专利名称：一种人胰高血糖素样肽-1的复合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种胰高血糖素-1的复合物及其制备方法，确切的说，涉及一种聚乙 二醇-人胰高血糖素样肽-1，即PEG-GLP-I的复合物及其制备方法，属肽或蛋白质的修饰复 合物及其制备的技术领域。
背景技术：
糖尿病是现代疾病中的第二杀手，其对人体的危害仅次于癌症，而且现在的糖尿 病有扩大化和年轻化的倾向。2006年国家疾病预防控制中心统计数据表明，我国已成为糖 尿病发病人数最多的国家。全国至少有3500万人患有这种慢性疾病。因此糖尿病的药物 具有非常广阔的市场。2型糖尿病的主要病理生理基础是胰岛素分泌减少和胰岛素抵抗，如何促进胰岛 β细胞分泌胰岛素一直是降糖药研究的重点，因为尽管2型糖尿病患者空腹胰岛素水平较 高，但是缺乏餐后第一相胰岛素反应，从而导致餐后高血糖。目前市场上也有许多药物通过 非葡萄糖依赖途径刺激胰岛素分泌，由于这种药物不能根据体内葡萄糖水平进行调节，因 此会出现体内葡萄糖过低的危险。而GLP-I正可以促进葡萄糖依赖的胰岛素分泌，不会出 现上述危险。胰岛β细胞功能衰竭是2型糖尿病致病机制的核心。而GLP-I正可以促进 胰岛β细胞分泌胰岛素，保护和增强胰岛素受体的敏感性，不会象单纯注射胰岛素或磺胺 类药物那样产生低血糖，是一种新型的多肽药物，可以从根本上对2型糖尿病进行治疗。PEG修饰是一个使多肽或蛋白质在治疗或生物技术方面的效力得以提高的重要过 程。当PEG以适当的方式连接在蛋白质或多肽上时，它能改变许多的特征.而主要的生物 活性功能，如酶活性或特异结合位点，可以保留下来。PEG修饰通过如下几种途径改善药物 的性能。首先，PEG连接在蛋白质或多肽的表面上，提高了它的分子大小，并且它还能携带 大量的水分子，一种PEG-蛋白质因而增大了 5 10倍。其次，PEG修饰使得以前不溶的蛋 白质不仅容易溶解，而且具有高度移动性。此外，PEG修饰可以减少肾脏对药物的滤过作用， 降低它的致热原性，还可以减少蛋白酶对其的消解，通过保护分子免受人体免疫系统的攻 击来改善了它的输送。同时，因为它逃避了人体防御机构，因而在作用部位停留的时间就长 得多，并使局部药物浓度增高。PEG修饰GLP-I的意义GLP-1是一种30个氨基酸长度的肽 类激素。通常情况下，这种长度的肽类激素口服无效，需要注射或其他适合肽类药物的给药 方式(如，肺部或颊内给药)与胰高血糖素相似，GLP-I易形成原纤维，因此十分难溶于水。 最近有许多文献报道GLP-I难于形成混合物，难于形成药物。GLP-I的药动学性质更加大了 这一难题。二肽酶IV迅速降解GLP-1，其产物不仅没有活性，还可以充当GLP-I受体的拮 抗剂，产生相反的作用。同时，肾小球对GLP-I的滤过十分迅速。由于以上原因，GLP-I在 人体中的半衰期十分短，静脉注射只有1. 5分钟，皮下注射有1. 5小时，都不适合用作药物。 针对以上不足，对GLP-I的修饰成为了研究的热点。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是GLP-I的PEG化修饰。本发明要解 决的另一个技术问题是采用一步切割的办法获得GLP-I单体蛋白。
图1是GLP-I融合蛋白及DTT切割后的SDS-PAGE图现在详细说明本发明的技术方案。其特征在于，具体操作步骤如下具体实施方法下面通过具体实施例，进一步详述本发明。一下实施例中所用mPEG、化学试剂等， 以及未注明具体条件的实验方法，按常规或商品供应商所建议的条件进行。第一步PCR获得GLP-I基因，将GLP-I基因克隆入PTYBll载体中，将载体 PTYBl 1-GLP-1转化大肠杆菌ER2566感受态，诱导并实现可溶性融合表达，目的蛋白占菌体 总蛋白的80%，获得GLP-I与几丁质结合结构域-内含肽-GLP-I融合蛋白。第二步在纯化柱中装入几丁质珠，利用GE公司的AKTA系统将诱导表达后的上清 以lml/min的速度过柱，利用几丁质结合结构域将融合蛋白挂在柱子上。第三部加入DTT，并在4°C条件下作用24小时，这时几丁质结合结构域-内含肽 会与GLP-I分离，以lml/min的速度流加洗脱液将GLP-I洗脱下来。获得没有任何多余氨 基酸残基的基因重组GLP-I纯品。第四步将1份重量的人胰高血糖素样肽-1(7-37) NH2溶解于500份重量的 IOOmM, PH7. 4磷酸盐缓冲液中，再与500份重量的200mM，PH6. 0-9. 0磷酸盐缓冲液或硼 酸-硼砂缓冲液混合；第五步向第一步的溶液中加入1. 5-119. 0份重量的含经琥珀酰亚胺活化的活性 基团的单甲氧基聚乙二醇，混合均勻，所述的单甲氧基聚乙二醇是分子量为5-40KD的单甲 氧基聚乙二醇_丙酸琥珀酰亚胺。