针对2009新甲型流感病毒多聚酶基因和核蛋白基因的siRNA序列及其应用的制作方法

专利名称：针对2009新甲型流感病毒多聚酶基因和核蛋白基因的siRNA序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域和生物信息学领域。本发明涉及流行性感冒的预防 与治疗。本发明还涉及核酸技术领域。具体地说涉及RNA干扰技术，更具体地涉及具有抑 制2009新甲型流感病毒复制与感染和/或2009新甲型流感病毒基因表达的小分子干扰核 糖核酸及其应用。
背景技术：
流行性感冒简称流感，是由甲(A)、乙(B)、丙(C)三型流感病毒分别引起的急性呼 吸道传染病，是一种重要的公众健康问题。甲型流感病毒常以流行形式出现，引起世界性大 流行，它在动物中广泛分布，也能在动物中引起流感流行和造成大量动物死亡。乙型流感病 毒常常引起局部暴发，不引起世界性流感大流行。丙型流感病毒主要以散在形式出现，主要 侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行。流行性感冒是世界上很猖獗的传染病，曾多次席卷全球，给人类带来巨大灾难。流 感病毒感染后容易发生继发性感染，死亡率非常高。由于流感病毒传播迅速、流行广泛，抗 原易变异，人群的特异性免疫状况不稳定，因此可引起局部地区流行或世界性大流行。尤其 是自2009年三四月份在美国和墨西哥鉴定出新甲型流感病毒开始，2009新甲型流感病毒 全球大流行爆发，在世界范围内造成几十万人感染，其中数千人死亡。世界卫生组织于2009 年6月11日正式将流感大流行警戒级别从五级升为最高的六级，宣布世界已经处于2009 年流感大流行。在这种情况下，对2009新甲型流感的防治迫在眉睫。流感病毒属正粘病毒科，是有包膜的单负链、分节段的RNA病毒。甲型流感病毒的 基因组由8个单独的单链RNA片段组成，一般认为RNA1节段编码PB2蛋白；RNA2编码PBl ； RNA3编码PA ；RNA4编码HA ；RNA5编码NP ；RNA6编码NA ；RNA7编码Ml和M2 ；RNA8编码两 个非结构蛋白NSl和NS2。其中，PB1、PB2、PA是三种依赖RNA的RNA多聚酶成分，PBl的 功能是识别和结合由宿主细胞多聚酶II转录的帽子结构(7mGpppGPNm)，PB2的功能是负责 启动后新生的病毒颗粒RNA合成的延伸，PA的功能至今不完全明了，可能是一种激酶或一 种解旋结构的蛋白。核蛋白NP是病毒的主要结构蛋白，其与RNA结合成核糖核蛋白体复合 体，参与RNA转录，同时它也是机体细胞毒性淋巴细胞识别的主要抗原之一。目前，预防流感的较好措施是接种疫苗，但由于流感病毒编码表面抗原的基因容 易发生突变或重配，致使表面抗原发生变异，出现新的抗原，使原有的疫苗不再有效。除疫 苗外，也有抗流感病毒的药物正在积极开发。至今，国际上抗流感的药物主要是神经氨酸酶 抑制剂，但这些药物存在副反应和耐药性等问题，所以目前世界上还没有一种治疗流感的 有效药物。鉴于近两年流感病毒活动频繁，应用现代科技手段发展方便有效的抑制流感病 毒感染的方法就显得尤为重要。RNA干扰(RNA interfering，RNAi)技术是近年来新发展起来的一种高效的、特 异性强的基因阻断技术，是一种由双链RNA介导的、转录后mRNA水平关闭相应基因表达的序列特异性基因沉默机制，它也是体内基因组抵御外在感染和内部转座的一种保护机 制，广泛存在于各种生物，如植物、真菌、昆虫、后生动物和哺乳动物，包括人类。简言之， 该技术就是当把21-23个核苷酸长的双链RNA片段(dsRNA)导入细胞或组织中后，后者 会使目的mRNA被切割，从而降解mRNA，阻碍或阻止了由mRNA翻译成相应蛋白质的过程。 它的作用在基因功能研究领域和各种疾病的治疗领域尤其是病毒性疾病的治疗领域已显 现出不可估量的价值。通过RNAi技术，选择不同的靶位点应用siRNA抑制病毒复制与侵 染已在多种病毒中公开(Adelmen et al.，Insect Mol Biol, 10 :265_273 (2001) ；Gitlin et al. , Nature, 418,430 434(2002) ；Ge Q et al. , Proc Natl Acad Sci USA, 100 (5) 2718-2723(2003) ；Ge Q et al.，Proc Natl Acad Sci USA, 101(23) :8676_8681 (2004)； Hu WY et al. ,Curr Biol,12 :1301_1311 (2002) ；Haasnoot et al.，Biomed Sci,2003，10 607-616(2003) ；Chen W et al. , J. Virol, 78 (13) :6900_7 (2004) Jia Q et al.，J Virol, 77:3301-3306(2003) ；Park WS et al.，Nucleic Acids Res, 30 (22) :4830_4835 (2002)； Capodici J et al.，J Immunol,169 5196-5201(2002) ；Coburn GAet al.，J Virol,76 9225-9231(2002))。2002年12月20日，Small RNA&RNAi被Science杂志评为年度十大科技成就之 首，Nature杂志亦将Small RNA评为年度重大科技成果之一。RNA研究的突破性进展，是生 物医学领域近20年来，可与人类基因组计划(human genomics program, HGP)相提并论的 最重大成果之一。RNAi最主要的功能在于可以调节和关闭基因的表达，进而调控细胞的各 种高级活动。人们对小RNA分子的深入研究必将大大推进基因功能的研究，更为各种病毒 性疾病和肿瘤等疾病的根治，开辟新的治疗途径，具有极其重要的理论和实际意义，它必将 对生物学和医学的发展产生深远的影响。依赖于RNA的多聚酶(PB2、PBl和PA)是甲型流感病毒在感染细胞内进行复制所 必需的。核蛋白(NP)不仅是甲型流感病毒在感染细胞内进行复制和成熟所必须的，同时 它也是病毒最重要的结构蛋白。设计并合成特异性针对编码聚合酶基因和核蛋白基因序 列全长的多种dsRNA，并将其同时导入患者体内，可以选择性降解病毒mRNA，阻断其蛋白表 达，使甲型流感病毒在感染细胞中无法完成复制过程，从而切断病原体在体内的代谢途径， 有效控制疾病进程。由于甲型流感病毒是RNA病毒，而设计的dsRNA与病毒的vRNA和cRNA 都具有序列同源性，因而采用RNA干扰手段，有可能直接引发病毒vRNA和cRNA的降解，从 而在根本上清除感染细胞中的病毒。本发明应用RNAi技术，通过siRNA进行2009新甲型流感病毒的抑制研究，为抑制 流感病毒的复制与感染提供新的途径，也为流行性感冒的预防与治疗提供新的思路。有效 的siRNA靶位点不仅可以作为新的化学药物靶位点，而且siRNA可以直接作为强有效的药 物用于流行性感冒的预防与治疗，特异性强，不易引起副反应，给药方便、快捷，避免现行疫 苗对突变流感病毒和其他动物流感病毒引起的突发流行性感冒的不能保护以及化学药物 的副反应。我们认为目前研制和开发治疗流行性感冒的dsRNA药物不但具有实际可操作性 而且拥有良好的应用前景。这里引用的所有出版物、专利和专利申请，无论前述或后述，在此都以其完整形式 引入作为参考。

发明内容
本发明涉及以下按顺序编号的段落中定义的主题1.分离的流感病毒小分子干扰核糖核酸(SiRNA)靶序列，其中，所述靶序列为流 感病毒多聚酶PB1、PB2、PA或者核蛋白NP编码基因上的连续10-30个(优选，15-27个，更 优选19-23个)核苷酸。2.如段落1所述的siRNA靶序列，其中，所述靶序列为SEQ IDNO :40_SEQ ID NO 60中任意一条序列。3.与段落1或2的siRNA靶序列具有至少70% (例如80、85、90、95、96、97、98、
