微米和纳米颗粒与血小板一起的递送的制作方法

专利名称：微米和纳米颗粒与血小板一起的递送的制作方法
微米和纳米颗粒与血小板一起的递送
背景技术：
1.发明领域本发明涉及将活性药物和成像纳米颗粒递送至需要的患者的方法和组合物。2.相关领域的简述维管组织的损伤和感染的治疗和诊断通常是个问题，并且结果是给予这些损伤或 感染部位适当的治疗是困难的。这些困难阻碍了对这些特定疾病和病症的有效治疗的发 展，以下将描述其实例。例如，特别是由于触染的严重性和常常致命的结果，出血热病毒感 染给医学提出了重要的挑战(Borio等，JAMA 287,1-51 (2002)) 0出血热是由不同组的病毒 引起的，这些病毒发挥高度不同的病理作用。然而，在这些病毒的发病机理中存在两个共同 的步骤(一个早期，一个晚期)。首先，占优势的证据表明作为先天免疫系统组分的巨噬细 胞(单核细胞)的感染在出血热病毒的繁殖中起着重要的初始作用。其次，出血病毒的感 染导致出血，并且在许多情况中，伤口部位是病毒损害脉管细胞的结果。出血热病毒是丝状病毒科(Filoviridae)、沙状病毒科(Arenaviridae)、布尼亚 病毒科(Bunyaviridae)和黄病毒科(Flaviviridae)的成员并具有由单链RNA组成的基因 组。通常，病毒通过以下机理起作用(1)血小板减少-血小板水平的降低是出血热病毒感 染几乎全有的结果；(2)血小板机能不全-血小板功能障碍加剧了出血热中的血小板减少 症状；(3)降低的体液凝血因子浓度-体液凝血因子循环水平的下降可能是由于降低的因 子合成而由肝组织的消耗(和伤口部位的血小板或DIC—起)和/或损伤引起的；和(4) 血管完整性的失去-内皮完整性的失去，导致血浆渗漏和微血管伤口部位的形成，是出血 热疾病中的常见特征。因此，用于处理这些病毒的药物选择受到了限制。病毒唑是在1972年初次报道的核苷类似物，其具有广谱抗病毒活性。尽管病毒唑 (单磷酸盐)已经显示出抑制肌苷单磷酸盐脱氢酶，用于降低细胞GTP，更近的研究表明该 核苷类似物通过提高病毒对于“致死诱变”的内在突变率来起作用。在组织培养物中，病毒 唑具有对抗多种病毒的抗病毒活性，包括黄病毒、沙粒病毒和本杨病毒。更重要的，病毒唑 已经由FDA批准用于治疗黄病毒科成员丙肝病毒，并且已经在有限数量的沙粒病毒感染患 者的治疗中显示出功效。另一方面，三个观察结果降低了对病毒唑作为抗病毒剂的关注。首先，基于病毒唑 体内性能的预示没有在临床中完全实现。例如，已经报道了病毒唑在治疗丝状病毒科和黄 病毒科成员感染中是无效的(Borio等，出处同上)。其次，已经表明该核苷类似物在感染丙 肝病毒的患者中限制了肝组织损伤，但需要使用干扰素的双重治疗来用于病毒清除。最后， 病毒唑化疗的副作用是诱发了贫血，这是红血球渗透和裂解的结果。因此，需要新的方式来 给药病毒唑和其他这样的活性剂。另一个实例是跌打损伤的诊断。组织损伤的精确判定在跌打损伤控制中最为重 要。该判定中的关键要素，特别是在血流动力学不稳定或临界稳定的患者中，是内出血部位 位置的确定。身体检查，传统的造影剂的X-射线血管造影术和血管外造影剂的CT定位可 以用来确定活动性出血部位的位置。基于标记红血球的放射性方法是有用的，但常常未能检测出血部位。这些技术可能是有效的，特别是一起使用时。然而，血管痉挛和血管阻塞， 以及几个出血部位的共同定位可能导致鉴定出血部位的失败。此外，造影剂的密度可能使 较小的出血部位闭塞。这后一问题已经通过使用较低χ-射线密集的C02造影剂得到了部 分改善。研发用于检测出血转化中血管缺损的MRI方法的应用有希望作为用于一些类型损 伤中伤口部位定位的工具，这些类型的损伤包括脑创伤和脊髓损伤。然而，使用上述方法的 基础问题是成像是基于血管内含物从循环系统移动出来，而没有使血管破裂的确切血管病 部位直接成像。另一个实例是癌症的治疗，如前列腺癌。前列腺癌仍然是中老年美国男性发病率 和死亡率的主要诱因。尽管在活组织检查后看到了几种组织学类型的前列腺癌，大多数前 列腺癌是腺性来源的腺癌。诊断的进展导致所有前列腺癌的大约90%是在前列腺内或附 近发现的。对于相对早期检测到的90%的情况，五年存活率达到100%。相反，10%代表弥 散性疾病只经历34%的五年存活率。只有皮肤癌和四种常见组织学类型的肺癌的联合死 亡率在该人群中更常见。在2007年，美国癌症协会预期218，890新病例的临床症状，是大 约27，050例死亡的主要诱因。六名美国男性中将有一名值得注意的在某个时间产生前列 腺癌，34名中的一名将死于恶性肿瘤。与目前护理标准的治疗相关的潜在严重不利事件的简要概括说明了入侵较少、更 小心地靶向、肿瘤特异性诊断和治疗方法的希求。理想的是最小化对健康前列腺、神经和其 他前列腺外部组织的损伤，同时与目前护理标准的外科手术或放疗相比，保持或提高肿瘤 杀灭功效。与前列腺癌外科手术(开腹耻骨后前列腺切除术、开腹经会阴前列腺切除术、腹 腔镜前列腺切除术或前列腺的经尿道切除)相关的严重不利情况包括阳痿、失禁和术后感 染。放疗后的阳痿率与外科手术的相同，超过十分之七的男性在外部束放疗的五年内变成 阳痿。尽管失禁比外科手术后少见，但失禁的风险在放疗后直至治疗后六年每年递增，比例 几乎和外科手术相关的一样高。雄激素切除仍然是晚期前列腺癌的标准疗法，并在大部分 男性中引起疾病缓解。然而，癌症最终复发，并且此后患者的中值存活低于一年。对研发用 于定向能量传递的纳米颗粒负载血小板所提出项目的结果对改进这些困难中的多个困难 抱有希望。关键需要改善目前前列腺癌中的护理标准，而本发明可能是对该需求的响应。另一个实例是心血管疾病及其相关血管病理学的治疗。对于心血管疾病治疗需求 未满足的性质通过美国超过60百万诊断为心血管系统障碍患者每年超过$300十亿的花费 得到证明。大部分心血管疾病由血管损伤部位的血栓形成、炎症和增殖性过程的协调机能 障碍引起。例如，急性心肌梗塞是炎症和增殖性过程导致动脉粥样硬化斑破裂时产生的冠 状循环的血栓形成闭塞的结果。相似地，血管成形术和心脏分流术后的再狭窄是最初血栓 形成，然后在程序的最初血管损伤部位的炎症和增殖性过程的结果。对基于心血管疾病中 形成血栓、炎症和动脉粥样硬化过程的分子机理日增的理解形成用于基因治疗干涉的各种 策略，包括干扰胞内信号和细胞周期控制，扩大抗血栓形成胞内信号，抑制致动脉粥样硬化 脂质代谢。目前使用几种方法来获得位点特异性基因递送，用于心血管基因治疗，包括使用 导管介导的基因转移和直接针注射至外膜的物理靶向。通过使用组织特异性启动子(例 如，用于平滑肌细胞递送的SM2》获得另外的特异性水平。