专利名称：人类胚胎干细胞无饲养细胞培养体系培养基及培养方法
技术领域：
本发明涉及一种干细胞无饲养细胞无外源细胞因子培养体系的组成。 本发明还涉及一种干细胞的培养方法。
背景技术：
目前，无论是hESCs所采用的主要培养体系都是和成纤维细胞共培养 的方式[1]，成纤维细胞所分泌的细胞因子对于胚胎多能性的维持起着至关重 要的作用，国内外学者已经从成纤维细胞条件化培养基中鉴定出部分对维 持胚胎干细胞未分化具有重要作用的细胞因子，其中就包括了 Wnt信号通 路配体Wnt3a[2]，但是单独使用Wnt3a并不能维持hES处于未分化状态[3]， 成纤维细胞可能还分泌了其他的细胞因子，如FGF2， Nodal， ActivinA等。 随着人类胚胎干细胞无词养细胞培养体现的建立，研究者发现Wnt信号通 路抑制剂BIO或高剂量的FGF2可以维持人类胚胎干细胞体外培养[4'5]，同 时有研究表明人类胚胎干细胞可以分化成成纤维样细胞，这些成纤维样细 胞可以分泌IGF2来维持人类胚胎干细胞的未分化状态，人类胚胎干细胞可 以为自身建立一个维持未分化状态的微环境6]，这是人类胚胎干细胞为自身 未分化状态维持的间接作用，但是人类胚胎干细胞作为培养体系的组成部 分，人类胚胎干细胞直接对自身未分化状态的影响未见报道。由于人类胚胎干细胞高表达FGF2， Nodal以及IGF2基因[7'8，人类胚胎干细胞自分泌 作用在自身未分化状态维持中具有重要影响。在2006年，国外学者Yao等 同时采用了一种新的无饲养细胞培养体系，其加入的FGF2浓度由以往的 40ng/ml降低到20ng/ml[9]。 该文献公开的无饲养细胞培养体系是 DMEM/F12， 1XN2， 1XB27， O.lmMP画ME， 1 Xglutamine,在培养基中加 入了胎牛血清，FGF2浓度为20ng/ml，同时采用的是Matrigel预铺皿，没有 涉及克隆密度问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的人类胚胎干细胞无饲养细胞无外源细胞 因子培养体系培养基，并用此培养基培养干细胞。
本发明提供的人类胚胎干细胞无饲养细胞无外源细胞因子培养体系培 养基是由下列成分组成的DMEM/F12， 1XN2， 1XB27， 0.1mM0-ME。
本发明还公开了基于该培养基的培养人类胚胎干细胞的方法。即通过 提高克隆种植密度可以在该培养体系维持人类胚胎干细胞不分化，并进行 扩增。每个底面积为2.89cr^的孔板内克隆数目种植数目分别为80-120个。
在本人类胚胎干细胞无饲养细胞无外源细胞因子培养体系下，人类胚 胎干细胞仍然保持了未分化特征，免疫细胞化学染色显示该体系下克隆为 Oct4, SSEA-4和TRA-1-60阳性克隆(图1)，表达了多能性基因Oct4, Sox2， Nanog和Rexl (图2)， AKP染色阳性(图4)，在形态上保持了未分化外
观克隆内细胞排列紧密，细胞维持高核质比(图3)。
在本发明培养条件下的干细胞体系下，只要克隆种植密度维持在高水平状态，人类胚胎干细胞就可以维持未分化状态扩增，并且不存在背景分 化现象，可以大规模扩增人类胚胎干细胞。由于在体系中不含有外源性的 细胞因子，所以具有培养成本低廉的特定，同时，为阐明人类胚胎干细胞 未分化状态提供了技术平台。
图1免疫细胞化学染色显示该体系下克隆为Oct4, SSEA-4和TRA-l-60 阳性克隆；
图2本发明培养条件下的干细胞体系表达了多能性基因Oct4， Sox2， Nanog禾卩Rexl;
图3本发明培养条件下的干细胞体系在形态上保持了未分化外观克 隆内细胞排列紧密，细胞维持高核质比；
图4本发明培养条件下的干细胞体系AKP染色阳性。
具体实施例方式
方法和步骤
1、人类胚胎干细胞无饲养细胞无外源细胞因子培养体系培养基配方(NB 培养基)；
利用DMEM/F12 (11330057， DMEM NUTRIENT MIX F12， Gibco) N2 SUPPLEMENT ( 17502048， 100 X ， Gibco) ， B27 SUPPLEMENT (17504044， 50X， Gibco)， P-ME (p-mercaptoethanol， Gibco)配置本 发明提供的培养基DMEM/F12， 1XN2， 1XB27， O.lmMP-ME。
