18多肽名称多肽序列bP-8E8a146G-D-L-Q-V-L-T152P-8E8-D-AG-A-L-Q-V-L-TP-8E8-Q-AG隱D-L-4隱V-L-TP-8E8-T-AG-D-L-Q-V-L-AP隱8E8隱G隱WW-D-L-Q-V-L-TP-8E8-V-WG-D-L-Q-W-L-TP-8E8-Q-WG-D-L-W-V-L-TP-8E8-L148-AG-D-4-Q-V-L-TP-8E8-L151-AG-D-L-Q-V-A-TP-8E8-L151-RG-D-L-Q-V隱g-TP-8E8-SCRQ陽T國G-L-V國L-Da0/YS/CHA/05株VP1的146152aa肽。b突变位点氨基酸均加粗并用下划线标出，部分残基用丙氨酸(A)、色氨酸(W)及精氨酸(R)替换。(三)3E11和8E8单克隆抗体在体内外的免疫保护性1.乳鼠攻毒剂量的确定单层BHK-21细胞接种病毒后，每天观察接种病毒的96孔培养板3次，3_5天后测定，Asial型FMDVAsia/YS/CHA/05株TCID50为7.0，0型FMDVO/YS/CHA/05株TCID50为7.25。用灭菌PBS以IO倍梯度系列稀释这两个毒株，分别稀释成10—5、10—6、10—7禾P10—8，对Asia/YS/CHA/05和O/YS/CHA/05毒株进行半数致死量(LD5。)测定，阴性对照组注射灭菌的PBS，24h内死亡鼠被视为接种意外死亡。由此确定，Asial型FMDVAsia/YS/CHA/05株和0型FMDVO/YS/CHA/05株的LD5。分别为10—6/0.2ml和10—7/0.2ml(表10、11)。为选取合适的Asial型和0型FMDV攻毒剂量，用以上检测结果为依据，选择能够使乳鼠全部死亡的Asial型和0型FMDV的最高稀释度作为乳鼠的攻毒剂量，由此确定这两个毒株最适合的乳鼠攻毒剂量均为10LDs。/200ul/只。表10Asial/YS/CHA/05LD5。的测定病毒攻毒剂量乳鼠存活稀释(TCI謂/ml)数/总数l(T5200/0.20/410—620/0.22/410—72/0.24/410-80.2/0.24/4对照组PBS/0.26/6表110/YS/CHA/05LD5。的测定乳鼠病毒稀释攻毒剂量(TCID5。/ml)存活数/总数lO—5356/0.20/410—635.6/0.20/410—73.56/0.22/40.356/0.24/4对照组PBS/0.26/62.单抗3E11、8E8的体外中和活性应用微量中和试验对单抗的中和抗体半数保护量进行检测。试验所设的病毒对照、腹水对照及细胞对照均正常，说明此试验成立。结果表明，Asial型FMDV单抗3E11和0型FMDV单抗8E8具有很好的中和活性，保护50%BHK-21细胞不产生CPE的单抗腹水中和抗体半数保护量(PD5。)分别为1995和2371。3.单抗3E11、8E8对乳鼠的免疫保护作用在乳鼠体内验证单抗3E11和8E8的免疫保护效力，攻毒后每天观察乳鼠的死亡情况，PBS对照组乳鼠正常死亡，单抗对照组乳鼠未见异常。单抗3E11实验组中各组的单抗浓度分别为2、4、8、16、31和62PDs。，各组乳鼠的Asial型FMDV的攻毒剂量均为100)5。，试验结果(图13)表明，乳鼠的保护率随着单抗浓度的升高而逐渐升高，当单抗3E11稀释为8倍的中和抗体半数保护量时(8PD5。)，可完全保护乳鼠耐受致死剂量的Asial型FMDV攻击。单抗8E8实验组中各组的单抗浓度分别为3、5、11和21PDs。，各组乳鼠的0型FMDV攻毒剂量也为10LDs。，试验结果如图14，单抗浓度与乳鼠的保护率之间呈现正相关，当单抗8E8浓度为11PD5。时，可完全保护乳鼠耐受致死剂量的0型FMDV攻击。使用不同的单抗浓度对乳鼠存活时间有不同的影B向，随着单抗浓度的升高，乳鼠的起始死亡时刻后延、终点死亡时刻前移。当单抗3E11的浓度为2PD5。时，乳鼠起始死亡时刻和终点死亡时刻分别为攻击病毒后第42h和128h;当单抗3E11浓度为4PD5。时，乳鼠起始死亡时刻和终点死亡时刻分别为攻击病毒后第55h和68h(图15)。在单抗8E8试验组中，单抗浓度为3PD5。时，乳鼠起始死亡时刻和终点死亡时刻分别为攻击病毒后第72h、117h;当单抗浓度为5PD5。