然而，期望有更多将治疗化合物 特异性地递送至损伤部位(包括血管损伤)的工具。血小板是体内循环血液系统的成分，并且是本领域公知的。美国专利申请公开2005/0025748和2005/0272161公开了携带活性剂并用于将活性剂递送至目标部位的固定 的-干燥的血细胞和固定的-干燥的血小板。这些申请中的血细胞和血小板通过化学处理 来“固定”，将至少一种化合物掺入至少一部分细胞中，以在结构上稳定和/或延长细胞的 保存期。公开的固定剂包括甲醛、多聚甲醛和戊二醛，以及高锰酸盐溶液。然而，理想的是 消除固定步骤，以便更快速和清洁地处理携带所需活性剂的血小板。发明概述本发明是装载纳米颗粒的血小板以及用于给血小板装载纳米颗粒的方法。将所得 到的装载纳米颗粒的血小板用于将治疗法和成像药征递送至血管损伤部位以及人体中的 巨噬细胞和兽医药物。可以将装载纳米颗粒的血小板灌输至体循环中或局部应用于损伤表在一个方面中，本发明涉及含有微米或纳米大小颗粒的血小板，微米或纳米大小 的颗粒含有活性剂。在另一个方面中，本发明涉及含有药物学上可接受的载体和血小板的药物组合 物，该血小板含有微米或纳米大小的颗粒，该微米或纳米大小的颗粒含有活性剂和药物学 上可接受的载体。再一个方面中，本发明涉及将血小板递送至患者体内目标部位的方法，该血小板 含有微米或纳米大小的颗粒，该颗粒含有活性剂，该方法包括步骤提供上述血小板，并将 所述血小板给予患者。从以下本发明的附图和详述将更全面地了解这些和其他方面。附图简述结合附图，从以下的详述将更全面地了解本发明。

图1是电子透射显微照片，其描绘了用于纳米颗粒的PEI与质粒DNA的聚集。图2是电子透射显微照片，其描绘了血小板中基于PEI的纳米颗粒。图3是电子透射显微照片，其描绘了血小板中超-顺磁氧化铁纳米颗粒。图4是电子透射显微照片，其描绘了血小板中SPIO纳米颗粒的自组织。图5是电子透射显微照片，其描绘了通过磁场调节后装载SPIO的颗粒。图6是电子透射显微照片，其描绘了脐静脉中装载SPIO颗粒的B-模式成像。图7显示了装载SPIO颗粒的磁共振和回声响应。图8显示了电子透射显微照片，其描绘了雄激素除去后定位于前列腺肿瘤的颗 粒。图9是电子透射显微照片，其描绘了前列腺异种移植组织中的颗粒。图10显示了聚乙烯亚胺/基于聚阴离子的纳米颗粒的制备。图11显示了电子透射显微照片，其描绘了标记的纳米颗粒与血小板的结合。图12显示了荧光显微照片和生物工程化血小板的流式细胞计数特征；图13显示了几种血小板的显微镜荧光。图14显示了装载病毒唑的血小板。图15显示了吞噬标记的血小板的单核细胞的结果。图16显示了基于小单层泡囊的纳米颗粒的解剖。图17显示了附着于血小板的SUV纳米颗粒。
发明详述本发明涉及血小板作为载体来携带各种治疗或成像剂的用途。血小板是合理的载 体，并且出于几个原因，对于将治疗剂递送至两种类型的血管部位是有利的。首先，广泛地认识到血小板结合到血管破裂部位上以提供止血，并且有利地将装 载治疗剂的血小板集中至血管损伤部位。例如，如果将抗癌剂递送至脉管系统受损的肿瘤， 将是有利的。如果将抗病毒剂递送至出血热中的血管破裂部位，也将是有利的。此外，将出 血部位成像的需求对于跌打损伤的诊断以及外科手术指引都是重要的。其次，结合到血管损伤部位上的血小板的最终命运是在伤口愈合过程中由巨噬细 胞吞噬。或者，输入的细胞通过网状内皮系统(RES)的巨噬细胞从自由循环中清除出去。 巨噬细胞是许多类型的病毒(包括出血热病毒)感染的重要部位，并且与病理性炎症反应 的产生密切相关。因此，存在许多医学情况，其中应当靶向巨噬细胞，用于成像和抗炎治疗 剂递送。巨噬细胞驱使的炎症常常是血管破裂的基本原因，例如在出血热、炎性肠病和中风 中的出血性转化中。相反也是正确的；血管破裂可以是巨噬细胞驱使的炎症状态的基础原 因。例如，在涉及外伤过量失血的严重失血性休克中，炎性介质的大量全身性释放可以使止 血系统失活，因此加剧了失血。相似地，巨噬细胞活化是过量失血后多个器官衰竭的重要诱 因。因此，炎症和血液学过程与协同的因果方式密切相关。因此，对于装载治疗和成像纳米 颗粒的血小板，存在许多潜在的医学应用。待用本发明的方法和组合物治疗的患者包括人患者以及用于兽医学和药物研发 目的的动物患者。通常，动物患者是哺乳动物患者，包括但不限于猪、绵羊、奶牛、马、山羊、 猫、狗、小鼠和大鼠患者，在此所用的术语“形成血栓的表面”指的是任何天然的或人造的形成血栓的表面， 包括但不限于创伤组织，血管斑，如动脉粥样硬化斑，由于局部或全身性炎症活化的内皮， 患者体内由于抗癌、抗肿瘤或抗增殖药剂的给药引起的毒性副作用而致使形成血栓的血 管、表面或组织，患者体内外源或植入物体的表面，包括金属、聚合物等，如在支架、导管、生 物医学植入物(如起搏器和引线)、整形外科植入物(如人造关节)等中发现的。可以将化 合物给予形成血栓的表面，用于任何目的，如用于治疗目的或诊断目的(例如，通过任何合 适的方式成像或检测形成血栓的表面，如放射性成像、活组织检查、植入物取出和是否在植 入物表面发现递送的化合物的确定等)。如在此限定的术语“血小板”通常是动物来源的，并优选是哺乳动物来源的(例 如，猪、绵羊、奶牛、马、山羊、猫、狗、小鼠、大鼠、人等)。血小板可以源自将血小板引入其中 的相同物种，或来自将血小板引入其中的不同物种。在一个实施方案中，从患者收集血小 板，用于制备在此所述的活性剂，并在如此制备后，在稍后的时间将其返回从其收集血小板 的同一患者。血小板可以是新鲜的、自体同源的、同种异体的或再水合-冻干的(“RL”)。在此“固定的”指的是已经用至少一种化合物化学处理过的血小板，该化合物被引 入至少部分细胞，以在结构上稳定和/或延长细胞的保存期。优选，本发明的血小板是未固 定的。在此“固定-干燥的”指的是血小板已经固定并另外通过任何合适的技术(如干 燥、脱水、冻干或冷冻干燥等)从其除去水分以进一步在结构上稳定和/或延长其保存期。“再水合”指的是已经与水溶液接触或混合的固定-干燥的血小板，使得水吸收至胞内空间。如在此所用的“凝血蛋白”包括任何合适的凝血蛋白，包括但不限于因子VII、因子 IX、因子X以及产生因子VII或FVIIa(如因子XII或因子XIIa)或因子X或因子)(a，蛋白 C，蛋白S和凝血酶原的凝血蛋白。这样的蛋白质可以是天然的或合成的，并包括含有天然 产生蛋白质少量修饰的蛋白质(即，类似物)。其中天然产生蛋白质可以是任何物种来源 的，优选如在此所述的哺乳动物或人，并且在一个实施方案中，与待给药的患者是相同的物 种来源。如在此所用的“抗凝血蛋白，，包括任何合适的抗凝血蛋白，包括但不限于活化蛋白 C、蛋白S、肝素和类肝素等。这样的蛋白质可以是天然的或合成的，并包括含有天然产生蛋 白质少量修饰的蛋白质(即，类似物)。其中天然产生蛋白质可以是任何物种来源的，优选 如在此所述的哺乳动物或人，并且在一个实施方案中，与待给药的患者是相同的物种来源。