99% )同一性或者在严紧杂交条件下杂交的多核苷酸序列，或其互补序列。4.包含段落1-3任一个的序列的核酸构建体。5.段落1-4任一个所述的siRNA靶序列在筛选抗流感病毒药物中的应用。6.小分子干扰核糖核酸(siRNA)，其包括正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义 RNA片段包含段落1-3序列编码的RNA序列，其中正义RNA片段和反义RNA片段能形成双链 RNA，且能抑制流感病毒多聚酶基因的表达和/或流感病毒的复制和/或感染。7.如段落6所述的核糖核酸，其中，所述正义RNA片段和反义RNA片段存在于两条 不同的RNA链上或者存在于一条RNA链上，例如在一个单链RNA分子包含正义RNA片段和 反义RNA片段。8.如段落7所述的核糖核酸，其中，所述核糖核酸为发夹型单链RNA分子，其中正 义RNA片段和反义RNA片段之间的互补区域形成双链RNA区域。9.段落6-8任一个所述的核糖核酸，其中，正义RNA片段和反义RNA片段的长度优 选为8-50个核苷酸，优选10-30 (更优选15-27，最优选19-23，如19,20或者21)个。10.段落6-9任一个所述的核糖核酸，其中，双链RNA的互补区域至少有10个(优 选15个，更优选18个)碱基对。11.如段落6-10任一个所述的核糖核酸，其中，所述核糖核酸为具有10-30 (优选， 15-27，更优选19-23)对碱基的双链RNA分子，所述双链中至少有10个(优选15个，更优 选18个)碱基互补配对。12.如段落6-11任一个所述的核糖核酸，其中，正义RNA片段和反义RNA片段的 GC 含量为 35% -75%，例如 40-60%、45-55%、48-52%，如约 50%。13.如段落6-12任一个所述的核糖核酸，其中，正义RNA片段和反义RNA片段与已 知人类基因和基因表达片段无显著的同一性。14.如段落6-13任一个所述的核糖核酸，其中，所述反义RNA片段包含与段落1或 2所述siRNA靶序列有至少10个(优选15个，更优选18个)碱基互补的序列，正义RNA片 段序列与所述反义RNA片段序列有至少10个(优选15个，更优选18个)碱基互补。15.如段落6-14任一个所述的核糖核酸，其中，所述正义RNA片段与反义RNA片段 之间的互补区域含18、19、20、或21对互补碱基。16.如段落6-15任一个所述的核糖核酸，其中，所述反义RNA片段序列与SEQ ID NO I-SEQ ID NO 18所示的任意一条序列有至少10个(优选15个，更优选18个)碱基互 补。17.如段落6-16任一个所述的核糖核酸，其中，所述正义RNA片段与反义RNA片段的3’端包含至少两个脱氧寡核苷酸的末端，一般为脱氧胸苷酸TT。18.如段落6-17任一个所述的核糖核酸，其中，所述核糖核酸的反义RNA片段序列 包含 SEQ ID NO =21-40,正义 RNA 片段序列包含 SEQ ID NO :41_60。19.如段落6-18任一个所述的核糖核酸，其中，所述正义RNA片段自5’端开始的 19个核苷酸序列中的碱基为鸟嘌呤(G)的核苷酸数量与碱基为胞嘧啶(C)的核苷酸数量之 和占除去3’端的TT以外的19个核苷酸数量的比例为35% -75% (即G/C比例)，所述反 义RNA片段及其一个核苷酸的突变体与已知人类基因和基因表达片段无同一性。20.如段落6-19任一个所述的小分子干扰核糖核酸(SiRNA)，其中，用化学合成方 法直接合成或者用质粒载体在细胞或体内表达，或者在体外合成、转录后用Dicer酶消化 的方法获得。21. DNA序列的组合，其包括编码正义RNA片段的第一 DNA序列和编码反义RNA片 段的第二 DNA序列，所述正义RNA片段包含段落1-3的序列所编码的RNA序列，其中正义 RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA，且能抑制流感病毒多聚酶基因的表达和/或流感 病毒的复制和/或感染。22.段落21的DNA序列的组合，其中正义RNA片段和反义RNA片段如段落7-20任 一个中所定义。23.段落21的DNA序列的组合，第一 DNA序列和第二 DNA序列包含在两种不同的 DNA分子中，这两种不同的DNA分子优选分别另外含有与第一 DNA序列有效连接的第一启动 子和与第二 DNA序列有效连接的第二启动子。24.段落21的DNA序列的组合，其中，第一 DNA序列和第二DNA序列包含在同一种 DNA分子中，优选地，第一 DNA序列和第二 DNA序列包含于所述DNA分子的同一 DNA链中； 更优选地，所示正义RNA片段和反义RNA片段表达为一种RNA分子，还优选的是，所述RNA 分子能够折叠，使得其中所含的RNA片段形成双链区域；所述DNA分子可以另外含有与第一 DNA序列和/或者第二 DNA序列有效连接的启动子。25.包含段落21-24任一个的DNA组合的载体或者载体组合。26.分离的宿主细胞，优选哺乳动物细胞，特别是A549传代细胞，其中，所述细胞 包含段落21-24任一个的DNA组合或者段落25所述的载体或者载体组合。27. 一种动物模型，其中，所述动物模型包含段落21-24任一个的DNA组合或者段 落25所述的载体或者载体组合。28.如段落27所述的动物模型，其中，所述的动物模型为9_11日龄的鸡胚。29.包含段落6-20任一个的核糖核酸、段落21_24任一个的DNA组合、段落25的 载体或者载体组合的组合物，特别是药物组合物。30.段落6-20任一个的核糖核酸、段落21-24任一个的DNA组合、段落25的载体 或者载体组合用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防流感病毒引起的流 行性感冒或其它相关疾病。31.段落6-20任一个的核糖核酸、段落21_24任一个的DNA组合、段落25的载体 或者载体组合用于制备药物的用途，其中，所述药物用于抑制流感病毒的复制和/或感染。32.段落6-20任一个的核糖核酸、段落21-24任一个的DNA组合、段落25的载体 或者载体组合用于制备药物的用途，其中，所述药物用于抑制流感病毒蛋白质的表达。
33.抑制流感病毒的复制和/或感染的方法，包括给予段落29的组合物。34.抑制宿主细胞中流感病毒蛋白质的表达的方法，将宿主细胞与段落29的组合 物接触。35.以上段落任一个的主题，其中流感病毒是2009新甲型流感病毒，特别是2009 新甲型流感病毒株A/Beijing/01/2009 (Hmi)。以下结合附图进一步说明本发明。基于这些说明，本发明的上述方面和其它方面 对于本领域技术人员而言是明显的。附图简述

图1 是siRNA对靶序列表达的抑制效果图。应用针对PB2、PBU PA和NP基因不 同靶位点的2009新甲型流感病毒特异siRNA，筛选能敲低靶序列-Fluc融合基因的表达，即 有效抑制A549细胞中萤火虫荧光素酶表达的siRNA。图示对照为转染无关siRNA及荧光素 酶表达载体的细胞，其它为转染能表达针对PB2、PBU PA和NP基因不同靶位点特异siRNA 及荧光素酶表达载体的细胞。纵坐标表示以转录活性内对照的海肾荧光素酶为标准化的萤 火虫荧光素酶活性。图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。图2 是病毒基因组RNA抑制情况使用2号、6号、7号、10号、11号、16号、17号和 20号siRNA于细胞水平检测其对2009新甲型流感病毒(A/Beijing/01/2009 (HlNl)) RNA 合成的抑制情况。图示对照为转染无关siRNA的细胞，其它为转染2号、6号、7号、10号、 11号、16号、17号和20号siRNA的细胞。对照靶基因检测指示各个siRNA作用的靶基因被 抑制的情况。NP基因检测指示病毒主要结构蛋白基因NP被抑制的情况。实验内参基因为 GAPDH0图中每一个数据代表三次重复实验的平均值。图3 是病毒主要结构蛋白NP蛋白抑制情况使用2号、6号、7号、10号、 11号、16号、17号和20号SiRNA于细胞水平检测其对2009新甲型流感病毒(A/ Beijing/01/2009 (HlNl))蛋白合成的抑制情况。图示对照为转染无关siRNA的细胞，其它 为转染2号、6号、7号、10号、11号、16号、17号和20号siRNA的细胞。柱状图指示转染了 siRNA的实验组与对照组比较后的抑制情况，实验内参基因为β-Tubulin。图中每一个数 据代表三次重复实验的平均值。
图4 融合靶序列的萤火虫荧光素酶表达载体示意图
