专利名称：一种提高木糖醇得率的发酵方法
技术领域：
本发明涉及发酵技术，具体涉及一种提高木糖醇得率的发酵方法。
背景技术：
木糖醇是一种重要的功能性多元糖醇，木糖醇在体内代谢不需要胰岛素的参与， 食用后不会提高血糖值，可用于糖尿病食品中。木糖醇在口腔中不会被微生物利用，可防止 龋齿发生。木糖醇还可作为非肠道营养的能量来源等。正是因为木糖醇具有上述功能特性， 已被广泛应用于食品和医药等工业。 木糖醇的生产方法有提取、化学合成、生物合成三种方法。木糖催化加氢法是目 前工业生产木糖醇的主要方法，但这一生产工艺需要单独制氢，并要在高温高压下反应，工 艺复杂、安全性差。由于反应无专一性，必须以价格较高的纯木糖为原料，否则产品中会有 多种杂醇不易分离而影响质量，成本较高。 生物合成法是利用微生物来生产木糖醇，可有效地降低木糖醇的生产成本。发酵 法不仅有可能省去木糖纯化步骤，还可以简化木糖醇的分离步骤，是一种很有前途的生产 方法。酶法合成木糖醇，则是通过木糖还原酶辅酶因子的代谢平衡来实现连续高效生产，该 方法还没有实现工业化生产。 自然界的微生物中，酵母比较容易将木糖转化生成木糖醇。其中，产木糖醇性能 优越的酵母菌株主要集中于假丝酵母属(Candida)，如季乐蒙地假丝酵母(C. guillier mondii)、热带假丝酵母(C. tropicalis)、莫基假丝酵母(C. mogii)、平滑假丝酵母 (C.parasilosis)等等。工业化生产主要使用热带假丝酵母。酵母对D-木糖的转化途径首 先是木糖还原酶以NADra或NADH为辅酶(主要是NADPH);将D-木糖还原为木糖醇，木糖 醇既可以作为主要产物进入培养基内，也可以被以NAD+为辅酶的木糖醇脱氢酶催化氧化成 D-木酮糖，最后进入磷酸戊糖代谢途径。酵母代谢木糖时会经过D-木酮糖途径，消耗一部 分已经生成的木糖醇，所以木糖醇转化率一般只能达到理论值的65% 90%。但在实际工 业化生产过程中，木糖_木糖醇转化率只有50 % 70 % 。酵母中的木糖还原酶的活性受到 温度、pH、NADra浓度和离子浓度的影响，而该酶的活性直接影响到木糖_木糖醇的转化率。
如何提高工业化生产中木糖-木糖醇转化率，一直是本领域亟待解决的问题。目 前为止，还没有有关能够有效提高工业生产中木糖醇得率的发酵方法。
发明内容
本发明针对上述不足提供一种提高木糖醇发酵得率的方法。 本发明通过分离纯化热带假丝酵母的木糖还原酶，研究该酶特性时发现锌离子 是该酶的激活剂，保持适当的Zn2+浓度可使木糖还原酶维持在最高活力水平，在此条件下 可获得最高的木糖_木糖醇转化率。 进而，本发明提供一种提高木糖醇发酵得率的方法，该方法是在发酵培养基中添 加适量的Zn"。研究发现，在发酵培养基中，Zn"浓度控制在一定范围内可以显著增加木糖
3醇的发酵得率，优选Zn2+浓度为0. 3 0. 6mmol/L，更优选0. 5mmol/L。
目前生产木糖醇的原料来源于玉米芯。以玉米芯为原料，用酸水解，经中和、蒸发、 脱色、离子交换、加氢、浓縮、结晶并将母液进行再处理可生产出木糖醇。在上述离子交换步 骤中，强酸性阳离子树脂和强碱多孔阴离子树脂配套使用，可使糖液呈无色透明状，纯度达 95% 97% 。但在木糖分离纯化过程中，由于使用强阴阳离子交换层析，水解液中的离子将 被吸附而除去。 一般发酵培养基中的Zn2+主要来源于酵母粉或酵母膏，但为了提高发酵法 生产木糖醇的竞争力，会最大程度降低有机氮源的使用来降低培养基的成本。目前通常培 养基中使用的有机氮源主要是酵母粉，其浓度为10g/L发酵液，此时培养基中Zn2+的浓度在 8 1 lmg/L (0. 12 0. 17mmol/L)，远远低于最适Zn2+浓度32. 5mg/L (0. 5mmol/L)。因此，在 发酵培养基另添加Zn2+至32. 5mg/L，从而提高木糖还原酶的活力，以此达到提高木糖_木 糖醇转化率的目的。 本发明利用Zn2+作为木糖还原酶的激活剂的特性，在发酵培养基中添加Zn2+至最 适的浓度32. 5mg/L。在没有增加发酵法工艺生产成本的基础上，使用木糖_木糖醇的转化 率从68%提高到79%。本发明简单实用，降低了发酵法生产木糖醇的生产成本。
图1显示的是经纯化的木糖还原酶的SDS-PAGE电泳图，其中，泳道1为纯化后的
木糖还原酶，泳道2为标准蛋白分子量。 图2显示的是Zn2+浓度对木糖还原酶活性的影响。 图3显示的是Zn2+浓度对木糖_木糖醇转化率的影响。
具体实施例方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明中涉及到的百分号"％"，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分 比，除另有规定外，是指溶液100ml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在2(TC时 容量的比例。 实施例l菌株发酵 将热带假丝酵母(Candida tropicalis ACCC 20148，购于中国农业微生物菌种保 藏管理中心)接种于YPD(Y :yeast extract,P :p印tone，D :glucose)平板培养基上30。C培 养活化，然后用无菌牙签转接单菌落于100mL的液体培养基中生长，再按照2%的接种量接 种于1000mL以3%木糖为唯一碳源的液体培养基中发酵。发酵条件为3(TC，200rpm，24h。