如在此所用的“AAV”指的是“腺伴随病毒”。如在此所用的术语“治疗”指的是给予患病患者益处的任何类型的治疗，包括患者 病症的改善(例如，一个或多个症状)、疾病进展的延迟等。如在此所用的术语“药物学上可接受的”意思是化合物或组合物适于给予患者以 实现在此所述的治疗，根据疾病的严重程度和治疗的必要性没有不适当的有害副作用。如 在此所用的“载体”意思是制药领域已知的与活性剂联合使用来制备药物组合物的载体。 药物载体的实例包括固体、液体或含水载体，如离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血 清蛋白，如人血清白蛋白，缓冲物质，如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸 的偏甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠(盐 水)，锌盐，硅胶，三硅酸镁，聚烯吡咯烷酮，纤维素基物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙 烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚样丙烯-嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂，及其组合。关于颗粒使用术语“微”和“纳”时，指的是颗粒的直径大小。前缀“微”指的是具 有大于300纳米直径的颗粒。前缀“纳”指的是具有300nm或更小直径的颗粒。本发明的微米和/或纳米颗粒可以从各种材料制得，包括但不限于天然和合成的 聚合物，树枝状骨架，小分子的聚集体，铁磁性材料，磷脂囊，胶束，脂质体及其组合。可以使 用本领域已知的技术制得本发明的微和/纳米颗粒，包括聚集，如在阳离子纳米颗粒的情 况中(参见，例如，Lu W, Wan J, She Ζ, Jiang X，J Control Release. (2007) 118 :38-53 ； Feng Μ, Lee D, Li P, Int. J. Pharm. (2006)311 :209-214 ；Gupta K, Ganguli M, Pasha S, Maiti S.Biophys. Chem. (2006) 119 :303-306 ；Dawson M, Krauland E, Wirtz D, Hanes J, Biotechnol. Prog. (2004) 20 :851-857 ；Sennerfors Τ, Solberg D, Tiberg F.J.Colloid Interface Sci. (2002) 254 :222-226)，和饱和点沉淀，如在氧化铁超顺磁纳米颗粒的情况 中(参见，例如，CorotC，Robert P, Idee JM, Port Μ, Adv. Drug Deliv. Rev. (2006)58 1471-1504 ；Ma HL, Qi XR, Maitani Y, Nagai Τ.Int. J. Pharm. (2007)333 :177-186 ；Thorek DL,Chen AK,Czupryna J,TsourkasA. Ann. Biomed. Eng. (2006)34 :23-38 ；Babes L,Denizot B, Tanguy G, Le Jeune JJ, Jallet P.J. Colloid Interface Sci. (1999)212:474—482)。本发明的微米和/或纳米颗粒可以采用几种形式。在一个实施方案中，颗粒是由 活性剂制得的固体均勻颗粒。在另一个实施方案中，这些固体颗粒覆盖惰性材料，如聚乙烯 亚胺(PEI)或葡聚糖。本发明的组合物和方法中所用的活性剂包括治疗和成像剂，包括但不限于蛋白质、RNA、DNA、螯合功能、放射性化合物、铁磁化合物、超顺磁复合物、小分子及其 组合。活性剂的其他实例包括氧填充分子，其在受辐射时变成自由基。恶性肿瘤常常比其 正常的组织对应物具有更低的氧水平，并且通过辐射杀灭肿瘤细胞的主要机理是细胞毒性 自由基的形成，即，含有高度反应性自由电子的化学物质。活性剂更多的其他实例包括，但不限于，核酸，如RNA、DNA、蛋白质或肽(酶、抗体 等)、病毒、细菌、小有机化合物(例如，单体)、合成的和半合成的聚合物、纳米颗粒、螯合的 金属和离子等。根据特定的治疗目的或方法，这样的化合物可以具有任何合适的功能或活 性，包括但不限于抗微生物、抗细菌或抗病毒活性；凝血或抗凝血活性；报道或可检测的活 性等。可以与血小板偶联以产生本发明的活性剂的化合物的更多其他实例包括，但不限于， 血管活性药、抗氧化剂、抗血栓药、抗癌药、抗动脉粥样硬化药、抗有丝分裂药、抗血管生成 药和抗增殖化合物。在本发明的一个实施方案中，活性剂是抗病毒化合物。可以使用任何合适的抗病 毒化合物，包括但不限于唾液酸类似物、金刚胺、金刚乙胺、叠氮胸苷、阿糖腺苷、碘苷、三氟 尿苷、磷酸胆碱钙等。在一个实施方案中，抗病毒化合物是嘌呤核苷类似物，其实例包括但 不限于无环鸟苷、去羟肌苷、病毒唑、更昔洛韦和阿糖腺苷，以及反义核苷，RNA和DNA。在本 发明的一个实施方案中，将携带装载抗病毒化合物的颗粒的血小板以足以治疗病毒感染的 量给予患有病毒感染的患者。在一个实施方案中，患者感染了出血热病毒，如丝状病毒科、 沙状病毒科、布尼亚病毒科或黄病毒科的病毒。颗粒的活性剂还可以是药物凝血蛋白，如因子VII，因子IX，因子X，因子XII，蛋 白C，蛋白S，凝血酶原，抗凝血蛋白，如活化蛋白C，蛋白S，肝素和类肝素，以及爬行动物或 昆虫来源的促-或抗-凝血蛋白，以及其他。这样的化合物是已知的。例如，可以用于本 发明实施中的因子VII或因子VIIa(该术语包括修饰的因子VII或因子VIIa或因子VII 类似物，其保留因子VII的凝血活性)特别描述于美国专利Nos. 6，461，610 ；6, 132，730 ； 6，329，176 ；6，183，743 ；6，186，789 ；5，997，864 ；5，861，374 ；5，824，639 ；5，817，788 ； 5，788，965 ；5, 700,914 ；5，344，918和5，190，919。在一个实施方案中，优选重组人因子 Vila。在本发明的另一个实施方案中，将携带装载凝血蛋白的颗粒的血小板以有效促进伤 口部位凝血和/或伤口愈合的量给予带有伤口的患者。