专利名称：用Phyllobacterium sp.nov.921F菌株生产新型细菌胞外多糖的制作方法
技术领域：
生物技术
背景技术：
目前已报告的能够产生胞外多糖的菌株有以下几类铜绿假单胞菌
(P. aeruginosa)产生的D_葡萄糖、D_半乳糖、D_甘露糖、L_鼠李糖和D_葡萄糖醛
酸组成的酸性多糖，C.ulvaensis产生的葡萄糖、木糖构成的胞外多糖，以及结合杆
菌(M. tuberculosis)产生的D_甘露糖、阿拉伯糖组成的多糖。链球菌S. equi和
S. zoo印idernicus能够产生由葡萄糖醛酸和氨基葡萄糖组成的透明质酸。嗜热链球菌
(S. Thermophilus)产生由D_半乳糖、D-葡萄糖和N_乙酰半乳糖构成重复单位的多糖。野
油菜黄单孢菌(X. Campestris)能够产生黄原胶，结构由D_葡萄糖卬-甘露糖卬-葡萄糖醛
酸组成。也有少数的种能够产生同质聚糖，例如明串珠菌属(Leuconostoc sp.)和足球菌
属(Pediococcus sp.)产生的胞外葡聚糖；醋酸杆菌(A.xyli皿m)产生的胞外细菌纤维素 等。 Phyllobacterium sp. nov. 921F能够产生胞外多糖，据本发明人通过查阅资料、文 献检索所知，目前并没有关于叶杆菌Phyllobacterium产生胞外多糖的的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种菌株Phyllobacterium sp. nov. 921F，并利用该菌株生 产细菌胞外多糖的方法。 本发明分离纯化出一株来源于真菌子实体表面的菌株Phyllobacterium sp.nov. 921F，具有产生胞外多糖的特性。保藏单位中国典型培养物保藏中心。地址中国 武汉，武汉大学。保藏日期为2005年5月16日，保藏号为M205043。本发明的特点是
首次分离出一株具有产生细菌胞外多糖的Phyllobacterium sp. nov. 921F菌 株。该菌株革兰氏阴性，直杆状，0.4-0.8iimX0.8-2.0iim。以1至几根极毛或长波状 的侧生鞭毛运动。好氧，以分子氧为末端电子受体的严格好氧呼吸代谢类型。最适温度 为28 34t:。接触酶阳性。化能异养菌，利用各种糖，如葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、 阿拉伯糖以及有机酸(丙二酸盐、葡萄糖酸盐)作为碳源。可利用铵盐、硝酸盐和多数氨 基酸类作为氮源。不水解淀粉，果胶和纤维素。根据伯杰氏手册第九版，本发明的菌株的 形态和生理生化特征与叶杆菌属一致，确定为叶杆菌属，但其形态和生理生化特征与该属 已知菌相比有所不同(该菌株与叶杆菌属其他菌种的特征对比见表l)。对该菌种进行 16S rRNA基因测序，其结果与Genebank中Phyllobacterium的序列进行比对相似度最 高，其相似度为98.7%。该菌种具有营养要求简单，易培养，胞外多糖产量高的特点。经 基本化学法测定该多糖由葡萄糖、半乳糖和丙酮酸形成的重复单元组成，摩尔组成比为 1:1:1。仅质谱、核磁初步判断Phyllobacterium sp. nov. 921F产生的胞外多糖结构可能是—4)-P-D-Glcp(1 — 3)-a-D-Galp(4，6-S-Pyr)-(l —重复片断构成的多聚糖。该多糖 不同于以往任何工业生产菌株所产生的多糖，是一种可以实现工业应用的新型细菌胞外多 糖。
图1 :标准糖气相色谱分析结果。 图2 :Phyllobacteri咖sp. nov. 921F菌株生产胞外多糖酸解终产物气相色谱分
析结果。
图3:分子j 图4:分子j 图5:分子j 图6:分子j
:为805组分的二级质谱。
:为1200组分的二级质谱c
:为805组分的^-NMR。 :为805组分的13C-NMR。
图7 :分子量为805组分的13C-NMR。
具体实施例方式1.菌株的分离纯化 本发明Phyllobacteri咖sp. nov. 921F菌株的获得从长白山余脉采集真菌子实 体样品，加入到装有25ml富集培养基(蔗糖2g，NaN03lg，K2HP040. 5g，MgS040. 5g，NH4C10. 5g， FeS040. Olg， H201000ml， pH7. 2)的三角瓶中，30°C ， 160r/mim摇瓶培养3d。然后将富集 培养液用无菌生理盐水适当稀释后，取O. 2ml涂布初筛分离培养基(蔗糖10g， NaN03lg， K2HP040. 5g， MgS040. 5g， NH4C10. 5g， FeS040. Olg，琼月旨15g， H201000ml， pH7. 5)平板。30。C倒 置培养48h，获得选取平板上有粘稠乳白色的菌落，得到一株能产胞外多糖的细菌。
2.菌株的鉴定 将分离得到是菌株按《伯杰氏细菌学鉴定手册》第九版本进行菌株的形态和生理 生化鉴定，其特征与叶杆菌属一致，确定其为叶杆菌属，该属目前有报道2个种，对比属内 的生理生化特征与该属已知菌相比有所不同(Phyllobacterium sp. nov. 921F与叶杆菌属 其它菌种的特征对比见表l)，又对该菌种进行16S rRNA基因测序，结果如下
CCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAgACTccTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCT
CTGGTAGTCCACGCCGTAAACTATGAGAG 其结果与Genebank中Phyllobacterium的序列进行比对相似度最高，相似度为 98.7%。根据以上结果将该种记为Phyllobacterium sp. nov. 921F。
3.用Phyllobacterium sp. nov. 921F菌株生产胞外多糖: 将菌种预培养物接种于装有100ml发酵培养基(蔗糖30g，蛋白胨7g， K2HP042g， MgS040. 25g，FeS040. Olg， H201000ml，pH8)的250ml三角瓶中，30。C摇瓶培养48h后，将培养 液过膜去除菌体。然后，加2倍体积的95%乙醇于发酵液中，玻璃棒搅动至出现絮状沉淀， 4°C下保存12h后，离心去除上清液，沉淀以蒸馏水复溶后，粗多糖经过Sevag法除蛋白，再 用乙醇沉淀来进一步纯化产物多糖，冷冻干燥，得到多糖成品。
4. Phyllobacterium sp. nov. 921F多糖的分析: 首先利用糖醇乙酸酯衍生物气相色谱法(GC)对单糖组成进行确定，即取25mg样 品加入3ml2mol/L三氟乙酸(TFA) ， IO(TC水解6h，减压除尽TFA，再加入50mgNaBH4和5mg内 标物肌醇，对其进行衍生化后，将样品上气相色谱柱(DB225毛细管柱(30cmX25mm))。根据 相对保留时间确定单糖组成以及相对保留峰面积确定各单糖的含量。图1为标准糖分析结 果，图2为该多糖酸解终产物，经比对可知，该多糖由葡萄糖、半乳糖组成，其摩尔比为1:1。
再将降解的产物经Bio-Gel P4进行分级得到3个组分，经一级质谱确定分子量 分别为806、1200和1594Da。对其分别进行二级质谱(图3、图4)，结果显示该多糖由葡 萄糖、半乳糖和丙酮酸取代基形成的重复单元组成，摩尔组成比为1:1:1。经核磁^-NMR、 "C-NMR结果分析(图5、图6)，多糖的重复单元为一4)-P-D-Glcp(1 — 3) - a-D-Galp (4， 6-S-Pyr)-(l —。 表1叶杆菌属(Phyllobacterium)种间的鉴别
鉴别特征 P m>Wsaceanwi p rwfczacearMW 尸/^/Zo6acten'鹏sp.Nov. 921F
鞭毛排列
l到几根极毛或侧毛
仅有l根极毛 叶瘤出现于 N03还原到N02 氧化酶
+ — +
一 + —
紫金牛 茜草 真菌子实体 +— + ++ 一
权利要求
一种叶杆菌(Phyllobacterium sp.nov.921F)，该菌种由中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏单位简称CCTCC，保藏号为M205043。
2. —种叶杆菌(Phyllobacterium sp. nov. 921F)产糖细菌其16SrDNA核酸序列SEQ ID NO. 1
3. —种叶杆菌(Phyllobacterium sp. nov. 921F)菌株产生的细菌胞外多糖，其特征是 由葡萄糖、半乳糖和丙酮酸形成的重复单元组成，摩尔组成比为1:1:1。多糖的重复单元为 —4)-P -D-Glcp(1 — 3)- a -D-Galp(4， 6-S-Pyr)_(1 —。
全文摘要
本发明涉及一种能够产生细菌胞外多糖的细菌，并提供一种利用该菌株生产细菌胞外多糖的方法。本发明提供的菌种具有营养要求简单，易培养，胞外多糖产量高的特点。特别是利用本发明中半合成培养基发酵该菌株可得到较高的产糖量。在含有3％蔗糖的肉汁液体培养基中培养72h，其菌种胞外多糖产糖量达1.5g/100ml。该细菌胞外多糖为白色粉末，易溶于水，重均分子量为736kD，其中室温条件下1.0％糖溶液表观粘度为655mps。对该细菌胞外多糖的性质研究表明，该多糖由葡萄糖、半乳糖和丙酮酸形成的重复单元组成，摩尔组成比为1:1:1。经质谱、核磁初步判断Phyllobacterium sp.nov.921F产生的胞外多糖结构是→4)-β-D-Glcp(1→3)-α-D-Galp(4，6-S-Pyr)-(1→重复片断构成的多聚糖。该多糖不同于以往任何工业生产菌株所产生的多糖，同时用本发明的菌株作为一种细菌胞外多糖生产菌株，具有产品产量高、稳定性好、生产周期短、成本低的特点，能够实现工业化应用生产。
文档编号C12R1/01GK101724578SQ20081017076
公开日2010年6月9日 申请日期2008年10月21日 优先权日2008年10月21日
发明者江晓路, 王鹏, 管华诗 申请人:中国海洋大学