实施例2木糖还原酶的纯化及酶活测定 1.纯化将实施例1中发酵完毕的发酵液低温离心并收集菌体，超声波破碎后取 上清，将上清pH调到7. 0。 2.在4t:条件下添加40%饱和度硫酸铵，静置4 6h，低温离 心去除杂蛋白，然后再添加硫酸铵使溶液的饱和度为80 % ， 4t:静置20h，离心收集沉淀，沉 淀部分溶于少量20mmol/L pH7. 0的Tris-HCl缓冲液中，并用Tris-HCl缓冲液充分透析。3.低温离心取上清。4.将步骤3中浓縮的酶液上样到DEAE-S印harose柱层析中，在充分 洗去杂蛋白后洗脱，流速为1. OmL/min，洗脱液为20mmol/L pH7. 0的Tris-HCl，活性部分被 含O. 5丽aCl的洗脱液洗脱下来，收集蛋白峰。5.用10KDa的预超滤膜及Amicon超滤杯 借助N2压(压力为0. 4Mpa)对收集的活性部分进行超滤浓縮、除盐获得纯化产物，并进行 SDS-PAGE电泳鉴定(图1)。 2.酶活力测定用分光光度计在340nm波长处检测还原型辅酶NADH特异吸收值 的降低速率，间接检测酶活力大小。具体参数为木糖还原酶液50iiL， NADH 0. 15mmol/L， 木糖0. lmol/L，缓冲液为PBS(O. 05mol/L，pH7. 0)，反应温度为30°C，总体积为2. 5mL。酶活 力单位定义为每分钟消耗lymol NADH所需的酶量为l个酶活单位。蛋白测定方法采用考 马斯亮蓝G-250法。经测定纯化后的木糖还原酶的比活力达12U/mg。
实施例3 Zn"浓度对木糖还原酶活性的影响 分别取50 ii L的纯化酶液，加入到300 y L pH7. 0的20mMTris-HCl缓冲液充分混 匀，再加入100iiL的木糖溶液作为底物，并使反应体系的Z^+终浓度分别达到0. 1、0.2、 0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7mmol/L，酶促反应的终体积为500ii L。然后分别测定木糖还原酶的酶 活。结果，当Zn2+浓度为0.5mmol/L时，木糖还原酶的活性相对活性最高(图2)。
实施例4 Zn2+浓度对木糖-木糖醇转化率的影响 1.培养基中Zn"浓度测定分别选取10g不同厂家的酵母膏，配置1L溶液，用 HI93731锌浓度测定仪检测其中Zn"浓度，经检测，其Zn"浓度在8 11mg/L之间。
2.种子培养10g/L木糖、5g/L酵母膏、0. 2g/L MgS04 7H20、2. 5g/L KH2P04 ;装液 量为50mL/250mL，培养基pH值自然，接入斜面种子，30°C ， 180rpm摇床上培养20h。
3.发酵木糖产木糖醇按2%的接种量将液体种子接入两组发酵瓶中。培养基组 份为(g/U木糖100、酵母膏10. 0、NaCl 6. 0、MgS04 7H20 0. 4、KH2P043、 (NH4)2HP04，装液量 为120mL/250mL，培养基pH值自然。向其中一组中添加Zn2+，使其达到32. 5mg/L，而另一组 不添加Zn2+，两组均于30°C ， 200rpm， 250mL摇瓶培养50h后终止。 4.木糖醇含量的测定将上述发酵液匀浆破碎细胞，离心去沉淀，取20mL上清液 煮沸5min，离心去蛋白，上清液用作色谱检测。色谱柱为SS-100C^+糖柱，柱温6(TC，流动 相为去离子水，流速lmL/min，进样量为3. 0 y L。结果，添加Zn2+为32. 5mg/L时使木糖-木 糖醇的转化率从68%提高到了 79%。(图3)
权利要求
Zn2+在提高木糖醇发酵得率中的应用。
2. —种提高木糖醇发酵得率的方法，其特征在于在发酵培养基中添加适量的Zn2+。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于向培养基中添加Zn2+至终浓度0.3 0.6mmol/L。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于向培养基中添加Zn2+至终浓度0. 5mmol/L。
5. 如权利要求2 4任一项所述的方法，其特征在于发酵菌为热带假丝酵母。
全文摘要
本发明提供了一种提高木糖醇得率的发酵方法。该方法是在发酵培养基中添加适量的Zn2+，利用Zn2+对木糖还原酶有激活作用的特性，从而提高木糖-木糖醇的转化率，提高木糖醇发酵得率。实验表明，通过本发明方法，使木糖-木糖醇的转化率在没有增加生产成本的基础上从68％提高到79％。本发明简单实用，降低了目前使用的发酵法生产木糖醇工艺的生产成本。
文档编号C12R1/74GK101792781SQ20091025921
公开日2010年8月4日 申请日期2009年12月16日 优先权日2009年12月16日
发明者尚海涛, 徐斌, 李荣杰, 段绪果, 胡长浩, 薛亮, 薛培俭 申请人:安徽丰原发酵技术工程研究有限公司