欲在本发明的颗粒中携带的核酸可以编码可检测的蛋白质或肽，如Lac-Z，β-葡 糖苷酸酶，辣根过氧化物酶，荧光蛋白，如绿色荧光蛋白等。在本发明的一个实施方案中，将 携带编码可检测蛋白的核酸的颗粒以在血管中的动脉粥样硬化组织或斑中有效表达可检 测蛋白的量给予患者，因此产生改良的动脉粥样硬化的动物模型。这样的动物(其优选是 通过饮食和/或饲养易患动脉粥样硬化的动物)可以给药推定的抗动脉粥样硬化化合物， 和/或抗动脉粥样硬化饮食，然后与没有给药推定的抗动脉粥样硬化化合物和/或抗动脉 粥样硬化饮食的对照动物相比较，通过观察由可检测蛋白表达显示的斑来比较实验动物相 对于对照动物的动脉粥样硬化斑形成的程度。在本发明的其他实施方案中，核酸可以编码 治疗性蛋白或肽。实例包括，但不限于，编码抗动脉粥样硬化蛋白或肽的核酸，如编码ras 效应物蛋白RGL2 Wras结合结构域(RBD)的DNA (例如，用于抑制增殖)，编码内皮一氧化 氮合成变体的DNA (例如，用于抑制血小板功能)、编码NF-KB超-阻抑物的DNA (例如，用于 抑制炎性过程)。
9
本发明的微-和纳米颗粒对于各种用途可以是金属性的，如回声检测。或者， 微-或纳米颗粒可以是铁磁的、顺磁的或超-顺磁的，如超-顺磁氧化铁纳米颗粒。超-顺 磁氧化铁纳米颗粒的一个实例是FERI DEX(ferumoxides注射溶液)，可从Bayer购得。这 样的铁磁颗粒可以用外部应用的电磁场来操纵(通过包括但不限于洛伦茨力、磁致伸缩、 铁磁共振及其组合的机理)，用于产生热(低温疗法)或声学信号。还可以使用外部应用的 电磁场或磁共振来操纵铁磁颗粒，如氧化铁颗粒，钆颗粒，磁铁粒或其他已知磁性材料，用 以产生热或声学信号。这样引入的物理力是有用的，因为它们允许血小板-颗粒体系破裂 的机械移动和细胞干扰，以及局部组织床中凝血的诱导。例如，SPIO(超顺磁氧化铁)纳米 颗粒可以接受铁磁共振频率的调幅微波场，以产生声学和/或热响应。本发明的这个方面 在用于人和动物的医学诊断目的的体内成像中特别有用，特别是如果结合FDA批准的磁共 振成像剂使用。多糖覆盖的超顺磁氧化物胶体，如美国专利No. 5，262, 176中公开的，也可 以用于本发明中。可以使用本领域已知的常规技术将活性剂掺入微-或纳米颗粒中，如用化合物覆 盖活性剂颗粒。或者，颗粒自身可以是活性剂的固体球。血小板优选是新鲜的，并且可以来 自任何来源，如个体，或来自贮存的储备。一种有用类型的血小板是冻干的血小板，或再水 合的冻干(RL)血小板。可以用固定剂(如甲醛或多聚甲醛)将这些血小板固定。再水合冻 干血小板来源的一个实例是 STASIX (可获自 Entegrion，Inc.，Research Triangle Park, NC)。通过以下方法为血小板装载本发明的微-或纳米颗粒将血小板和颗粒混合，并将两 者在血浆或选定的介质中培养限定的时间段，因此通过吞噬作用的天然机制和/或与血小 板的先天性免疫功能相关的闭合使血小板吸收微米和/或纳米颗粒。在备选的实施方案 中，如果在纳米颗粒中的天然吸收没有发生，则可以通过连接物将微米和/或纳米颗粒共 价或非共价地连接到表面膜上。然后使用方法(包括但不限于差速离心、密度梯度离心、大 小排阻色谱、亲和性色谱、淘析、电泳及其组合)将血小板与胞外(未掺入的)微米和/或 纳米颗粒分离。根据本发明的备选实施方案，可以从患者中分离血小板，装载微米和/或纳米颗 粒，然后输回到患者中用于治疗和/或成像应用。在另一个实施方案中，可以从患者中分离 装载的血小板，装载微米和/或纳米颗粒，然后输回到另一个患者中用于治疗和/或成像应 用。在另一个实施方案中，血小板通常是来自单一供体或供体集合的液体贮存血小板，装载 微米和/或纳米颗粒，然后输回到一个或多个患者中用于治疗和/或成像应用。在另一个实 施方案中，血小板取自单一供体或来自单一供体或供体集合的正常液体贮存的血小板，装 载微米和/或纳米颗粒，然后低温保存，用于输回到一个或多个患者中用于治疗和/或成像 应用。在再一个实施方案中，血小板取自单一供体或来自单一供体或供体集合的正常液体 贮存的血小板，装载微米和/或纳米颗粒，然后根据已知的技术将装载的血小板固定，如美 国专禾Ij No. 4，287，087 ；5，651，966 ；5，902，608 ；5，891，393 和 5，993，084 中所述的，冷冻和 冻干。通常，这样的方法包括使所述人血小板与固定剂(例如，醛)接触，持续足以固定所述 血小板的时间；从血小板除去所述固定剂；然后将血小板干燥，以产生具有装载的微米和/ 或纳米颗粒的固定-干燥的血小板。将所得到的冷冻干燥治疗剂再水合，然后输回到一个 或多个患者中用于治疗和/或成像应用。血小板优选移动至所需的目标部位，例如，形成血 栓的表面(例如，伤口组织、血管斑、发炎部位等)。优选，每个血小板含有约1至约10，000个颗粒，更优选约100至约1，000个颗粒。最近的研究证明血小板容易使不同类型的微米和纳米大小的颗粒内在化。这些吸 收现象可能与血小板从体循环中清除小颗粒的作用相关。与模型病毒一起培养血小板导致 纳米大小的病原体内在化至血细胞中。相似地，将细菌加入富含血小板的血浆中导致明显 的细菌内在化U。血小板使微米和纳米大小颗粒内在化的机理还不清楚，并且颗粒转移至 血小板中的最终部位也了解的不多。用细菌培养后的血小板透射电子显微镜(TEM)分析表 明病原体吸留在连接开放微管系统的表面中。这些导致血小板“盖细胞(covercytes) ”的 禁锢(terming)1’2。根据情况，存在纳米颗粒可以转运到内部血小板细胞器(如溶酶体、α 颗粒或致密颗粒)中的可能性。这些结果表明血小板在从血液中清除病原体中起着先天性 免疫作用，并且这些功能可以用来指引纳米颗粒进入这种血细胞中。可以从这些细胞怎样与外源表面相互作用的知识收集涉及纳米颗粒的血小板吸 收的机理的线索。假定血小板对外源表面的响应以三个阶段发生最初血浆蛋白的快速吸 附，吸附的血浆蛋白的构象变形，然后通过血小板表面受体的功能反应，这是吸附的蛋白的 构象改变的结果(对于综述，参见Fischer等3)。这些事件对于纤维蛋白原可能是最好的 了解，其行为类似用于血小板的“生物传感器”。使用玻璃4和基于烃聚合物的材料5_7的实 验表明纤维蛋白原以变形的构象结合，然后与血小板整联蛋白相互作用。目前对整联蛋白 从外到里信号传导过程的理解表明整联蛋白结合到吸附的类似纤维蛋白的纤维蛋白原分 子上的结构域上，然后在血小板膜上聚簇，以组织细胞骨架相关的信号机制，用于从外到里 信号的激活8。