第六部将第二步的溶液置于4_40°C进行PEG修饰反应0. 5-24小时；第七步将经第三步处理的溶液置于-20°C终止反应，至此，制得人胰高血糖素样 肽-1的复合物粗品溶液；第八步取经第四步制得的粗品溶液用20mM，pH4. 2的醋酸-醋酸盐缓冲液稀释 10倍，上S印harose FF CM层析柱，用含0-1M NaCL的20mM，pH4. 2醋酸-醋酸盐缓冲液进 行梯度洗脱，流速为0. 1-lml/min，在波长为280nm处收集3个洗脱峰中的中间一个吸收峰 的洗脱溶液；第九步将第五步收集到的洗脱溶液用截留分子量为1-5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管浓缩，冷冻干燥，得到0. 2-3. 9份重量的产物，即人胰高血糖素样肽_1的复 合物纯品。
权利要求
一种胰高血糖素样肽(7 37)的制备方法，利用PTYB11载体系统实现一步剪切及纯化，得到没有任何多余氨基酸残基的胰高血糖素样肽(7 37)。其特点在于，方法简便，既利用融合蛋白实现高表达，同时又能够利用一种独特的纯化及洗脱方式实现一步剪切及纯化。
2.一种人胰高血糖素样肽-1的复合物，其特征在于，该复合物由人胰高血糖素样 肽-1与单甲氧基聚乙二醇组成，该复合物中的人胰高血糖素样肽-1指人胰高血糖素样 肽-1(7-37)NH2，该复合物中的聚乙二醇为经琥珀酰亚胺活化的单甲氧基聚乙二醇。所述的 经活化的单甲氧基聚乙二醇分子量为5-40KD，该复合物是通过人胰高血糖素样肽-1中的N 端氨基和单甲氨基聚乙二醇的琥珀酰亚胺酯键形成的酰胺键连接在一起的单点修饰产物。
3.权利要求1所述的人胰高血糖素样肽-1的制备方法，其特征在于，具体操作步骤如下第一步将GLP-I基因克隆入PTYBll载体中，将载体PTYB11-GLP-1转化大肠杆菌 ER2566感受态，诱导并实现可溶性融合表达，目的蛋白占菌体总蛋白的80%，获得GLP-I与 几丁质结合结构域-内含肽-GLP-I融合蛋白。第二步在纯化柱中装入几丁质珠，利用GE公司的AKTA系统将诱导表达后的上清以 lml/min的速度过柱，利用几丁质结合结构域将融合蛋白挂在柱子上。第三部加入DTT，并在4°C条件下作用24小时，这时几丁质结合结构域-内含肽会与 GLP-I分离，以lml/min的速度流加洗脱液将GLP-I洗脱下来。获得没有任何多余氨基酸残 基的基因重组GLP-I纯品。
4.权利要求2所述的人胰高血糖素样肽-1的制备方法，其特征在于，具体操作步骤如下第一步将1份重量的人胰高血糖素样肽-1 (7-37)NH2溶解于500份重量的IOOmM, PH7. 4磷酸盐缓冲液中，再与500份重量的200mM，PH6. 0-9. 0磷酸盐缓冲液或硼酸-硼砂 缓冲液混合；第二步向第一步的溶液中加入1. 5-119. 0份重量的含经琥珀酰亚胺活化的活性基团 的单甲氧基聚乙二醇，混合均勻，所述的单甲氧基聚乙二醇是分子量为5-40KD的单甲氧基 聚乙二醇-丙酸琥珀酰亚胺。第三部将第二步的溶液置于4-40°C进行PEG修饰反应0. 5-24小时；第四步将经第三步处理的溶液置于_20°C终止反应，至此，制得人胰高血糖素样肽-1 的复合物粗品溶液；第五步取经第四步制得的粗品溶液用20mM，pH4. 2的醋酸-醋酸盐缓冲液稀释10倍， 上S印harose FF CM层析柱，用含0-1M NaCL的20mM，pH4. 2醋酸-醋酸盐缓冲液进行梯度 洗脱，流速为0. 1-lml/min，在波长为280nm处收集3个洗脱峰中的中间一个吸收峰的洗脱 溶液；第六步将第五步收集到的洗脱溶液用截留分子量为1-5KD的Millipore AmiconUltra-15超滤管浓缩，冷冻干燥，得到0. 2-3. 9份重量的产物，即人胰高血糖素样 肽-1的复合物纯品。
全文摘要
一种人胰高血糖素样肽-1的复合物及其制备方法，属肽或蛋白质的修饰复合物及其制备的技术领域。该复合物中的人胰高血糖素样肽-1指人胰高血糖素样肽-1(7-36)NH2，该复合物由人胰高血糖素样肽-1和经琥珀酰亚胺活化的活性集团的单甲氧氨基聚乙二醇组成，两着通过前者的氨基酸游离氨基和后者的琥珀酰亚胺酯键形成的酰胺键连接在一起。将人胰高血糖素样肽-1与含经琥珀酰亚胺活化的活性基团的单甲氧基聚乙二醇进行mPEG修饰反应，两者连接成人胰高血糖素-1的复合物，即mPEG-GLP-1。本发明的方法操作简便，原料易得。本发明的方法制备的产物，人胰高血糖素样肽-1生物稳定性高，体内半衰期长，生物利用度高。
文档编号C12R1/19GK101962652SQ20091008953
公开日2011年2月2日 申请日期2009年7月23日 优先权日2009年7月23日
发明者唐先兵, 王青青 申请人:扬子江药业集团北京海燕药业有限公司