具体实施例方式本发明人选取2009新甲型流感病毒多聚酶PB1、PB2、PA或者核蛋白NP编码基因 中高度保守的序列作为siRNA的靶序列，并且以靶序列中的连续10-30 (优选，15-27，更优 选19-23)bp的序列设计siRNA。细胞和动物模型攻毒实验证明，以2009新甲型流感病毒 基因组中高度保守的序列作为靶序列，应用能与靶序列特定位点上的核苷酸序列互补配对 的siRNA，可以阻断该基因在细胞模型中的复制与表达，从而有效地抑制不同2009新甲型 流感病毒毒株在细胞中的复制与感染，以达到治疗流行性感冒的目的。本发明的一个目的就是提供一组流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)基因 组上的小分子干扰核糖核酸(siRNA)靶序列及其应用。其中当药物，包括所筛选出的小干 扰RNA(SiRNA)序列与这些靶序列中的一个或几个特异性地作用，可以阻断引起流行性感 冒的流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)基因在人体或动物体内的复制或表达，从而抑制流感病毒的复制与感染，达到治疗流行性感冒的目的。本发明的另一目的就是提供一组用于预防和治疗流感病毒(特别是2009新甲型 流感病毒)引起的流行性感冒的靶向小分子干扰核糖核酸、DNA、其载体、宿主细胞及其制 备方法和应用。发明人相信，本发明的原理在于特异性SiRNA针对病毒基因组保守序列，抑制病 毒的mRNA(但本发明并不受该原理的束缚)。针对流感病毒(特别是2009新甲型流感病 毒)多聚酶(PB2、PB1、PA)、病毒的virion RNA(vRNA)和互补RNA (cRNA)，设计并化学合成 siRNA及制备含特异siRNA编码DNA的质粒，并将此化学合成siRNA或含特异siRNA编码 DNA的质粒转入选定的靶细胞进行抗流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)的研究。通 过特异性抑制病毒的多聚酶的转录和复制途径，最终为人类和动物提供治疗和预防流感病 毒(特别是2009新甲型流感病毒)感染的快速便宜的有效药物。本发明所要解决的问题是针对病毒基因组靶序列提供攻击流感病毒(特别是 2009新甲型流感病毒)的小干扰RNA分子(siRNA)，用于预防或治疗流感病毒(特别是2009 新甲型流感病毒)感染引起的流行性感冒及与其密切相关的呼吸道疾病。为此本发明采用 权利要求书中定义的技术方案。在一方面，本发明提供了分离的流感病毒小分子干扰核糖核酸(siRNA)靶序列， 其选自(1)流感病毒多聚酶PB1、PB2、PA或者核蛋白NP编码基因上的连续10_30个(优 选，15-27个，更优选19-23个)核苷酸；(2) SEQ ID NO =I-SEQ ID NO 20 中任意一条序列；(3)与(1)或者(2)的序列具有至少 70% (例如 80、85、90、95、96、97、98、99% )
同一性或者在严紧杂交条件下杂交的多核苷酸序列；(4)从(1)或者⑵的序列发生了 1-5个(优选1-3个，更优选1-2个，最优选1 个)核苷酸插入、替代和/或缺失。为了序列比较，可以采用Lasergene生物信息软件包中的Megalign程序(DNASTAR 公司，Madison，WI)，利用默认参数进行序列的最佳比对。或者，为了序列比较，可以利用以 下方法进行序列的最佳比对=Smith和Waterman的局部同一性算法((1982)Add. APL. Math 2 482) ；Needleman 和 Wunsch 的同一性比对算法((1970) J. Mol. Biol. 48 443) ；Pearson和 Lipman的相似性搜索方法((1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 2444)；这些算法的计算 机执行程序(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group (GCG)，575 Science Dr.，Madison, WI)；或目测。适合于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法的一个优选例子是BLAST和 BLAST 2. 0 算法，它们分别描述在 Altschul 等(1977)Nucl. Acid. Res. 25 :3389_3402 和 Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_410。采用例如本文所述或者默认参数，BLAST和 BLAST 2.0可以用于确定本发明的多核苷酸和肽的序列同一性百分数。执行BLAST分析的 软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。因此，本发明包括与本文所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如当采用本 文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析)时，与本发明多核苷酸序列相比含有至 少 50%序列同一性、优选至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97 %、98 %或99 %或更高的序列同一性的那些序列。在其它实施方案中，本发明指向在中等严紧条件下与本文提供的多核苷酸、或其 片段、或其互补序列能够杂交的多核苷酸。在分子生物学领域中杂交技术是熟知的。典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性 程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典 型地发生在约Tm-5°C (低于探针Tm 5°C )；“高等严紧性”发生在Tm以下约5-10°C;“中等 严紧性”发生在探针Tm以下约10-20°C ；“低严紧性”发生在Tm以下约20_25°C。作为替 代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗 涤为依据。例如，6XSSC =极低严紧性；3XSSC =低至中等严紧性；IXSSC =中等严紧性； 0. 5XSSC =高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一 或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80%或更多序列同 一性的核酸序列。对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如， 选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等(Sambr00k，J.等(1989)分子克隆，实验 室手册，Cold Spring HarborPress, Plainview, N. Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧 性在内的杂交条件。为便于说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧 条件包括用 5XSSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA(ρΗ8· 0)溶液预洗；在 50-65°C下在 5XSSC 中 杂交过夜；随后用含0. SDS的2X、0. 5X和0. 2XSSC在65°C下各洗涤两次20分钟。 本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂 交温度。例如，在另一实施方案中，合适的高度严紧杂交条件包括上述条件，不同之处在于 杂交温度升高到例如60-65°C或65-70°C。所述靶序列可以是流感病毒多聚酶PBl、PB2、PA或者核蛋白NP编码基因、多聚酶 PB1、PB2、PA或者NP编码基因的转录产物、cDNA、或者其mRNA。所述的靶序列可以是流感病 毒(特别是2009新甲型流感病毒)的RNA基因组序列，或病毒粒子RNA序列(virion RNA, vRNA)，或病毒粒子RNA序列的互补RNA序列(complementary RNA, cRNA)。优选地，所述siRNA靶序列为与SEQ ID NO =I-SEQ ID NO :20中任意一条序列的连 续10个(优选15个，更优选18个)核苷酸序列相同的序列。更优选的是，所述的SiRNA 靶序列为与SEQ ID NO I-SEQID NO 20所示的任意一条序列。本发明提供了一系列流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)基因上可以被 siRNA或反义核酸序列攻击的靶序列，因此，凡是可以作用于本靶序列以阻断病毒基因在感 染的人或动物体内复制或表达的核苷酸片段都是本发明所要求保护的范围。本发明还提供上述siRNA靶序列的互补序列。本发明还提供包含siRNA靶序列或其互补序列的核酸构建体。本发明还提供SiRNA靶序列在筛选抗流感病毒药物中的应用。所述抗流感病毒 (特别是2009新甲型流感病毒)药物优选治疗或预防流感病毒(特别是2009新甲型流感 病毒)所引起的流行性感冒及其它相关疾病的药物。另一方面，本发明提供小分子干扰核糖核酸(siRNA)，其包括正义RNA片段和反义 RNA片段，所述正义RNA片段包含本发明靶序列编码的RNA序列，正义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA，且能抑制流感病毒多聚酶基因的表达和/或流感病毒的复制和/或感