基于将用这些蛋白标记的IgG、纤维蛋白原和小的金纳米颗粒转运至α颗粒 的观察9，可以假定一些类型的结合IgG和/或纤维蛋白原的纳米颗粒可能被转移至α颗 粒。对导致引导纳米颗粒到表面相关的开放微管系统中而没有内在化的因素还不了解，对 于一些病原体来说情况明显是这样1A然而，如果将纳米颗粒优化，合乎逻辑的是推测可能 涉及Fc-和补体受体系统。预期对这些机理更复杂的理解可以提高我们用内在化的成像和 治疗颗粒工程化血小板的能力。本发明的装载纳米颗粒的血小板可以具有重要的医学用途。全身灌输时，血小板 定位于伤口部位，它们在此可提供止血，并且在伤口愈合过程中最终由巨噬细胞吞噬。或 者，通过网状内皮细胞(RES)的巨噬细胞从自由循环中清除灌输的细胞。因此，本发明的血 小板可以作为载体(特洛伊木马)，其可以在血管损伤部位和在巨噬细胞中集中治疗和成 像剂。本发明的其他用途和应用包括医学或兽医诊断，超声波，核或红外成像，伤口或肿瘤 定位，放射性肿瘤学，以及治疗用途，例如，前列腺和乳房中的肿瘤切除，和凝血疗法。本发明克服了现有技术的一些实际问题。尽管血小板是用于将指引的能量转导剂 递送至前列腺肿瘤中失去稳定的脉管系统中的合理载体，但是收集和贮存血小板的逻辑问 题使得血小板的这种应用变得困难。除了利用率和无菌性的问题，由于贮存损伤，目前通 过血库系统提供的血小板产品在功能上是不可靠的。患者自身的血小板对于自体的“arm back to arm”治疗可能是有用的，但是预期患者亚群中与血小板减少和血小板机能不全相 关的继发性健康问题会限制这种方法。本发明的研发，作为基于血小板的冻干产品，消除了 这些限制。实施例通过以下实施例进一步详细地描述本发明。所有份数和百分比均以重量计，并且 所有温度均为摄氏度，除非另外明确指出。实施例1 颗粒的吸收在此用实验证明了血小板通过天然机制吸收微米以下大小颗粒的能力，所述实验 使用聚乙烯亚胺(PEI)纳米颗粒和葡聚糖覆盖的超顺磁氧化铁(SPIO)纳米颗粒。通过与 绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA —起培养PEI来制备基于PEI的纳米颗粒，获得一群大约 200-400nm的纳米颗粒(图1)。将所得到的纳米颗粒加入到新鲜制备的人富含血小板的血浆中，按照别处所述的 使用柠檬酸盐抗凝剂“1’11，并使其在室温下摇摆培养两小时。然后通过在2000xg下将细 胞离心十分钟从过量纳米颗粒中分离出血小板，然后使血小板接受在柠檬酸盐化的盐水 (3.75mM柠檬酸盐，146mM NaCl, pH = 7. 4)中的再一次离心洗涤。然后使用标准方法1(iai 对血小板进行透射电子显微镜观察。该分析(图2、显示出大部分血小板(参见图A)含有 一个或多个PEI/DNA纳米颗粒，并且该纳米颗粒包含在具有附带双层膜的内部结构中(参 见图B和C)。实施例2 =SPIO纳米颗粒的内在化还研究了血小板内在化SPIO纳米颗粒的能力。按照使用PEI纳米颗粒研究所 述的分离血小板，然后用SPIO-纳米颗粒培养，该颗粒由覆盖葡聚糖(FERIDEX，从Bayer Healthcare购得)的 IOnm铁磁氧化铁核心组成，这是由美国FDA批准用于磁共振成像显 影的灌输级产品。将SPIO产品以1/10稀释至富含血小板的血浆中，并摇摆培养12小时。 然后将混合物随密度梯度分层，并在2，OOOxg下室温离心10分钟。从分界面收集装载SPIO 纳米颗粒的血小板，用柠檬酸盐化的盐水稀释，并在2，OOOxg下室温离心10分钟。按照对 PEI所述的，用透射电子显微镜检测最终的SPIO血小板。和PEI的情况相同，SPIO纳米颗 粒集中在具有双层膜的内部空间中，双层膜很可能是表面相关的开放脉管系统(图3)。纳 米颗粒通过磁引力自组织成聚集物。该实施例说明本发明在用于人和动物体内的医学诊断 目的的体内成像中的效用。实施例3 用于伤口部位成像的超-顺磁血小板颗粒这些实验的目的是使用用于携带用于定向能量吸收的超顺磁氧化铁(SPIO)纳米 颗粒的血小板基颗粒递送成像能力并在内部出血点提供止血。两个进展为本发明提供了基 础。首先，已经发现血小板容易使磁性SPIO纳米颗粒内在化(如上所示)。其次，利用用于 处理血小板的相同冷冻干燥方法，血小板作为用于止血的灌输剂，SPIO标记的血小板可以 冷冻干燥来获得装载SIPO的颗粒。结果是血小板基产品原则上可以在内部伤口部位操作， 使用外部磁场来产生声学和热能量。本发明者认为使用外部磁场，可以使用各种可用的超 声波和热成像方法在内部出血点使装载SPIO的颗粒成像，并可以操纵以提供止血。本发明者已经发现了血小板以强烈的方式使特定类型的超顺磁氧化铁纳米 颗粒内在化。用新鲜分离的人富含血小板的血浆将FERIDEX(从Bayer Healthcare Pharmaceuticals)培养十二小时，FERIDEX由具有葡聚糖涂层的 IOnm超顺磁氧化铁核组 成。通过将混合依据密度梯度分层、离心和从介质-血浆分界面取出血小板，将血小板与过 量的显影剂分离。然后将装载!^eridex的血小板接受醛稳定化并冻干来获得冻干的产品，在此称为SPI0-STASIX颗粒。图4显示了使用透射电子显微镜观察，FERIDEX纳米颗粒(参 见箭头)内在化，在表面相关的开放脉管系统中形成聚簇。STASIX颗粒中的SPIO纳米颗粒 自组织形成具有矩形横截面的结构。在FERIDEX的自由悬浮液或血小板之间的空间中，没 有观察到这些类型的结构，这可能是通过最接近的邻近磁偶极子相互作用得到了稳定。暴露于磁场时，发现SPI0-STASIX颗粒经历了强烈的激活响应，用于聚集物的形 成。在图5所示的透射电子显微照片中证明了该结果，其中将血浆中装载氧化铁的颗粒接 受0. 6Testla场三十秒钟。所得到的SPI0-STASIX颗粒高度聚集，并呈现出激活的形态学。 这种类型的观察结果，在使用60Hz振荡磁场时也出现了该观察结果(数据未显示)，提供了 可以在伤口部位调节SPI0-STASIX颗粒来提供止血的证据。尽管不希望受到任何特定理论的束缚，但是血小板可以吸收氧化铁纳米颗粒的观 察不是前所未有的。已经注意到血小板吸收几种类型的颗粒物质，包括碳，乳胶和阳离子铁 蛋白，用纤维蛋白原和IgG衍生的胶体金，模型病毒和细菌也被充分证明。细菌被吸留在表 面相关的开放脉管系统中。这些观察表明血小板起着比广泛认知的更重要的先天性免疫作 用(宿主防御)，并且SPIO纳米颗粒通过这组免疫性机制得到累积。已经证明氧化铁纳米颗粒作为动物和人用途中的灌输治疗是安全的。与许多类 型的由于毒性成分的存在而潜在不安全的纳米颗粒相反，由于身体贮存和转运大量铁的能 力，铁基纳米颗粒具有良性安全性特征。