5每50ML组份如下DMEM/F12 48.5ml
N2 0.5ml B27 lml P -ME91 u 1
2、 培养皿预处理
1) 将进口胎牛血清4t解冻，然后分装成2ml/EP管，置-2(TC保存备用；
2) 室温解冻EP管内的血清；
3) 将进口 FBS包被处理1孔板(0.5ml)或6孔板(1.5ml)， 4。C过夜 或者室温至少处理4小时；
4) 使用前将FBS吸除，并用D-PBS洗涤三次，每次使用2ml D-PBS洗；
5) 加入NB体系hESCs培养基lml/1孔板，同时在1孔板的周边加入 3mlPBS，以防止培养基蒸发形成高渗液，然后入37'C培养箱内，备 用；
3、 人类胚胎干细胞传代培养
1) 采用FBS预处理后l孔板加入lmlNB培养基，入培养箱备用；
2) 将在hESCs克隆用刀片切割成大小一致的小块(0.2mmX0.2mm大 小)，再用20(^1的Tip将克隆块铲起；
3) 收集被铲起的克隆块；
4) 每个1孔板内(底面积为2.89cm2)克隆数目种植数目分别为100个， 均匀散布皿底，使得每个1孔板内的克隆密度为34克隆/cm2;5) 每天换液1次，每次lml;
6) 培养6天后，以机械切割的方式传代培养，克隆密度为34克隆/cm2;
4、人类胚胎干细胞鉴定
4.1 hESCsAKP染色
1) 将培养的hESCs尽量去除残余培养基；
2) 加入一20。C预冷的70^乙醇固定hESCs克隆，置-20度固定120分 钟；
3) 取出固定细胞，采用双蒸水洗涤3次；
4) 按照试剂盒说明，按照试剂说明配方(l药片+5ml反应液)新鲜配 置的染液染色，加入染液染色；
5) 室温下一般染色10分钟；
6) 当染色满意时，用蒸馏水洗涤3次；
7) 显微镜下观察并摄像，如图4所示；
4.2 hESCs分子标记免疫细胞化学染色
1) 吸除6孔板或1孔板内hESCs培养基，用DPBS洗涤2次，每次使 用3ml DPBS;
2) 加入4%多聚甲醛，室温固定20分钟；
3) DPBS洗涤3次。每次10分钟；
4) 细胞内抗原Oct4需要用透膜剂增加细胞膜的通透性，采用1% Triton-X-100室温处理30分钟；
5) 采用4%三羊血清(goat serum in DPBS)室温封闭30分钟，消除非特异性染色；
6) 用4%三羊血清稀释一抗(SSEA-4 1:100, TRA-1-60 1:100, Oct4 1:50)， 4"C过夜处理；
7) DPBS洗涤3次，每次10分钟；
8) 加入稀释的二抗FITC(1:400)，室温孵育1小时；
9) DPBS洗涤3次，每次10分钟；
10) DAPI (1:1000)染色10秒； U)镜下观察并摄像，如图l所示；
4.3多能性基因半定量PCR检测
1) 依照不同基因引物对扩增的条件分别扩增多能性相关基因Oct4， Sox2和Nanog的表达水平；
2) 1.5%琼脂糖电泳检测基因表达量，如图2所示；
以beta-actin为参照，分析各不同样本之间各基因表达的相对水平。
权利要求
1、人类胚胎干细胞无饲养细胞无外源细胞因子培养体系培养基，其特征在于它是由下列成分组成的DMEM/F12，1×N2，1×B27，0.1mMβ-ME。
2、 基于权利要求1所述的培养基的人类胚胎干细胞体系无饲养细胞 的培养方法，其特征在于每个底面积为2.89cn^的孔板内克隆数目种 植数目为80-120个。
全文摘要
本发明提供了一种人类胚胎干细胞无饲养细胞无外源细胞因子培养体系培养基，由下列成分组成DMEM/F12，1×N2，1×B27，0.1mM β-ME；本发明还提供了一种基于上述培养基的人类胚胎干细胞体系无饲养细胞的培养方法。在本发明培养条件下的干细胞体系下，只要克隆种植密度维持在高水平状态，人类胚胎干细胞就可以维持未分化状态扩增，并且不存在背景分化现象，可以大规模扩增人类胚胎干细胞，还具有培养成本低廉的特点，也为阐明人类胚胎干细胞未分化状态提供了技术平台。
文档编号C12N15/08GK101475934SQ20091004253
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月16日 优先权日2009年1月16日
发明者卢光琇, 戈 林, 罗树伟 申请人:湖南惠霖生命科技有限公司