^fe ο在本发明中，术语“小分子核糖核酸”、“小分子干扰核糖核酸”或“siRNA”、“本发 明核糖核酸”可互换使用，它们都指能够抑制流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)靶 基因表达、包括正义RNA片段区域(例如SEQ ID NO 21-SEQ ID NO 40中任意一条序列) 和反义RNA片段区域(例如SEQ ID NO :41_SEQ ID NO 60中任意一条序列)的核糖核酸 (RNA) ο相关地，本发明还提供DNA序列的组合，其包括或者由编码正义RNA片段的第一 DNA序列和编码反义RNA片段的第二 DNA序列组成，所述正义RNA片段包含本发明靶序列所 编码的RNA序列，其中正义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA，且能抑制流感病毒多 聚酶基因的表达和/或流感病毒的复制和/或感染。在本发明的这方面，所述正义RNA片段和反义RNA片段可以存在于两条不同的RNA 链上或者存在于一条RNA链上，例如在一个单链RNA分子包含正义RNA片段和反义RNA片 段。例如，本发明的siRNA可以为发夹型单链RNA分子，其中正义RNA片段和反义RNA 片段之间的互补区域形成双链RNA区域。正义RNA片段和反义RNA片段的长度优选为8_50个核苷酸，优选10_30 (更优选 15-27，最优选19-23，如19、20或者21)个。但也可以更长或者更短。在正义RNA片段和反义RNA片段形成的双链RNA的互补区域至少有10个(优选 15个，更优选18个，如19、20或者21个)碱基对。优选地，所述正义RNA片段与反义RNA 片段之间的互补区域含18、19、20、或21对互补碱基。在一个实施方案中，本发明的siRNA为具有10-30 (优选，15-27，更优选19-23)对 碱基的双链RNA分子，所述双链中至少有10个(优选15个，更优选18个)碱基互补配对。在一个优选的实施方案中，正义RNA片段和反义RNA片段的GC含量为35%-75%， 例如 40-60%、45-55%、48-52%，如约 50%。在一个优选的实施方案中，正义RNA片段和反义RNA片段与已知人类基因和基因 表达片段无显著的同一性。显著的同一性是指至少60%，例如70，80、90%同一性。优选的是，所述正义RNA片段自5’端开始的19个核苷酸序列中的碱基为鸟嘌呤 (G)的核苷酸数量与碱基为胞嘧啶(C)的核苷酸数量之和占除去3’端的TT以外的19个核 苷酸数量的比例为35% -75% (即G/C比例)，所述反义RNA片段及其一个核苷酸的突变体 与已知人类基因和基因表达片段无显著同一性。在一个具体实施方案中，反义RNA片段包含与如下所述siRNA靶序列有至少10个 (优选15个，更优选18个)碱基互补的序列(1)流感病毒多聚酶PB1、PB2PA或者核蛋白NP编码基因上的连续10_30个(优 选，15-27个，更优选19-23个)核苷酸；或者(2) SEQ ID NO =I-SEQ ID NO 20 中任意一条序列；正义RNA片段序列与所述反义RNA片段序列有至少10个(优选15个，更优选18 个)碱基互补。在另一个具体实施方案中，所述反义RNA片段序列与SEQ ID NO ！-SEQ ID NO 18所示的任意一条序列有至少10个(优选15个，更优选18个)碱基互补。在另一个具体实施方案中，所述正义RNA片段与反义RNA片段的3’端包含至少两 个(例如2、3、4、5个)脱氧寡核苷酸的末端，一般为脱氧胸苷酸TT。优选地，所述反义RNA片段序列包含SEQ ID NO :19_SEQ ID NO 36所示的任意一 条序列或与前述序列有连续10个(优选15个，更优选18个)碱基相同的序列。特别优选的是，所述干扰核糖核酸的反义RNA片段序列包含SEQID NO =21-40,正 义RNA片段序列包含SEQ ID NO :41_60。在一个优选实施方案中，反义RNA片段包含与本发明靶序列编码的RNA序列全长 互补的RNA序列。在该实施方案中，优选地，在所述正义RNA片段中，在本发明靶序列编码的RNA序 列3’还含有至少两个(例如2、3、4、5个)连续的脱氧胸苷酸作为正义RNA片段的3’末 端；而且，在所述反义RNA片段中，在与本发明靶序列编码的RNA序列全长互补的RNA序列 3’还含有至少两个(例如2、3、4、5个)连续的脱氧胸苷酸作为反义RNA片段的3’末端。在一个具体例子中，正义RNA片段和反义RNA片段的长度均为21个核苷酸，正义 RNA片段和反义RNA片段各自的3’端为两个连续的脱氧胸苷酸(TT)，两个RNA片段除去3’ 端的TT以外的19个核苷酸上的碱基互补形成双链，但它们3’端的两个TT却以单链形式 存在。本发明的小分子干扰核糖核酸(SiRNA)可用化学合成方法直接合成或者用质粒 载体在细胞或体内表达，或者在体外合成、转录后用Dicer酶消化的方法获得。本发明所述的小干扰RNA可以是化学合成的双链RNA;也可以是载体或表达框架 表达的双链RNA，所述载体或表达框架中可采用例如RNA聚合酶III启动子和RNA聚合酶 III终止子调控小干扰RNA在哺乳动物细胞中的表达，RNA聚合酶III启动子包括人源或鼠 源的U6启动子和人Hl启动子等。本发明所述的小干扰RNA可以是由作用于一个靶序列的单一小干扰RNA组成，也 可以由作用于一个基因的多个靶序列或多个基因上的靶序列的多个小干扰RNA组成；所述 的靶序列可以是流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)的RNA基因组序列，或病毒粒子 RNA 序列(virion RNA，vRNA)，或病毒粒子 RNA 序列的互补 RNA 序列(complementary RNA, cRNA)。具体地，本发明所述的小干扰RNA可以由序列表中的至少一个序列组成。本发明的SiRNA可通过本文实施例中公开的方法或者本领域已知的方法筛选。在 一个实施方案中，将候选siRNA在病毒感染前和/或病毒感染后导入体外培养细胞或体内， 通过病毒滴度降低筛选出能有效防治流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)的小干扰 RNA。在本发明的DNA序列的组合中，第一 DNA序列和第二 DNA序列可以包含在两种不 同的DNA分子中。这两种不同的DNA分子优选分别另外含有与第一 DNA序列有效连接的第 一启动子和与第二 DNA序列有效连接的第二启动子。第一 DNA序列和第二 DNA序列也可以包含在同一种DNA分子中。优选地，第一 DNA 序列和第二 DNA序列包含于所述DNA分子的同一 DNA链中。更优选地，所示有义RNA片段 和反义RNA片段表达为一种RNA分子。还优选的是，所述RNA分子能够折叠，使得其中所含 的RNA片段形成双链区域。同样，所述DNA分子可以另外含有与第一 DNA序列和/或者第二 DNA序列有效连接的启动子。可用于本发明中的启动子可以是天然靶基因的天然启动子、异源启动子、组成型 启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或者发育调节型启动子。当第一 DNA序列和第二 DNA序列包含在同一种DNA分子中时，所述DNA分子可以 另外在编码有义RNA片段和反义RNA片段的DNA序列之间含有一个接头。该接头可以包含 一种含有功能基因如选择性标记基因的表达盒。或者，所述接头可以包含调节序列如内含 子加工信号。当第一 DNA序列和第二 DNA序列包含在同一种DNA分子中时，所述有义RNA片段 和反义RNA片段也可以表达为两种RNA分子。此时，优选地，第一 DNA序列与第一启动子有 效连接，而第二 DNA序列与第二启动子有效连接；或者，第一 DNA序列和第二 DNA序列可以 与一种双向启动子有效连接。当第一 DNA序列和第二 DNA序列包含在同一种DNA分子中时，在所述DNA分子中 第一 DNA序列和第二 DNA序列可以包含于所述DNA的互补链中。在这方面，所述第一 DNA序列和第二 DNA序列优选可以瞬时转染入宿主细胞中。