Feridex 是由美国FDA批准作为MRI显影剂，用 于与网状内皮系统相关的肝脏损伤成像的T2增强。灌输至人时，Feridex 纳米颗粒通过 网状内皮系统可测量地从血液中清除，然后从第二天开始逐渐转化为血清铁。到给药后第 七天，血清铁水平已经恢复正常。这些结果与规范的铁代谢循环的更新相一致。SPIO的物理特性导致使用外加电磁场诱导内部声学、热和止血响应的可能性。由 于氧化铁核心中声音速度的差异，已经发现SPIO纳米颗粒是产生回声的，并因此可使用超 声波检测。相似地，由于与每个超-顺磁核心相关的磁偶极子，因此可以用电磁场操纵SPIO 颗粒。这种特性成为SPIO颗粒作为MR成像松弛显影剂用途广泛使用的基础。还可以使用 无线电频率电磁场(无线电波或微波的形式)操纵SPIO纳米颗粒，以产生用于体内温热治 疗的声或热。因为未配对狗电子的旋转倾向于排列，氧化铁是铁磁材料。在大于数十纳米 的氧化铁颗粒中，旋转在微结构域(Weiss结构域)中排列；邻近的微结构域很可能具有反 平行排列，并且出于热动力学观点，结构域的分界面(Bloch壁)是需要代价的。较小的氧 化铁纳米颗粒，如i^eridex 核，是“超顺磁的”，因为由于在小颗粒中形成Bloch壁分界面的 高热动力学成本，在较小的氧化铁纳米颗粒中排列的未配对的狗电子的单个结构域是有 利的。在原则上，这些独特特性的结果是SPIO纳米颗粒可以被诱导以经历振动机械运动， 使用外加的电磁场，用于声学信号产生。本发明使用STASIX颗粒中SPIO的声和电磁场调 节之间的相互作用来产生更灵敏的成像形式。可以在前列腺恶性肿瘤中将SPIO纳米颗粒成像，使用热(用近场RF或微波诱导 的)、超声波(内在或诱导的共振)或MRI成像形式。在一个实施方案中，电磁场，如无线电 波或微波，可以用来调节SIPO颗粒，来形成声学信号或热。存在三种潜在的机制，通过其， 可以用电磁场调节SPIO纳米颗粒，以产生声学信号。第一种机制是洛伦兹力。在此，所用 电磁场的磁性成分可以直接偶联于SPIO纳米颗粒的磁偶极子力矩，产生用于排列和吸引 纳米颗粒的力(洛伦兹力)。如果所用的电磁场是电磁辐射，那么SPIO颗粒将以辐射的频率振动，并且纳米颗粒将通过在某些方面类似扬声器怎样工作的机制以辐射的频率产生声 学信号。第二种方法是磁致伸缩。在此，电磁辐射场以振动方式扭曲氧化铁纳米颗粒的物 质结构(磁致伸缩)，因此产生声学信号。磁致伸缩效应(在用于产生超声波的设备中以 宏观规模使用)也可用SPIO纳米颗粒以微观规模工作。第三种机制是铁磁共振。在此，微 波(GHz)电磁辐射可以驱动未配对！^电子旋转-旋转状态转换，用于铁磁共振。与对纳米 颗粒的洛伦兹力和磁致收缩效应(其可以以传统材料机械术语来描述)相反，铁磁共振基 本上是量子过程。磁性纳米颗粒的铁磁共振表示用于将电磁辐射场强烈结合机械运动的机 制，该机械运动用于产生热，如果辐射是连贯的，如通过MASOR产生的，机械运动还用于产 生超声波。此外，如果铁磁共振频率的微波场是调幅的，SPIO纳米颗粒将产生调制频率的 声音。洛伦兹力、磁致伸缩和铁磁共振怎样导致从SPIO纳米颗粒产生热和声音的理论方面 是非常确定的。在“完整器官”脐带模型中使用SPI0-STASIX进行实验，以开始更好地理解体内条 件下血小板相连的SPIO纳米颗粒的产生回声特性。简而言之，将获自正在经历非急需进行 的剖腹产术的健康供体的脐静脉系紧进入循环回路中。将从压缩红血球和冷冻的血浆配制 的仿制血液通过回路循环，同时用B-模式超声波成像。将1. Oml推注的SPIOSTASIX/μ 1 直接灌输脐带上游，同时成像。图6描绘了 SPIO标记的细胞通过未受损伤的静脉的自由运 动。图A、B和C各自描绘了使用单独的盐水、盐水+气泡和盐水+推注的SPI0-STASIX颗 粒(红色箭头)的脐静脉。图C中的绿色箭头是气泡。进行了更多的实验来确定是否可以用超声波来检测SPI0-STASIX颗粒为血纤维 蛋白凝块的成分。将SPI0-STASIX与不同稀释度的血浆混合，然后通过加入1. 0单位/ml 凝血酶来形成血块。然后将得到的血块置于琼脂糖平板上，并用磁共振和B-模式超声波成 像。图7显示了可以用MR和B-模式超声波检测跨过生理学相关浓度范围的装载氧化铁的 颗粒。实施例4 使用装载超-顺磁氧化铁的颗粒的抗癌治疗这些实验的目的是研发提高的定向能量传递方法，用于成像、组织切除和前列腺 肿瘤治疗的治疗剂释放。将人前列腺肿瘤切除组织植入免疫受损小鼠的肋腹，给小鼠供应了超生理浓度的 雄激素。在这些条件下，异种移植组织增殖，并且所得到的肿瘤产生脉管系统，超过90% 的内皮具有人类特点。此外，保持了在人前列腺组织中观察到的内皮细胞混乱的星状结 构。和使用人雄激素切除治疗情况的相同，停止激素导致内皮的大规模凋亡，使得肿瘤脉 管系统大规模的不稳定。从新鲜的人血小板用多聚甲醛稳定来制备固定的干燥血小板 (Read,M. S.等，Preservation of hemostaticand structural properties of rehydrated lyophilized platelets :potential for long-term storage of dried platelets fortransfusion(再水合的冻干血小板的止血和结构特性的保持用于输血的干燥血小板 长期保存的可能)，Proc Natl Acad Sci USA 92，397-401 (1995))，并且用绿色荧光剂标 记)，并用绿色荧光CMFDA染料标记。这些固定的-干燥的血小板也可以以商品名Masix /A Entegrion, Inc. (Research Triangle Park, NC)购得。用人前列腺组织制备小鼠，然后 停止雄激素。在雄激素去除之前或两天后，灌输推注剂量2. OxlO9绿色荧光Masix 颗粒/ 小鼠。将动物处死，然后取出前列腺肿瘤和其他组织，并制备用于组织学分析。
图8描绘了失去稳定后肿瘤脉管系统中的绿色荧光血小板治疗剂(参见左图中的 箭头)。在雄激素取出之前，在肿瘤组织(右图)，或肺、肝脏或心脏组织中(数据未显示) 没有注意到Masix 颗粒。图9是雄激素停止和绿色荧光STASIX灌输后来自前列腺肿瘤 共焦图像的3D重建。在用于人内皮细胞，尤其是肿瘤脉管系统共同追踪的橙色荧光标记的 附近观察到STASIX颗粒。实施例5 具有内在化纳米颗粒的血小板的制备聚乙烯亚胺(PEI)，作为聚阳离子，已经广泛用于凝集cDNA，用于细胞培养物和体 内的基因转染目的。本发明者利用了 PEI与大小范围非常不同的聚阳离子(从小分子如病 毒唑三磷酸盐至大分子如cDNA)形成高度浓缩的纳米颗粒结构的能力。以下部分中呈现了 该方法的两个实例，其涉及PEI与病毒唑核糖寡核苷酸和DNA质粒的聚集，血小板内在化， 然后递送至组织培养物中的巨噬细胞。