时，乳鼠起始死亡时刻和终点死亡时刻分别为攻击病毒后第84h、96h(图16)。单抗使用浓度与乳鼠的体重增长百分率呈一定的比例关系(图17、18)，各组乳鼠体重增长百分率的变化在攻击病毒后的前4天比较明显，随着单抗浓度的升高，对乳鼠的保护效果增强，乳鼠的体重生长也趋于正常。序列表〈110〉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所〈120〉抗口蹄疫病毒的单克隆抗体及其识别的抗原表位和应用〈130>KLP0805620〈160〉2〈170>PatentInversion3.5〈210〉1〈211〉6〈212>PRT〈213〉Footandmouthdisease〈400〉1GlySerLeuXXLeu15〈210〉2〈211>7〈212〉PRT〈213〉Footandmouthdisease〈400>2GlyAspLeuAsnValArgThr1权利要求一株能分泌抗亚洲1型口蹄疫病毒的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其微生物保藏号是CGMCC2692。2.由权利要求1所述杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体。3.权利要求2所述单克隆抗体所识别的亚洲1型口蹄疫病毒VP1蛋白的构象型中和表位，其特征在于该构象型中和表位的关键性氨基酸残基是由亚洲1型口蹄疫病毒的VP1蛋白上Ser140或Ser141、Gly144、Leu146和Leu149组成。4.按照权利要求3所述的构象型中和表位，其特征在于所述构象型模拟表位的氨基酸序列为GSLXXL，其中，X选自任意一种氨基酸残基。5.—株能分泌抗O型口蹄疫病毒的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其微生物保藏号是:CGMCC2691。6.由权利要求5所述杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体。7.权利要求6所述的单克隆抗体识别的0型口蹄疫病毒的VP1蛋白的线性中和表位，其特征在于该线性中和表位的氨基酸序列为SEQIDN0:2所示。8.由权利要求7所述的线性中和表位所衍生的氨基酸序列，其特征在于是对权利要求7所述的线性中和表位中的一个或多个氨基酸进行缺失和/或替换后所得到的任意一种的氨基酸序列；其中所述的缺失是将G缺失；所述的替换选自以下6种氨基酸残基替换情况中的任意一种或一种以上进行的组合(l)G用W替换；(2)L用A替换；(3)N用Q、A或W替换；(4)V用I或T替换；(5)R用L、K或A替换；(6)T用A替换。9.权利要求2或6所述的单克隆抗体在制备诊断、预防或治疗口蹄疫的试剂或药物中的用途。10.权利要求3或4所述的构想型中和表位在制备诊断、预防或治疗口蹄疫的试剂、疫苗或药物中的用途。11.权利要求7或8所述的线性中和表位在制备诊断、预防或治疗口蹄疫的试剂、疫苗或药物中的用途。全文摘要本发明公开了抗口蹄疫病毒的单克隆抗体及其识别的抗原表位和应用，属于口蹄疫的防治领域。所述能分泌抗亚洲1型FMDV的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞系的微生物保藏号是CGMCCNo.2692；所述能分泌抗O型FMDV的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其微生物保藏号是CGMCCNo.2691。本发明还公开了上述两个单克隆抗体所分别识别的亚洲1型FMDVVP1蛋白的构象型中和表位和O型FMDVVP1蛋白的线性中和表位的氨基酸序列。体外中和试验和体内动物保护试验说明，本发明的两种单克隆抗体均具有良好的被动免疫效果，均能应用于口蹄疫的紧急预防，可对口蹄疫的被动免疫起到良好的免疫效果。文档编号C12N5/20GK101724605SQ20081017125公开日2010年6月9日申请日期2008年10月30日优先权日2008年10月30日发明者于力,周国辉,张春媛,赵磊申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所