但 是，在某些实施方式中，所述第一 DNA序列和第二 DNA序列也可以稳定地整合在宿主细胞的 基因组中。在另一方面，本发明还提供包含本发明DNA组合的载体或者载体组合。该载体或 者载体组合可以是一个载体或者多个载体，只要它们合在一起包含本发明的DNA组合即 可。例如，本发明的DNA组合中的第一 DNA序列和第二 DNA序列可以包含在同一个载体中。 或本发明的DNA组合中的第一 DNA序列和第二 DNA序列可以包含在不同的载体中。所述载体可以是质粒、病毒颗粒及其他载体形式。表达载体中的本发明第一 DNA 序列和第二 DNA序列可以可操作地和表达控制序列连接，表达控制序列包括但不限于用于 翻译起始和转录终止的核糖体结合位点，优选的包含一个或多个选择标记。本发明还包括上述流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)SiRNA表达载体的构 建。siRNA表达载体可采用本说明书中公开的或者本领域已知的方法构建。本发明所构建 的流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)siRNA表达载体经PCR、序列测定表明构建成 功，在体外感染流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)的细胞模型中，通过检测实验证 实表达载体表达的siRNA能较为明显地抑制病毒复制与感染。另一方面，本发明还提供分离的宿主细胞，优选哺乳动物细胞，特别是A549细胞， 其中，所述细胞包含本发明的DNA组合或者载体或者载体组合。所述宿主细胞可以是用本 发明的载体经基因工程产生的宿主细胞。所述宿主细胞可以是大肠杆菌，真菌如酵母，昆虫 细胞如sf9，动物细胞(尤其是哺乳动物细胞)如非洲绿猴肾细胞(Vero)、CH0或人类细胞 等。优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。更优选地，所述哺乳动物细胞为A549细胞。通过本文的阐述，适当的载体、宿主细胞的选择都在本领域技术人员的知识范围 内。在另一方面，本发明还提供包含本发明siRNA、DNA组合、载体或者载体组合的组 合物，特别是药物组合物。本发明提供的小干扰RNA分子(siRNA)能够特异性地针对流感病毒(特别是2009 新甲型流感病毒)，它可能通过细胞内的RISC(RNA-induced silencing complex)有效地降
13解流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)的蛋白信使核糖核酸分子。本发明SiRNA可 以直接阻断病毒基因物质的复制、病毒的繁殖与感染，还可以抑制其和致病密切相关蛋白 质的合成，为治疗流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)引起的流行性感冒及与其密切 相关的呼吸道疾病找到了新的有效的手段。本发明的抗流感病毒(特别是2009新甲型流 感病毒)的siRNA的作用效果显著，无副作用，将在流感病毒(特别是2009新甲型流感病 毒)的防治中起到重要的作用。因此，在另一方面，本发明还提供本发明siRNA、DNA组合、载体或者载体组合用于 制备药物的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防流感病毒引起的流行性感冒或其它相 关疾病。本发明还涉及了上述宿主细胞在制备治疗和/或预防流感病毒(特别是2009新 甲型流感病毒)引起的流行性感冒及其它相关疾病的药物中的应用。优选地，所述宿主细 胞为哺乳动物细胞。更优选地，所述宿主细胞为狗肾细胞。在另一方面，本发明还提供本发明siRNA、DNA组合、载体或者载体组合用于制备 药物的用途，其中，所述药物用于抑制流感病毒的复制和/或感染。在另一方面，本发明还提供本发明siRNA、DNA组合、载体或者载体组合用于制备 药物的用途，其中，所述药物用于抑制流感病毒蛋白质的表达。本发明还涉及了上述载体在 细胞中抑制流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)多聚酶表达的应用，其中，细胞中转 染上述载体能有效降低多聚酶与萤火虫荧光素酶融合基因的表达。本发明所述的小干扰RNA能抑制不同流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒) 毒株在动物细胞中的复制与感染。本发明选取了流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)基因组中高度保守的区 段作为靶序列，实现了 siRNA对不同毒株的复制与感染的干扰作用，为RNAi技术用于预防 和治疗流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)对家禽、家畜等的感染提供新的技术路 线。在另一方面，本发明还提供抑制流感病毒的复制和/或感染的方法，包括给予本 发明的组合物。在另一方面，本发明还提供抑制宿主细胞中流感病毒蛋白质的表达的方法，包括 将宿主细胞与本发明的组合物接触。本发明的组合物可采用本领域已知的或者本文公开的途径给药。给药途径包括但 不局限于下述几种外用(包括眼、鼻)；吸入(包括气管内、口腔内、过皮或皮外的乳化剂 或喷雾剂)；口服；注射或点滴(包括静脉、动脉、皮下腹腔或肌肉内)；颅内给药(包括鞘 膜、脑室内)。例如，本发明用于预防或治疗流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)引 起的流行性感冒的小干扰RNA或上述载体可以和脂质体混合使用。给药剂量可以由本领域 技术人员经过常规试验来确定。一般来说，siRNA分子的剂量范围为5ng 200mg/kg体重 (优选剂量范围是5 μ g 5mg/kg)，此剂量可以每天一次或数次或每周一次或数次、每月一 次或数次、每年一次或数次。通常可以根据测定所给药物在体内的逗留时间、药物在体液或 组织中的浓度来决定给药的次数和频率。本发明用于预防或治疗流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)引起的流行性 感冒的小干扰RNA可以通过呼吸道喷雾或滴注使siRNA经过肺等呼吸系统组织或器官吸收。在可适用的本发明任何方面，优选的是，所述流感病毒是2009新甲型流感病毒， 特别是2009新甲型流感病毒株A/Bei jing/OlAOOg (HlNl)。同现有技术相比的优点①本发明设计了一系列针对流感病毒(特别是2009新甲 型流感病毒)多聚酶PB1、PB2或者PA编码基因不同靶位点的siRNA。②siRNA是天然存在 于植物、真菌和动物细胞内的抗病毒小分子物质，它不但对正常基因调控有重要作用，而且 是生命体内天然的抗病毒感染的基因免疫系统。③大量实验表明siRNA是通过与其序列互 补的RNA结合并引起RNA链的断裂，从而抑制相应蛋白质的合成，因此特异性很高。④许多 实验说明，RNAi存在明显的高效性，极少量的siRNA就可以引起明显的基因沉默表型。⑤ 无明显毒性和副作用。迄今为止，所有体外和体内的研究结果都表明有效剂量(0. I-IOyg/ kg)的siRNA对体外培养的细胞和实验动物没有明显的毒性和副作用，因此siRNA是一类安 全的药物。⑥高抗突变性。流感病毒容易发生突变使已有疫苗失效，而针对高度保守靶序 列的特异siRNA可以避免这些突变，因此siRNA基因药物具有较高的抗突变性。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明 本发明而不限制本发明的范围。下列实施例中如果未注明具体条件的实验方法，通常按 照本领域技术内的病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法和条 件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，分子克隆实验手册 (New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) ；D. Glover 主编 DNA Cloning A Practical Approach, vol. I&II ；N. Gait 主 编 Oligonucleotide Synthesis(1984)； B. Hame s&S. Higgins 主编Nucleic Acid Hybridization (1985) ；B. Hame s&S. Higgins 主编 Transcription and Translation (1984) ；R. Freshney 主编 Animal Cell Culture (1986)； Perbal，A Practical Guide toMolecular Cloning (1984)中所述的技术和条件，或按照制 造厂商所建议的条件。