_0] (A)PEi-mmmm-Mm^mm^mm^At如图10中所述的，PEI与八残基病毒唑核糖-寡核苷酸稠合。可以在温和条件下 用成像部分(例如，荧光团或MRI试剂)和/或用于连接的官能团(例如，生物素，his6)标 记PEI的伯胺。图10描绘了 PEI与含有两个病毒唑残基和3’-端FITC荧光团的八-基体 核糖-寡核苷酸聚集时，IOOnm至300nm球形颗粒的透射电子纤维照片。发现血小板容易使PEI-基纳米颗粒内在化。图11中描绘的透射电子纤维照片显 示出表面相关的开放微管系统中的PEI/病毒唑核糖-寡聚物纳米颗粒。低功率下大量血 小板的检测(数据未显示)证明了实际上所有血小板含有一个或多个PEI纳米颗粒。连接 开放维管系统表面中的PEI/阳离子纳米颗粒的位置与使用SPIO纳米颗粒观察到的相似， 表明在纳米颗粒吸留事件中涉及血小板的先天性免疫功能。(B)基因转移至巨噬细胞以下的研究证明了 cDNA-纳米颗粒生物工程化的血小板可以将基因转移至组织 培养物中的巨噬细胞中。在用于实验的基因转移部分的准备中，通过不影响转录的连接用 Cy3将绿色荧光蛋白cDNA标记。然后通过以上所述的方法将红色荧光cDNA与PEI稠合，以 获得PEI/cDNA纳米颗粒。图12描绘了细胞已经将纳米颗粒内在化之后，生物工程化血小 板的荧光显微镜图像和流式细胞计数特征。基因表达实验利用了使用密度梯度方法从人外周血分离的单核细胞。使用供体特 异性介质使单核细胞分化成巨噬细胞，然后用GFP-纳米颗粒血小板将先天性免疫细胞培 养12小时。再一个M小时阶段后，检测培养物的显微镜荧光，以测定巨噬细胞中是否存在 Cy3-标记的cDNA (红色荧光)和是否表达了 GFP (绿色荧光)。进行合适的阴性对照来证 明巨噬细胞和/或血小板内在荧光没有影响实验分析。结果显示于图13中。该分析的主 要结果是几乎所有巨噬细胞使血小板内在化，并且超过一半表达了 GFP基因。实施例6 含有表面附着的病毒哔的血小板的制备以与别处所述的正常Masix 颗粒制造方法相似的方式来制备病毒唑生物工程 化的Masix 颗粒。将细胞与过量血浆蛋白分离，然后接受醛稳定化。然后用膜不通透性 NHS生物素类似物将表面膜生物素化。用过量抗生物素蛋白([抗生物素蛋白] >> [生物 素])培养生物素化的血小板，并冻干。SDS-PAG电泳(与抗生物素蛋白标准品一起，数据未 显示)证明了每个血小板结合6. 7百万抗生物素蛋白分子。将抗生物素蛋白化的Masix 颗粒再水合并用含有两个病毒唑碱的病毒唑核糖寡核苷酸(5’ -生物素’ UUU-病毒唑-病 毒唑-UUU-FITC-3’)、用于追踪的绿色荧光团和用于偶联的生物素培养。发现核糖寡核苷 酸在数秒内反应，与抗生物素蛋白化的血小板形成紧密的复合物。荧光显微镜检查(参见 图14)证实了病毒唑探针连接血小板。该图的右图中呈现的流失细胞计数滴定表明表面系 锁的抗生物素蛋白以大约均一的分子比例结合核糖寡核苷酸，该比例为13. 5百万病毒唑 部分/血小板。以以上所述的cDNA纳米颗粒巨噬细胞吞噬作用实验类似的方式来测定单核细胞 内在化病毒唑缀合的Masix 颗粒的能力。用病毒唑-缀合的Stasix 颗粒培养单核细 胞12小时，然后用共焦显微镜检查来检测。该分析(参见图1 显示出单核细胞内在化血 小板。在该图中，箭头指向几个没有内在化的血小板。选定细胞的三维共焦重建(数据未 显示)揭示大部分单核细胞内在化五至二十个装载的STASIX颗粒。基于每个单核细胞的 内在体积和每个血小板上的核糖寡核苷酸数量，一个血小板由单个单核细胞的内在化导致 21 μ Molar的局部胞内病毒唑浓度。因此，如果几个血小板被吞噬，获得大大超过在组织培 养系统中用病毒唑测量的IC-50的内部病毒唑浓度。_仿丨丨7 :/丨、·泡劍血應锁:如果治疗性纳米颗粒内含物对醛固定敏感，可以在醛固定和冷冻干燥后，使用以 下类型的表面膜连接策略来将纳米颗粒连接血小板。使用小单层泡囊(SUV)纳米颗粒， 通过以下实验证明了该方法的实用性。按照别处详述的(Fischer，Τ. Molecular Crystal Liquid Crystal 102，141-145 (1984)，通过将磷脂和去污剂辛基糖苷的混合胶束快速稀释 至最终去污剂水平低于关键胶束浓度(对于辛基糖苷未25mM)来形成磷脂SUV (图16)。对 于这个实验，双层含有用于追踪的红色荧光PKH染料，并用生物素共价修饰磷脂酰乙醇胺 的伯胺。通过标准制造程序制备STASIX颗粒，除了一个例外；在醛固定步骤后，用NHS-生 物素类似物共价修饰表面膜的外侧。然后将生物素化的STASIX颗粒与摩尔过量的抗生物 素蛋白反应，以获得抗生物素蛋白化的膜。将颗粒接受SDS-PAG电泳和密度扫描(连同含 有已知含量抗生物素蛋白的泳道)来计算抗生物素蛋白数量/血小板；每个冷冻干燥的细 胞含有 七百万抗生物素蛋白。随后将生物素化SUV与抗生物素蛋白化的Masix 颗粒 混合，以将泡囊连接表面膜。图17描绘了红荧光SUV与表面膜的连接。透射电子纤维照片 显示了外部表面膜上的SUV(箭头所示)。已知TEM切片的厚度和细胞的圆盘状，在该实验 中，每个Masix 颗粒与三十至六十个SUV连接。该实验证明用生物素-抗生物素蛋白桥 方法，纳米颗粒可以容易地结合生物工程化血小板的表面。实施例8 治疗剂递送至动脉粥样硬化斑本发明可以用于将治疗剂递送至血管受伤部位。该能力显示于图18中。在该研 究中，高胆固醇血症猪，其中给予高胆固醇饮食三个月，以诱发动脉粥样硬化斑形成。将股 动脉的Icm片段结扎，然后在盐水中灌注含有Lac Z基因的AAV构建体。一个小时后，除去 AAV介质，并将动脉重新打开，用于循环。一个月后，将血管分离并通过组织学分析Lac Z基 因产物活性。在动脉粥样斑中选择性地表达AAV转导产物。实施例9 用定向能量传递的前列腺肿瘤成像和止血(A)人前列腺组织的初级异种移植物的制备
16