下面实施例中使用了 2009新甲型流感病毒株A/Beijing/01/2009(Hmi)(于 2009年5月分离于北京第一例2009新甲型流感确诊病人的咽拭纸中，命名为strain A/ Beijing/01/2009 (HlNl)，GenBank 号为 GQ183617-GQ183624。)作为举例来进行试验。但 是，很明显，本发明并不局限于该病毒株，也可以采用其它2009新甲型流感病毒株来进行试验。实施例实施例1 靶位点的选择选取siRNA靶序列遵循的基本原则是(1)从基因转录本(mRNA)的起始密码子 AUG开始，寻找连续19个碱基的靶序列，这19个碱基序列尽量以G开始，且其GC含量在 45%-55%左右，避开四个连续的G或C序列，作为潜在的siRNA靶序列。(2)靶序列区域 距离翻译起始点或终止点至少70-100核苷酸。(3)使用BLAST (www. ncbi. nlm. nih. gov)， 将潜在的靶序列与热泪基因组数据库进行比对，排除那些和其他编码序列或EST同源的序 列。本发明根据上述siRNA的设计原则，在2009新甲型流感病毒(A/ Beijing/01/2009 (HlNl))多聚酶(PB2、PB1、PA)、核蛋白(NP)基因编码区(GenBank 数据库 中的登录号:PB2 为 GQ183624 ；PBl 为 GQ183623 ；PA 为 GQ183622 ；NP 为 GQ183620)，选取下
15列位点表1 针对2009新甲型流感病毒PB2、PB1、PA、NP基因编码区的siRNA靶位点序列 表1所示的靶位点序列与相同编号的siRNA的正义RNA片段序列相同(除了正义 RNA片段3’末端的“TT”外)，其在基因上的位点是从多聚酶PB2、PBl或PA编码起始密码 子开始编号的，其在序列表中的序号见最右侧一列。本表格所示序列仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。实施例2 siRNA的化学合成SiRNA的化学合成可委托公开对外开展合成业务的商业公司如美国invitrogen 公司和中国上海吉玛制药技术有限公司，具体可通过http://www. invitrogen. com/site/ us/en/home, html 禾口 http://www. genepharma. com/ 获知，所有的 siRNA 双链都经过退火形 成双链后HPLC纯化，然后溶于DEPC处理的无菌去离子水中。本发明提供的siRNA由上海 吉玛制药技术有限公司合成，合成的siRNAs列表在表2中。表2 针对2009新甲型流感病毒多聚酶PB2PB1PA基因编码区靶序列的siRNA双 链正反义序列。 实施例3 融合靶序列表达载体的构建1、方法为了分析SiRNA对各个靶序列的干扰效果，我们构建了一系列报告质 粒，即将实验方案一所列20个靶序列通过化学合成后分别克隆到一个萤火虫荧光素酶 (Firefly Luciferase, Flue)表达载体中(如图4所示)，具体方法为，分别化学合成靶序 列正反义链的DNA序列后退火形成双链，然后将靶序列克隆到萤火虫荧光素酶的Fluc基因 5 ‘端，构成融合基因(如1-Fluc，2-Fluc)，该该质粒经转染进入细胞，在细胞内可表达融合 的Flue。若靶序列被siRNA干扰则Fluc的表达量降低，据此可以判断siRNA是否特异性干 扰靶序列。实施例4 化学合成siRNA在A549细胞中抑制各自靶序列表达效果的鉴定及筛 选。细胞转染用24孔细胞培养板进行细胞转染实验。①在转染的前一天于24孔细胞培养板上每孔接种1\105个々549细胞((肺癌细 胞A549为人源肺癌细胞，购买于ATCC，ATCC number :CCL_185，该细胞为流感病毒的敏感 细胞系，且易于转染siRNA))，5% CO2培养箱37°C培养过夜。至转染时细胞铺满孔面积的 80% -90%。②靶序列-FlUC融合基因表达载体的转染用阳离子脂质体Lipofectamine 2000 (Invitrogen)转染试剂，按其操作说明进行转染实验。具体用量为每孔细胞 加入靶序列-Fluc融合基因表达载体170ng，作为转录活性内对照的海肾荧光素酶 (Renilla Luciferase, RLuc)表达载体 pRL-TK(Promega 公司产品)17ng，siRNA 20pmol, Lipofectamine 20002 μ 1。③6小时后补加胎牛血清至终浓度为10%。于5% C02、37°C继续培养至24小时 后检测。(2)荧光检测应用Promega公司的双荧光报告系统(Dual-luciferase Reporter Assay System)，在荧光照度仪TD_20/201uminometer (Turnur Designs,USA)上进行焚光检 测。转染后72小时收获细胞进行荧光检测。按照Dual-IuciferaseIteporter Assay System的操作说明进行。具体操作步骤为①弃细胞培养液，用磷酸缓冲液(PBS)冲洗细胞两次，以去除脱落细胞和残留的 细胞培养液。②在每孔中加入100 μ 1 IX裂解缓冲液(Passive Lysis Buffer)。③细胞培养板置震荡器上震荡裂解15min。④取各细胞培养孔中的细胞裂解液20μ 1，加至荧光照度仪所用的检测板的各孔中。⑤检测板的各样品孔中加入100 μ 1 Luciferse Assay Reagent II，混勻后用荧光 照度仪进行荧光强度检测。⑥各样品孔中迅速加入100 μ 1 Stop&Glo Reagent，再用荧光照度仪进行荧光强 度检测。⑦进行数据计算与分析(按照Promega公司Part#TM040技术手册说明进行)。
(3)针对PB2、PBl、PA和NP编码基因的siRNA的筛选方法。将siRNA、pRL_TK与靶序列-Fluc融合基因表达载体共转染A549细胞，24小时后 收获细胞进行荧光检测及数据计算与分析。实验结果分别见图1、表3。2、结果SiRNA的筛选结果，见图1、表3。从Fluc报告基因的表达情况来看，全部20个 siRNA均能将靶序列的表达量抑制在30%以下，其中SiRNA编号为2号、6号、7号、10号、11 号、12号、16号、17号和20号的siRNA能将靶序列融合Fluc报告基因的表达量抑制在5% 以下。表3siRNA对靶序列表达的抑制效果 实施例5:挑选化学合成的SiRNA编号为2、6、7、10、11、16、17和20的siRNA在细胞水平对 2009新甲型流感病毒(A/Beijing/01/2009 (HlNl))复制的抑制。将化学合成的SiRNA编号 为2、6、7、10、11、16、17和20的的siRNA分别转染(如实施例4中用脂质体转染)培养在 24孔板中的A549细胞，于37°C、5% CO2培养6小时后，每孔细胞经Hank’ s液冲洗后加入 100 μ 1在病毒感染培养液中的2009新甲型流感病毒(A/Beijing/01/2009 (HlNl))(病毒感 染量为MOI 0.01，其中MOI为感染复数)，于34°C、5% CO2感染1小时(hr)后加入新鲜的 不含血清的细胞培养液(含2yg/ml TPCK(甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮)_胰酶(Trypsin)) 继续于34°C 5% CO2培养，在感染后的24小时收获细胞检测细胞中病毒繁殖情况。病毒感染培养液为DMEM中含有0. 3%牛血清白蛋白，IOmM !fepes，100units/ml青霉素，100yg/ml链霉素。(1)使用荧光定量PCR技术检测病毒基因组RNA复制情况①使用RNAeasy Mini kit (Qiagen)，按照说明书的方法抽提收获各个样品处理细 胞的总RNA，并定量。②取定量后的总RNA 2微克，使用Superscript III ReverseTranscriptase (invitrogen)进行20微升体系的反转录，将得到的总RNA反转录成 为20微升单链的cDNA。③从20微升cDNA样品中各取2微升，使用Applied Biosystems的ABI Prism 7000 Real-time PCR system系统，进行50微升体系的荧光定量反应，反应体系如下2微 升cDNA，上下游引物(分别为新甲型流感病毒目的片段上下游引物和GAPDH内参上下游引 物，表 4)各 1 微升，25 微升 SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)。反应完 毕后。处理实验结果如图2、表5所示。④结果如结果所示，所挑选的SiRNA均能将流感病毒靶mRNA的表达水平抑制在30%以 下。同时，各条siRNA在抑制靶mRNA表达的同时，亦能将病毒主要的结构蛋白核蛋白的表 达量抑制在30%以下。表4荧光定量引物序列 表5siRNA对靶基因和NP基因mRNA表达的抑制效率 (2)使用In cell western检测技术分析核蛋白NP蛋白的表达情况。①使用PBS清洗培养孔中单层细胞两次。②使用含4%多聚甲醛的PBS固定细胞于4度过夜后使用含0. Triton X-100 的PBS洗涤5次，每次五分钟。③含5% BSA的PBS封闭1. 5小时后PBST洗涤5次，每次5分钟。④抗甲型流感病毒NP蛋白一抗和抗内参β-Tubulin蛋白一抗共孵育2小时后 PBST洗涤5次，每次5分钟.⑤双色荧光二抗抚育1小时后使用Licor Odyssey双通道同时检测NP蛋白表达 情况和内参β-Tubulin表达情况。将目的蛋白表达量与通过内参归一化后处理实验结果 如图3，表6所示。⑥结果如结果所示，与实验对照组相比，转染了 2号、6号、7号、10号、11号、16 号、17号和20号siRNA以后，细胞中甲型流感病毒核蛋白NP表达情况均被抑制在40%以 下。表6siRNA对核蛋白NP蛋白表达的抑制效率 综上，我们从RNA水平和蛋白水平分别检测了 siRNA对病毒RNA和蛋白表达水平 的抑制情况，实验结果有利的说明了所选择的siRNA能有效地抑制病毒的繁殖。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>中国医学科学院病原生物学研究所病毒基因工程国家重点实验室 <120>针对2009新甲型流感病毒多聚酶基因与核蛋白基因的siRNA序列及其应用 <130>IDC090130 <160>60
<170>PatentIn version 3.2 <210>1 <211>19 <212>DNA <213>人工序列 <400>1
gcaatagggt tgaggatta 19 <210>2 <211>19 <212>DNA <213>人工序列 <400>2
ggaacaagcc gtagacata 19 <210>3 <211>19 <212>DNA <213>人工序列 <400>3
ggatgatggc aatgagata 19 <210>4 <211>19 <212>DNA <213>人工序列 <400>4
caggaggaga agtgagaaa 19 <210>5 <211>19 <212>DNA <213>人工序列 <400>5
gagtaaggat ggtggacat 19 <210>6
<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>6tggcaaatgt tgtgagaaa 19<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>7ggtacatgtt cgagagtaa 19<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>8gagaagatca tttgagtta 19<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>9tgagaaagat gatgactaa 19<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>10ggaccaaact tatacaata 19<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>11ggatagaact tgatgaaat 19<210>12<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>12
caaagaagga agacggaaa 19
<210>13
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
agtcaaacca catgagaaa 19
<210>14
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
gagaagatcc caaggacaa 19
<210>15
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
tgagataatt gaaggaaga 19 <210>16 <211>19 <212>DNA <213>人工序列 <400>16
gaaaggagtt ggaacaata 19
<210>17
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
ggtgaaagga gttggaaca 19
<210>18
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
gatcaaacgt ggaatcaat 19 <210>19
280 281 282
283
284
285
286 >287 丨288 丨289 丨290 丨291
丨292 丨293 丨294 丨295 丨296 丨297
1298
1299
1300
CN<400>38gaucaaacgu ggaaucaau 19<210>39<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>39gaccaggagu ggaggaaau 19<210>40<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>40gagacaaugc agaggagua 19<210>41<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>41uaauccucaa cccuauugc 19<210>42<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>42uaugucuacg gcuuguucc 19<210>43<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>43uaucucauug ccaucaucc 19<210>44<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>44uuucucacuu cuccuccug 19<210>45
<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>45auguccacca uccuuacuc 19<210>46<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>46uuucucacaa cauuugcca 19<210>47<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>47uuacucucga acauguacc 19<210>48<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>48uaacucaaau gaucuucuc 19<210>49<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>49uuagucauca ucuuucuca 19<210>50<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>50uauuguauaa guuuggucc 19<210>51<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>51
auuucaucaa guucuaucc 19
<210>52
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>52
uuuccgucuu ccuucuuug 19
<210>53