外科切除的前列腺组织的新鲜切片的初级异种移植物的建立是常规实验方案。简 而言之，将八周大的免疫受损小鼠(SCID或Nu/Nu)阉割，并在移植人组织之前的3-7天植 入持续释放的睾酮丸。在外科手术过程中在中断器官血液供应的2小时内，通过组织学证 实并接受了来自根治性前列腺切除术(前列腺癌)或膀胱前列腺切除术(良性前列腺)的 新鲜人组织。将前列腺组织立即置于冰冷器官保存液中(例如，ViaSpan )，并转运用于移 植至准备好的免疫受损宿主中。将八个独立的组织片皮下植入每只小鼠中(每侧四片)， 并使动物持续四周，用于建立异种移植物。从历史看，所有新鲜移植的异种移植物大约有 80%成功建立，通过异种移植物的人血管网络与小鼠宿主的脉管系统在异种移植物的外周 处吻合来标记。在移植后的最初十四天中，与移植前的组织相比，异种移植物内人脉管系统 的微血管密度提高>5-倍。在四周后的任何时间，将小鼠宿主阉割(除去睾酮丸)，选择 性地诱导人内皮细胞中的凋亡波，在阉割后的2天达到峰值，并在阉割后的5-7天回到基线 水平。已经确定前列腺异种移植物对移植的血管生成响应和由于阉割所引起的人脉管系统 的血管退化是在所有分析的样本中一致地发生了并且不是患者特异性响应。比较了第0天 (无颗粒定位)和第2天(最大颗粒定位)存在的稳定脉管系统之间颗粒与特异性损伤内 皮层的结合。(B)定位的直接成像用低、中等和高水平的SPI0-STASIX颗粒灌输小鼠宿主，并用B-模式超声波和MRI 监控。如下将动物分组3，000 SPI0-STASIX/1血液体积第0天3只小鼠和第2天6只小鼠10, 000 SPI0-STASIX/1血液体积第0天3只小鼠和第2天6只小鼠30，000 SPI0-STASIX/1血液体积第0天3只小鼠和第2天6只小鼠在阉割前的第0天，给每个处理组三只小鼠灌输每个浓度的SPI0-STASIX颗粒，在 阉割后第2天，六只小鼠灌输每个浓度的SPI0-STASIX颗粒。给动物灌输颗粒，使血小板循 环四十五分钟，并使动物成像。成像后，将动物安乐死，收集移植物，并准备用于组织学分析 和异种移植物/湿重组织内铁含量的定量。用B-模式的超声波和声辐射力脉冲(ARFI)脉冲序列监控动物。然后将小鼠接受 MR成像，两个已登记的成像序列设计用来提供登记的解剖学标志和对铁纳米颗粒存在改善 的敏感性。使用51h51h64的各向异性成像矩阵获取3D扩散加重投影编码的图像。设计 来提供对局部场异质性改善的敏感性的相同序列的变化(T2*敏感性)可以用来检测纳米 颗粒。体内研究结束时，进行异种移植物的MR组织学来提供更高空间分辨率3D图像组，用 于肿瘤几何学程度的更完整量化和纳米颗粒的定位。使用之前已经描述并且是本领域已知 的上述3D编码方法，在9. 4T进行对灌注固定样本(原位固定)的工作。MR组织学后，将宿 主动物处死；收集异种移植物，固定，包埋和切片；进行荧光和透射电子显微镜检查。(C)定向能量传递将动物置于红外摄像机和电磁近场源之间，将超声波转换器直接接触动物的皮 肤。在SPI0-STASIX颗粒灌输之前和灌输后45分钟，应用无线电频率，用于通过洛伦兹力 介导的机制产生热和/或声响应。还应用了用于诱导铁磁共振的微波场来进行了该实验。 监控动物诱导的热和声音信号。如下，在低、中等和高SPI0-STASIX颗粒浓度下评价六个动 物组。
权利要求
1.含有微米或纳米大小颗粒的血小板，所述微米或纳米大小的颗粒含有活性剂。
2.权利要求1的血小板，其中所述血小板含有哺乳动物血小板。
3.权利要求1的血小板，其中所述血小板含有人血小板。
4.权利要求1的血小板，其中所述微米或纳米大小颗粒由选自天然和合成聚合物、树 枝状骨架、小分子聚集物、铁磁物质、磷脂泡囊、胶束及其组合的材料制得。
5.权利要求1的血小板，其中所述活性剂是选自蛋白质、RNA、DNA、螯合剂、放射性化合 物、铁磁化合物、超顺磁复合物及其组合的物质。
6.权利要求1的血小板，其中所述活性剂包含抗病毒剂。
7.权利要求1的血小板，其中所述活性剂包含凝血蛋白。
8.权利要求1的血小板，其中所述活性剂包含抗凝血蛋白。
9.权利要求1的血小板，其中所述活性剂包含核酸。
10.权利要求1的血小板，其中所述活性剂是超-顺磁氧化铁纳米颗粒。
11.一种药物组合物，其含有药物学上可接受的载体和含有微米或纳米大小颗粒的血 小板，所述微米或纳米大小的颗粒含有活性剂和药物学上可接受的载体。
12.权利要求11的药物组合物，其中所述血小板含有哺乳动物血小板。
13.权利要求11的药物组合物，其中所述血小板含有人血小板。
14.权利要求11的药物组合物，其中所述微米或纳米大小颗粒由选自天然和合成聚合 物、树枝状骨架、小分子聚集物、铁磁物质、磷脂泡囊、胶束及其组合的材料制得。
15.权利要求11的药物组合物，其中所述活性剂是选自蛋白质、RNA、DNA、螯合剂、放射 性化合物、铁磁化合物、超顺磁复合物及其组合的物质。
16.权利要求11的药物组合物，其中所述活性剂包含抗病毒剂。
17.权利要求11的药物组合物，其中所述活性剂包含凝血蛋白。
18.权利要求11的药物组合物，其中所述活性剂包含抗凝血蛋白。
19.权利要求11的药物组合物，其中所述活性剂包含核酸。
20.权利要求11的药物组合物，其中所述活性剂是超-顺磁氧化铁纳米颗粒。
21.权利要求11的药物组合物，其中所述载体是无菌载体。
22.权利要求11的药物组合物，其中所述载体是固体载体。
23.权利要求11的药物组合物，其中所述载体是液体载体。
24.权利要求11的药物组合物，其中所述载体是含水载体。
25.将血小板递送至患者体内的目标部位的方法，所述血小板含有微米或纳米大小颗 粒，该颗粒含有活性剂，该方法包括下列步骤提供权利要求1的血小板；和 将所述血小板给予患者。
26.权利要求25的方法，其中所述血小板含有哺乳动物血小板。
27.权利要求25的方法，其中所述血小板含有人血小板。
28.权利要求25的方法，其中所述微米或纳米大小颗粒由选自天然和合成聚合物、树 枝状骨架、小分子聚集物、铁磁物质、磷脂泡囊、胶束及其组合的材料制得。
29.权利要求25的方法，其中所述活性剂是选自蛋白质、RNA、DNA、螯合剂、放射性化合 物、铁磁化合物、超顺磁复合物及其组合的物质。
30.权利要求25的方法，其中所述活性剂包含抗病毒剂。
31.权利要求25的方法，其中所述活性剂包含凝血蛋白。
32.权利要求25的方法，其中所述活性剂包含抗凝血蛋白。
33.权利要求25的方法，其中所述活性剂包含核酸。
34.权利要求25的方法，其中所述活性剂是超-顺磁氧化铁纳米颗粒。
全文摘要
公开了含有微米或纳米大小颗粒的血小板，其中微米或纳米大小的颗粒含有活性剂，用于治疗医学病症中。还公开了含有药物学上可接受的载体和装载颗粒的血小板的药物组合物，以及将含有活性剂的微米或纳米大小颗粒递送至患者体内的目标部位的方法。
文档编号C12N5/078GK102083447SQ200880021137
公开日2011年6月1日 申请日期2008年5月2日 优先权日2007年5月16日
发明者小E·斯坦·埃斯克里奇, 托马斯·H·费希尔 申请人:恩特格利昂公司