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>53
uuucucaugu gguuugacu 19
<210>54
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>54
uuguccuugg gaucuucuc 19
<210>55
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>55
ucuuccuuca auuaucuca 19
<210>56
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>56
uauuguucca acuccuuuc 19
<210>57
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>57
uguuccaacu ccuuucacc 19 <210>58
CN 10<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>58auugauucca cguuugauc 19<210>59<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>59auuuccucca cuccugguc19<210>60<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>60uacuccucug cauugucuc19<210>61<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>61cactgttcca gcaaatgcg19<210>62<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>62gtggagcagc agcaaagg18<210>63<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>63atgagggaat acaagcagga g 21<210>64<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>64
ccacaaatcc atagcgataa aa 22
<210>65
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>65
gccgaccaaa gtctccca18
<210>66 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <400>66
cgtggtgtcg tcctcaagaa20
<210>67 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <400>67
caggagtgga ggaaatacca a 21 <210>68 <211>19 <212>DNA <213>人工序列 <400>68
gctgaatgct gccataacg19
<210>69
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>69
agccaaaagg gtcatcatct ct 22
<210>70
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>70
ttggccaggg gtgctaag18
[0574 [0575 [0576 [0577 [0578 [0579 [0580 [0581 [0582 [0583 [0584 [0585 [0586 [0587 [0588 [0589 [0590 [0591 [0592 [0593 [0594 [0595 [0596 [0597 [0598 [0599 [0600 [0601 [0602 [0603 [0604 [0605 [0606 [0607 [0608 [0609 [0610 [061权利要求
分离的流感病毒小分子干扰核糖核酸(siRNA)靶序列，其是(1)所述靶序列为流感病毒多聚酶PB1、PB2、PA或者核蛋白NP编码基因上的连续10-30个(优选，15-27个，更优选19-23个)核苷酸；(2)所述靶序列为SEQ ID NO1-SEQ ID NO20中任意一条序列；或(3)所述靶序列与(1)或(2)的siRNA靶序列具有至少70％(例如80、85、90、95、96、97、98、99％)同一性或者在严紧杂交条件下杂交的多核苷酸序列，或其互补序列。
2.包含权利要求1的任一序列的核酸构建体。
3.权利要求1或2中任一个所述的siRNA靶序列在筛选抗流感病毒药物中的应用。
4.小分子干扰核糖核酸(siRNA)，其包括(1)正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段包含权利要求1的序列编码的 RNA序列，其中正义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA，且能抑制流感病毒多聚酶基 因的表达和/或流感病毒的复制和/或感染；或(2)正义RNA片段和反义RNA片段存在于两条不同的RNA链上或者存在于一条RNA链 上，例如在一个单链RNA分子包含正义RNA片段和反义RNA片段。
5.如权利要求4所述的核糖核酸，其中，所述核糖核酸为发夹型单链RNA分子，其中正 义RNA片段和反义RNA片段之间的互补区域形成双链RNA区域。
6.权利要求4或5任一个所述的核糖核酸，其是(1)正义RNA片段和反义RNA片段的长度优选为8-50个核苷酸，优选10-30(更优选 15-27，最优选19-23，如19,20或者21)个；(2)双链RNA的互补区域至少有15个，更优选18个碱基对；(3)正义RNA片段和反义RNA片段的GC含量为35%-75% ；或者(4)正义RNA片段和反义RNA片段与已知人类基因和基因表达片段无显著的同一性。
7.如权利要求4所述的核糖核酸，其中，所述反义RNA片段序列与SEQID NO :1_SEQ ID NO 20所示的任意一条序列有至少10个(优选15个，更优选18个)碱基互补。
8.如权利要求7所述的核糖核酸，其中，所述正义RNA片段与反义RNA片段的3’端包 含至少两个脱氧寡核苷酸的末端，一般为脱氧胸苷酸TT。
9.如权利要求4-8任一个所述的核糖核酸，其中，所述核糖核酸的反义RNA片段序列包 含 SEQ ID NO =21-40,正义 RNA 片段序列包含 SEQ ID NO :41_60。
10.DNA序列的组合，其包括编码正义RNA片段的第一 DNA序列和编码反义RNA片段的 第二 DNA序列，所述正义RNA片段包含权利要求1的序列所编码的RNA序列，其中正义RNA 片段和反义RNA片段能形成双链RNA，且能抑制流感病毒多聚酶基因的表达和/或流感病毒 的复制和/或感染。
11.包含权利要求1、9或10的载体或者载体组合。
12.分离的宿主细胞，优选哺乳动物细胞，特别是A549传代细胞，其中，所述细胞包含 权利要求10的DNA组合。
13.包含权利要求1、9或10的核糖核酸、权利要求12的DNA组合的药物组合物。
14.权利要求1、9或10的核糖核酸、权利要求12的DNA组合用于制备药物的用途，其 中所述药物用于治疗和/或预防流感病毒引起的流行性感冒或其它相关疾病。
15.以上权利要求任一个的主题，其中流感病毒是2009新甲型流感病毒，特别是2009新甲型流感病毒株A/Bei jing/01/2009 (H1N1)。
全文摘要
本发明涉及一组针对2009新甲型流感病毒多聚酶基因的siRNA及其制备方法和应用。选取2009新甲型流感病毒多聚酶(PB2、PB1、PA)基因中高度保守的序列作为siRNA的靶序列，并且以靶序列中的连续10-30(优选，15-27，更优选19-23)bp的序列设计siRNA。细胞实验证明，以2009新甲型流感病毒基因组中高度保守的序列作为靶序列，应用能与靶序列特定位点上的核苷酸序列互补配对的siRNA，可以阻断该基因的复制与表达，从而有效地抑制2009新甲型流感病毒毒株在细胞和动物模型的复制与感染，以达到治疗流行性感冒的目的。
文档编号C12N5/10GK101880677SQ20091023683
公开日2010年11月10日 申请日期2009年11月6日 优先权日2009年11月6日
发明者吴志强, 杨耀武, 王建伟, 金奇 申请人:中国医学科学院病原生物学研究所